1 Eine Blattzelle ist in mehrere metabolische Kompartimente unterteilt 3
1.1 Die Zellwand verleiht der Pflanzenzelle mechanische Stabilität 6
1.2 Vakuolen haben vielfältige Funktionen 11
1.3 Plastiden stammen von Cyanobakterien ab 13
1.4 Auch Mitochondrien sind durch Endosymbiose entstanden 17
1.5 In den Peroxisomen laufen besondere Stoffwechselwege ab 19
1.6 Endoplasmatisches Reticulum und Golgi-Apparat bilden ein Netzwerk zur Verteilung von Biosyntheseprodukten 20
1.7 Aus Pflanzenzellen lassen sich funktionell intakte Zellorganellen gewinnen 23
1.8 Unterschiedliche Transportmechanismen vermitteln einen Stoffaustausch zwischen verschiedenen
      Stoffwechselräumen 26


2 Die Nutzung der Energie des Sonnenlichtes durch die Photosynthese ist die Grund-
   lage für das Leben auf der Erde 43

2.1 Wie hat es mit der Photosynthese angefangen? 44
2.2 Die Energie des Sonnenlichtes wird durch Farbstoffe eingefangen 45
2.3 Die Absorption von Licht führt zur Anregung eines Chlorophyllmoleküls
2.4 Für das Einfängen von Licht ist eine Antenne erforderlich 54

3 Die Photosynthese ist ein Elektronentransportprozess 65
3.1 Photosyntheseapparate sind aus Modulen aufgebaut 65
3.2 Bei der Photosynthese entstehen ein Reduktionsmittel und ein Oxidationsmittel 68
3.3 Das Konstruktionsprinzip eines photosynthetischen Reaktionszentrums wurde durch Röntgenstrukturanalyse
      an Purpurbakterien auf geklärt 7

3.4 Wie funktioniert das Reaktionszentrum? 75
3.5 Durch Photosystem II wird Wasser gespalten 81
3.6 Der Cytochrom-b6/f-Komplex vermittelt den Elektronentransport
3.7 Photosystem I reduziert NADP+ 96
3.8 Regulationsvorgänge sorgen dafür, dass die eingefangenen Photonen zwischen den beiden Photosystemen verteilt
      werden 104


4 Bei der Photosynthese wird ATP erzeugt 111
4.1 Ein Protonengradient dient als energiereicher Zwischenzustand bei der ATP-Synthese 111
4.2 Entkoppler bewirken die Dissipation des elektrochemischen Protonengradienten in Wärme 114
4.3 H+-ATP-Synthasen in Bakterien, Chloroplasten und Mitochondrien besitzen eine einheitliche Grundstruktur 117
4.4 Die Synthese des ATP wird durch eine Konformationsänderung des Proteins bewirkt 122

5 Mitochondrien sind die Kraftwerke der Zellen 129
5.1 Vor der biologischen Oxidation werden die Substrate in gebundenen Wasserstoff und Kohlendioxid zerlegt 129
5.2 Zellatmung findet in den Mitochondrien statt 130
5.3 Die Substrate für die biologische Oxidation werden im Matrixraum fragmentiert 132
5.4 Wieviel Energie wird bei der Oxidation von NADH umgesetzt? 138
5.5 Die mitochondriale Atmungskette besitzt Gemeinsamkeiten mit der Elektronentransportkette der Photosynthese 140
5.6 Der Elektronentransport der Atmungskette ist über einen Protonentransport mit der ATP-Synthese gekoppelt 145
5.7 Mitochondrien aus Pflanzen haben spezielle Stoffwechselfunktionen 150
5.8 Die Kompartimentierung des mitochondrialen Stoffwechsels erfordert spezifische Membran-Translokatoren 153

6 Der Calvin-Cyclus ist Reaktionsweg für die photosynthetische CO2-Assimilation 157
6.1 Die CO2-Assimilation erfolgt durch die Dunkelreaktion der Photosynthese 157
6.2 Ribulosebisphosphat-Carboxylase katalysiert die Fixierung von CO2 159
6.3 Die Reduktion von 3-Phosphoglycerat führt zu Triosephosphat 165
6.4 Aus Triosephosphat wird Ribulosebisphosphat regeneriert 167
6.5 Neben dem reduktiven Pentosephosphatweg gibt es auch einen oxidativen Pentosephosphatweg 174

7 Über den Photorespirationsweg wird das durch die Oxygenaseaktivität der
    RubisCO gebildete Phosphoglycolat recycelt 185

7.1 Durch das Recycling von 2-Phosphoglycolat wird Ribulose-1 ,5-bisphosphat zurückgewonnen 185.
7.2 Das im Photorespirationsweg freigesetzte Ammonium-Ion wird mit hoher Effizienz refixiert 191
7.3 Für die Reduktion des Hydroxypyruvats müssen Peroxisomen von außen mit Reduktionsäquivalenten versorgt werden
       193

7.4 Die peroxisomale Matrix ist ein spezielles Kompartiment für die Entsorgung toxischer Produkte 197
7.5 Wie hoch sind die Kosten der Ribulosebisphosphat-OxygenaseReaktion für die Pflanze? 198
7.6 Am Kompensationspunkt findet keine Netto-CO2-Fixierung statt 199
7.7 Der energieverbrauchende Photorespirationsweg kann für die Pflanze auch nützlich sein
       200

8 Photosynthese ist mit Wasserverbrauch verbunden 203
8.1 Bei der Aufnahme von CO2 in das Blatt geht Wasser aus dem Blatt 203
8.2 Diffusion von CO2 in eine Pflanzenzelle 209
8.3 C4-Pflanzen benötigen bei der CO2-Assimilierung weniger Wasser 211
8.4 Durch den Crassulaceensäure-Stoffwechsel können viele Pflanzen auch noch bei sehr großem Wassermangel überleben        224
9 Polysaccharide sind Speicher- und Transportform der bei der Photosynthese
    gebildeten Kohlenhydrate 231

9.1 In Form von Stärke können in der Zelle sehr große Kohlenhydratmengen gespeichert werden 232
9.2 Die Saccharose wird im Cytosol synthetisiert 242
9.3 Die Verwertung des bei der Photosynthese gebildeten Triosephosphats muss strikt reguliert werden 243
9.4 In manchen Pflanzen erfolgt der Export der Assimilate aus den Blättern in Form von Zuckeralkoholen oder von
     Oligosacchariden der Raffinosefamilie 250
9.5 Fructane werden als Speichersubstanz in der Vakuole gelagert 251
9.6 Cellulose wird durch Enzyme der Plasmamembran synthetisiert 256
10 Die Assimilation von Nitrat wird zur Synthese von organischem Material benötigt
     261

10.1 Die Reduktion des Nitrat zu NH3 erfolgt in zwei Teilreaktionen 261
10.2 Die Nitratassimilation unterliegt einer strengen Kontrolle 270
10.3 Endprodukt der Nitratassimilation ist die ganze Palette der Aminosäuren 273
10.4 Glutamat ist Ausgangssubstanz für die Synthese von Chlorophyllen und Cytochromen 287
11 Durch N2 Fixierung kann der Luftstickstoff für das Pflanzenwachstum genutzt
      werden 293

11.1 Leguminosen bilden eine Symbiose mit Knöllchenbakterien 294
11.2 Die N2-Fixierung kann nur bei sehr niedrigen Sauerstoffkonzentrationen erfolgen 301
11.3 Die Energiekosten für die Nutzung des N2 als Stickstoff quelle sind höher als bei der Nutzung von NO3- 304
11.4 Pflanzen verbessern ihre Nährstoff-Versorgung durch die Symbiose mit Pilzen 304
12 Die Assimilation von Sulfat ermöglicht die Synthese schwefelhaltiger
     Verbindungen 309

12.l Sulfatassimilation erfolgt durch Photosynthese 309
12.2 Glutathion dient der Zelle als Antioxidans und zur Entgiftung von Schadstoffen 314
12.3 Aus Cystein wird Methionin synthetisiert 318
12.4 Im Überschuss ist Schwefeldioxid für Pflanzen ein Schadstoff 319
13 Durch den Phloemtransport erreichen die Photoassimilate ihre Verbrauchsorte 323
13.l Es gibt zwei Wege der Phloembeladung 324
13.2 Der Phloemtransport erfolgt durch einen Massenstrom 327
13.3 Durch Phloementladung werden Sink-Gewebe versorgt 328
13.4 Der Glykolyseweg hat eine zentrale Funktion bei der Verwertung der Kohlenhydrate 330
14 Produkte der Nitratassimilation werden in der Pflanze in Form von Proteinen
      gespeichert 335

14.1 Globuline sind die am weitesten verbreiteten Speicherproteine 336
14.2 Prolamine werden als Speicherproteine in Gräsern gebildet 337
14.3 2S-Proteine kommen in Samen dikotyler Pflanzen vor 337
14.4 Proteine schützen den Samen davor, von Tieren gefressen zu werden 338
14.5 Die Proteinsynthese der Speicherproteine erfolgt am rauhen endoplasmatischen Reticulum 338
14.6 Proteinasen mobilisieren die in den Speicherproteinen deponierten A.minosäuren 341
15 Lipide wirken als Membranbausteine und als Kohlenstoffspeicher 343
15.1 Polare Lipide sind wichtige Membranbausteine 343
        Die Fluidität der Membran wird durch den Anteil ungesättigter Fettsäuren und den Gehalt an Sterolen geprägt 346
        Membranlipide enthalten eine Vielfalt hydrophiler Kopfgruppen 347
        Sphingolipide sind wichtige Bausteine der Plasmamembranen 349

15.2 Triacylglycerine sind Reservesubstanzen 351
15.3 Die Neusynthese von Fettsäuren erfolgt in Plastiden 352
        Ausgangsprodukt für die Synthese der Fettsäuren ist Acetyl-CoA 352
        Die Acetyl-CoA-Carboxylase ist das Startenzym der Fettsäuresynthese 355
        Weitere Schritte der Fettsäuresynthese erfolgen ebenfalls an einem Multienzymkomplex 357
        In der neugebildeten Fettsäure wird die erste Doppelbindung durch eine lösliche Desaturase eingefügt 358
        Das in den Plastiden als Produkt der Fettsäuresynthese gebildete Acyl-ACP hat zwei Verwendungszwecke 361
15.4 Glycerin-3-phosphat ist Ausgangssubstrat für die Synthese von Glycerolipiden 362
        An der ER-Membran werden Fettsäuren verlängert und in der ER-Membran desaturiert 363
        Ein Teil der plastidären Membranlipide wird über den eukaryontischen Weg gebildet 365
15.5 Triacylglycerine werden in den Membranen des endoplasmatischen Reticulums gebildet 367
        Pflanzliche Fette werden nicht nur als Nahrungsmittel, sondern auch als Rohstoffe für die Industrie genutzt 367
        Durch molecular engineering werden Pflanzenfette maßgeschneidert 369
15.6 Die Mobilisierung des Kohlenstoffs aus den Speicherlipiden während der Samenkeimung erfolgt in den Glyoxysomen
        371
        Über den Glyoxylatcyclus können Pflanzen aus Acetyl-CoA Hexosen synthetisieren 372
        Reaktionen mit toxischen Zwischenprodukten laufen in den Peroxisomen ab 374

15.7 Lipoxygenasen sind an der Synthese von Aroma-, Abwehr- und Signalstoffen beteiligt sowie auch an der
        Mobilisierung von Speicherlipiden 376

16 Spezialmetabolite erfüllen in Pflanzen spezielle ökologische Funktionen 383
16.1 Spezialmetabolite dienen oft dem Schutz gegen pathogene Mikroorganismen und Herbivoren 383
        Mikroben als Krankheitserreger 384
        Phytoalexine werden von der Pflanze als Antwort auf eine Mikrobeninfektion gebildet 384
        Pflanzliche Abwehrstoffe können auch für den Menschen ein Risiko darstellen 385

16.2 Die Stoffklasse der Alkaloide umfasst eine Vielfalt heterocyclischer Spezialmetabolite 386
16.3 Pflanzen setzen Blausäure frei, wenn sie von Tieren verletzt werden 389
16.4 Einige Pflanzen setzen bei Verletzung flüchtige Senföle frei 390
16.5 Pflanzen schützen sich vor Herbivoren durch ungewöhnliche Aminosäuren 391
17 Eine große Vielfalt von lsoprenoiden erfüllt sehr unterschiedliche Funktionen im       Pflanzenstoffwechsel 393
17.1 Für die Bildung von Isoprenoiden gibt es in höheren Pflanzen zwei verschiedene Synthesewege 395
        Ausgangssubstanz für die Synthese von Isopentenylpyrophosphat im Cytosol ist Acetyl-CoA 395
        Ausgangssubstanzen für die Synthese von Isopentenylpyrophosphat in den Plastiden sind Pyruvat und
        D-Glycerinaldehyd-3-phosphat 396
        Prenyltransferasen katalysieren die Verknüpfung der Isopreneinheicen 398
        Manche Pflanzen emittieren Isopren in die Luft 400
17.2 Vom Geranylpyrophosphat leiten sich viele Geruchsstoffe ab 401
17.3 Farnesylpyrophosphat ist Ausgangsverbindung für die Bildung von Sesquiterpenen 403
        Aus Farnesylpyrophosphat werden Steroide gebildet 404
17.4 Geranylgeranylpyrophosphat ist Ausgangssubstanz für Abwehrsubstanzen, Phytohormone und Carotinoide 406
        Oleoresine schützen Bäume vor Schädlingsbefall 406
        Die Carotinsynthese liefert Pigmente für die Pflanze und ein wichtiges Vitamin für den Menschen 407
17.5 Viele Substanzen sind aufgrund einer Prenylkette in Membranen löslich 409
        Durch Prenylierung können Proteine in einer Membran verankert werden 409
        Dolichol vermittelt die Glycosylierung von Proteinen 410
17.6 Die Regulation der Isoprenoidsynthese
18 Die Phenylpropanoide umfassen eine Vielfalt pflanzlicher Spezialmetabolite
      und Zellwandbestandteile 415

18.1 Die Phenylalanin-Ammoniak-Lyase und Monooxygenasen sind wichtige Enzyme des Phenylpropanstoffwechsels 416
18.2 Phenylpropane polymerisieren zu Makromolekülen 421
        Lignane wirken als Abwehrsubstanzen 422
        Durch radikalische Polymerisation von Phenylpropanen entsteht Lignin 423
        Suberine bilden eine gas- und wasserundurchlässige Isolierschicht 425
        Cutin ist isolierender Bestandteil der Cuticula 426
18.3 Für die Bildung von Flavonoiden und Stilbenen wird ein zweiter aromatischer Ring aus Acetatresten gebildet 426
        Zu den Stilbenen zählen sehr wirksame natürliche Fungizide 427
        Flavonoide haben in der Pflanze vielfältige Funktionen 427
        Anthocyane sind Blütenfarbstoffe und dienen dem Lichtschutz von Pflanzen 430
18.4 Tannine binden fest an Proteine und haben dadurch Abwehrfunktionen 431
19 Vielfältige Signale koordinieren Wachstum und Entwicklung verschiedener
      Pflanzenorgane und bewirken deren Anpassung an unterschiedliche
      Umweltbedingungen 435

19.1 Signalketten und Netzwerke starten mit Rezeptoren 436
        Kleine G-Proteine haben verschiedene regulative Funktionen 440
        Ca2+ wirkt als Botenstoff bei der Signaltransduktion 440
        Der Phosphoinositolweg steuert die Öffnung von Ca2+-Kanälen 441
        Calmodulin vermittelt die Botenstoffwirkung von Ca2+-Ionen 443
        Phosphorylierte Proteine bilden Elemente der Signaltransduktion 444
19.2 Phytohormone umfassen eine Vielfalt unterschiedlicher Substanzen 446
        Auxin stimuliert das Streckungswachstum im Spross 446
        Gibberelline regulieren das Längenwachstum von Stängeln 450
        Cytokinine stimulieren die Zellteilung 453
        Abscisinsäure kontrolliert den Wasserhaushalt der Pflanze 455
        Ethylen lässt Früchte reifen 456
        Jasmonat ist nicht nur ein Duftstoff, sondern auch ein Hormon 459
        Strigolactone sind eine neue Hormongruppe bei Pflanzen 459
        Brassinosteroide sind pflanzliche Steroidhormone und kontrollieren das Zellwachstum 460
19.3 Peptide beeinflussen das Wachstum von Pflanzen 462
        Systemin löst die Verteidigung gegen den Fraß von Herbivoren aus 462
        Phytosulfokine regulieren die Zellproliferation 463
        Alkalisierung des Zellkulturmediums wird durch ein kleines Protein hervorgerufen 463
        Kleine Cystein-reiche-Proteine regulieren die Selbstinkompatibilität 464
19.4 Abwehrreaktionen werden durch das Zusammenspiel vieler Signalsubstanzen ausgelöst 464
19.5 Lichtsensoren steuern die Entwicklung von Pflanzen 467
        Phytochrome sind Rotlichtsensoren 467
        Cryptochrome und Phototropin sind Blaulicht-Sensoren 471

20 Eine Pflanzenzelle besitzt drei verschiedene Genome 477
20.1 Im Kern sind die Gene auf mehrere Chromosomen verteilt 478
        Von einer dikotylen und einer monokotylen Pflanze ist die DNA-Sequenz des Kerngenoms bekannt 481
20.2 Die DNA des Kerngenoms wird durch drei spezialisierte RNA-Polymerasen transkribiert 481
        Die Transkription von Strukturgenen ist reguliert 482
        Einem Gen sind Nukleotidsequenzen mit Promotor- und Regulatorfunktion vorgeschaltet 482
        Transkriptionsfaktoren regulieren die Ablesung eines Gens 483
        Kleine (sm) RNAs hemmen die Genexpression durch Inaktivienmg von mRNAs 485
        Die Transkription von Strukturgenen erfordert einen komplexen Transkriptionsapparat 485
        Für die Bildung der reifen Messenger-RNA ist eine Prozessierung erforderlich 487
        rRNA wird durch RNA-Polymerase 1 und III synthetisiert 490
20.3 Der DNA-Polymorphismus liefert genetische Marker für die Pflanzenzüchtung 491
        Durch Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus lassen sich Individuen der gleichen Art unterscheiden 491
        Die RAPD-Technik ist eine besonders einfache Methode zur Untersuchung des DNA-Polymorphismus 494
        Der Polymorphismus der Mikrosatelliten-DNA wird als genetischer Marker verwendet 496
20.4 Springende Gene vagabundieren durch das Genom 497
20.5 Die meisten Pflanzenzellen enthalten Viren 498
        Retrotransposons sind degenerierte Retroviren 501
20.6 Plastiden besitzen ein zirkuläres Genom 502
        Der Transkriptionsapparat der Plastiden besitzt Ähnlichkeiten mit dem der Bakterien 505
20.7 Das mitochondriale Genom von Pflanzen variiert stark in seiner Größe 505
        Die mitochondriale DNA enthält fehlerhafte Informationen, die nach der Transkription korrigiert werden 509
        Eine durch Mitochondrien verursachte männliche Sterilität bei Pflanzen ist ein wichtiges Hilfsmittel bei der        Hybridzüchtung 510

21 Synthese, Prozessierung und Abbau von Proteinen in Pflanzen 517
21.1 Die Proteinsynthese erfolgt durch Ribosomen 518
        Eine Peptidkette wird geknüpft 519
        Durch den Einsatz spezifischer Hemmstoffe der Translation lässt sich entscheiden, ob ein Protein entweder im Kern        oder im Genom der Plastiden oder Mitochondrien codiert wird 523
        Die Translation wird reguliert 524
21.2 Proteine erreichen durch eine kontrollierte Faltung ihre dreidimensionale Struktur 525
        Die Faltung der Proteine erfolgt in einem mehrstufigen Prozess 525
        Proteine werden während der Faltung beschützt 525
        Hitzeschockproteine schützen vor Hitzeeinwirkung 526
        Chaperone binden ungefaltete Proteine 527
21.3 Kerncodierte Proteine werden auf verschiedene Zellkompartimente verteilt 529
        Die meisten in die Mitochondrien importierten Proteine müssen zwei Membranen passieren 531
        Der Import von Proteinen in Chloroplasten erfordert mehrere Translokationsapparate 533
        In die Peroxisomen werden zumeist bereits gefaltete Proteine importiert 536
21.4 Proteine werden in streng kontrollierter Weise durch Proteasomen abgebaut 537
22 Durch Gentechnik können Pflanzen den Bedürfnissen von Landwirtschaft,
      Ernährung und Industrie angepasst werden 541

22.1 Ein Gen wird isoliert 541
        Zur Isolierung von Genen wird eine Genbibliothek benötigt 542
        Eine Genbibliothek kann in Phagen aufbewahrt werden 543
        Auch Plasmide eignen sich für die Aufbewahrung einer Genbibliothek 545
        Die Genbibliothek wird nach einem Gen durchsucht 546
        Ein Klon wird durch Antikörper identifiziert 547
        Ein Klon wird durch DNA-Sonden identifiziert 548
        Durch Komplementierung lassen sich Gene für bislang unbekannte Proteine isolieren 549
        Gene können mithilfe von Transposons oder T-DNA aufgespürt werden 551
22.2 Agrobakterien können Pflanzenzellen transformieren 551
        Das Ti-Plasmid enthält die genetische Information für die Tumorbildung 553
        Ti-Plasmide werden als Transformationsvektoren benutzt 555
        Durch die Transformation einer Zelle aus einem Blatt wird eine neue Pflanze erzeugt 558
        Pflanzen können durch ein abgewandeltes Sehrotgewehr transformiert werden 560
        Protoplasten können durch die Aufnahme von DNA transformiert werden 560
        Die Plastidentransformation als Methode zur gentechnischen Veränderung von Pflanzen bietet Vorteile für die Umwelt
        562
22.3 Die Auswahl von Promotoren erlaubt eine gezielte Expression eines eingeschleusten Gens 564
        Durch Adressierungssequenzen werden Genprodukte in ein bestimmtes subzelluläres Kompartiment dirigiert 565
22.4 Durch Antisense und RNAi Technik können Gene ausgeschaltet werden 565
22.5 Für die pflanzliche Gentechnik bestehen vielfältige Anwendungsmöglichkeiten 567
        Durch das Bt-Protein werden Pflanzen gegen Insektenfraß geschützt 568
        Durch Gentechnik können Pflanzen vor Viren geschützt werden 570
        Die Erzeugung pilzresistenter Pflanzen ist noch in der Anfangsphase 570
        Durch die Herstellung herbizidresistenter Pflanzen können Totalherbizide als selektive Herbizide eingesetzt werden
        571
        Einsatz der Gentechnik zur Verbesserung des Ertrages oder der Qualität von Ernteprodukten 572

1 Eine Blattzelle ist in mehrere metabolische Kompartimente unterteilt

In höheren Pflanzen erfolgt die Photosynthese hauptsächlich im Mesophyll, dem chloroplastenreichen Gewebe der Blätter. Abbildung 1.1 zeigt das elektronenmikroskopische Bild von Mesophyllgewebe und Abbildung 1.2 eine schematische Darstellung des Aufbaus einer Mesophyllzelle. Diese Zelle ist von einer Plasmamembran umgeben, die auch als Plasmalemma bezeichnet wird, und außerdem von einer Zellwand. Im Innern enthält die Zelle verschiedene charakteristisch geformte Organellen, durch welche die Zelle in verschiedene Räume (subzelluläre Kompartimente) unterteilt wird, wobei jeder dieser Räume für bestimmte Funktionen des Stoffwechsels spezialisiert ist. Tabelle 1.1 zeigt einen Überblick über die jeweiligen Funktionen, welche in den nachfolgenden Kapiteln ausführlich besprochen werden. Die größte Organelle ist die Vakuole, die etwa 80 % des gesamten Zellvolumens einnehmen kann. Das nächst größte Kompartiment bilden die Chloroplasten. Der Rest der Zelle verteilt sich auf die Mitochondrien, Peroxisomen, den Zellkern, das endoplasmatische Reticulum, den Golgi-Apparat und das Zellplasma außerhalb dieser Organellen, das Cytosol. In Samen und einigen anderen Geweben (z.B. den Wurzelknöllchen) kommen noch die aus dem endoplasmatischen Reticulum hervorgegangenen Ölkörper hinzu. Dabei handelt es sich um Speicherorganellen für Triglyceride (s. Abschn. 1.6).

Der Zellkern wird durch die Kernhülle begrenzt. Diese besteht aus den beiden Membranen des endoplasmatischen Reticulums. Der Raum zwischen den beiden Membranen ist der perinukleare Raum. Die Kernhülle wird durch Kernporen mit einem Durchmesser von etwa 50nm unterbrochen. Im Kern befindet sich das Chromatin, das aus DNA-Doppelsträngen besteht, die durch Bindung an basische Proteine (Histone) stabilisiert sind. Die Gesamtzahl der Gene bildet das Kerngenom. Die durch die Transkription der DNA im Zellkern gebildete messenger-RNA gelangt durch die Kernporen zu den Ribosomen im Cytosol der Zelle, den Apparat der Proteinbiosynthese. Je nach Bestimmungsort werden die gebildeten Proteine auf die verschiedenen Zellkompartimente verteilt.
Im Innern enthält die Zelle ein dreidimensionales Netzwerk von Faserproteinen, welches als Cytoskelett bezeichnet wird. Wichtige Elemente des Cytoskeletts sind die Mikrotubuli und die Mikroftlamente. In beiden Fällen handelt es sich um Makromoleküle, die durch die Aggregation löslicher (globulärer) Proteine gebildet werden. Mikrotubuli sind röhrenförmige Strukturen, zusammengesetzt aus α- und β-Tubulin-Monomeren. Die Mikrotubuli sind mit einer Vielzahl unterschiedlicher Motorproteine verbunden, die unter ATP-Verbrauch an ihnen gebundene Organellen entlang der Mikrotubuli transportieren. Mikrofilamente sind Ketten aus polymerisiertem Actin, welche zur Auslösung von Bewegungen mit Myosin zusammenwirken. Actin und Myosin sind auch Bestandteile des Muskels von Tieren. Das Cytoskelett hat viele wichtige Funktionen beim Zellgeschehen. So bewirkt es die räumliche Organisation der Organellen innerhalb der Zelle, sorgt für thermische Stabilität und spielt eine wichtige Rolle bei der Zellteilung. Wie in Abschnitt 1.1 besprochen, hat das Cytoskelett auch eine Funktion bei der Zell-Zell-Kommunikation.

1.1 Die Zellwand verleiht der Pflanzenzelle mechanische Stabilität
Pflanzenzellen unterscheiden sich von tierischen Zellen dadurch, dass sie eine Zellwand besitzen. Die Zellwand verhindert, dass eine Pflanzenzelle über das durch die Wand vorgegebene Volumen anschwellen kann. Das durch Osmose aufgenommene Wasser drückt die Plasmamembran an die Innenseite der Zellwand, die so der Zelle mechanische Stabilität verleiht. Darüber hinaus bieten Zellwände Schutz gegen Infektionen. Die Zellwände sind äußerst komplexe Gebilde; an ihrer Synthese sind in Arabidopsis etwa 1000 Gene beteiligt.

Die Zellwand besteht hauptsächlich aus Kohlenhydraten und Proteinen
Die Zellwand einer höheren Pflanze besteht zu etwa 90 % aus Kohlenhydraten und zu 10 % aus Proteinen. Der hauptsächliche Kohlenhydrat bestand teil ist . Cellulose ist ein unverzweigtes Polymer aus D-Glucosemolekülen, die durch glycosidische ß-1,4-Bindung miteinander verknüpft sind (Abb. 1.3 A). Jede Glucoseeinheit ist gegenüber der nächsten um 180° verdreht. Dies ermöglicht die Ausbildung sehr langer gerader Ketten mit einer Kettenlänge von 2000 bis 25 000 Glucoseresten. Durch Wasserstoffbrücken lagern sich etwa 36 Celluloseketten in einer kristallinen Gitterstruktur zu einer Mikrofibrille zusammen. Diese kristallinen Bereiche sind wasserundurchlässig. Die Mikrofibrillen haben eine ungewöhnlich hohe Reißfestigkeit und sind sehr widerstandsfähig gegen chemische und biologische Angriffe. Sie sind so stabil, dass sie nur sehr schwer durch hydrolytische Enzyme spaltbar sind. Es gibt Bakterien und Pilze, die cellulosespaltende Enzyme (Cellulasen) bilden. Einige Tiere (z.B. Wiederkäuer) enthalten derartige Bakterien in ihrem Verdauungstrakt und können sich dadurch von Gras und Stroh ernähren. Cellulose ist die am häufigsten vorkommende organische Substanz in der Biosphäre. Man schätzt, dass etwa die Hälfte des gesamten organisch gebundenen Kohlenstoffs auf der Erde als Cellulose vorliegt.

Wichtiger Bestandteil der Zellwände sind auch die Hemicellulosen. Sie sind definiert als eine Gruppe von Polysacchariden, die sich durch Alkalilaugen extrahieren lassen. Sie wurden so benannt, weil man angenommen hatte, dass Hemicellulosen die Vorstufen der Cellulose wären, was sich später aber als falsch erwiesen hat. Die Hemicellulosen umfassen eine Vielfalt verzweigter Polysaccharide, die neben D-Glucose unter andern die Hexosen D-Mannose, D-Galactose, D-Fucose und die Pentosen D-Xylose und L-Arabinose enthalten. Als Beispiel wird in (Abb. 1.3 B) Xyloglycan gezeigt. Das Grundgerüst ist eine ß-1,4-Glucankette, an die in a-1,6-Verknüpfung Xylosereste glycosidisch gebunden sind, die zum Teil mit D-Galactose und D-Fucose verknüpft sind. Zudem sind L-Arabinosereste an die 2'-0H-Gruppe der Glucose gebunden.

Ein weiterer Hauptbestandteil der Zellwand ist Pektin, ein Gemisch von Polymerisaten aus Zuckersäuren. Wichtigstes Monomer ist D-Galacturonsäure, die a-1,4-glycosidisch verknüpft ist (Abb. 1.3 C). Ein Teil der Carboxygruppen ist durch Methylgruppen verestert. Die freien Carboxygruppen werden durch Ca2+_ und Mg2+-Ionen zusammengehalten (Abb. 1.4). In Abwesenheit von Mg2+- und Ca2+-Ionen ist Pectin eine lösliche Verbindung. Als natives Ca2+/Mg2+-Salz bildet Pektin ein amorphes, plastisch verformbares und sehr quellungsfähiges Gel. Diese Eigenschaften des Pektins nutzt man bei der Herstellung von Fruchtgelees und Marmeladen. Pectine bilden den Klebstoff, der benachbarte Zellen zusammenhält, wobei die Klebstellen bei einem Zellwachstum auch wieder gelöst werden können.

Die Strukturproteine der Zellwand sind über glycosidische Bindungen mit zum Teil sehr langen und verzweigten Polysaccharidketten verknüpft, sie zählen daher zu der Gruppe der Glycoproteine. Der Kohlenhydratanteil dieser Glycoproteine variiert von 50% bis über 90% . Dazu enthalten Zellwände Wachse (Kapitel 15) sowie Cutin und sowie Suberin (Kapitel 18). Damit die Zelle wachsen kann, muss die sehr rigide Zellwand in sehr kontrollierter Weise gelockert werden. Dies geschieht durch das Protein Expansin, welches in wachsenden Geweben von allen Blütenpflanzen zu finden ist. Seine Wirkung beruht wahrscheinlich auf einem Aufbrechen von Wasserstoffbindungen zwischen Cellulose-Mikrofibrillen und den diese vernetzenden Polysacchariden.
Die Primärwand, das heißt, die während des Zellwachstums anfänglich gebildete Wand, besteht in einer monocotylen Pflanze aus 20 bis 30% Cellulose, 25% Hemicellulose, 30% Pectin und 5 bis 10% Glycoprotein. Die Wand ist durchlässig für Wasser. Das Pectin verleiht der Wand elastische Eigenschaften und bildet zusammen mit den Glycoproteinen und den Hemicellulosen die Matrix für die Einbettung der Cellulosemikrofibrillen. Wenn die Zelle ihre endgültige Größe und Gestalt erreicht hat, wird auf die Primärwand eine weitere Schicht auf gelagert, die Sekundärwand. Diese besteht vorwiegend aus Cellulose. Die Mikrofibrillen sind in einer Schichtungstextur (Abb. 1.5), vergleichbar mit der Struktur von Sperrholz, angeordnet.

Die Einlagerung von Lignin in die Sekundärwand führt zu einer „Verholzung" der Zelle. Danach stirbt die Zelle ab, und die Zellwand besitzt nur noch Stützfunktion, zum Beispiel zur Ausbildung der Stämme und Zweige von Bäumen oder von Stängeln bei krautigen Pflanzen. Wie in Abschnitt 18.3 ausführlich beschrieben wird, entsteht Lignin durch dehydrierende Polymerisation der Phenylpropanderivate Cumarylalkohol, Coniferylalkohol und Sinapylalkohol. Es bildet sich so ein festes, hartes Netzwerk aus. Trockenes Holz besteht aus 30% Lignin, 40% Cellulose und 30% Hemicellulose. Lignin ist nach Cellulose der zweithäufigste Naturstoff auf der Erde.

Plasmodesmen stellen eine Verbindung zwischen benachbarten Zellen her
Die Zellwände zwischen zwei benachbarten Zellen sind normalerweise durch Plasmodesmen unterbrochen. Oft findet man in einer Pflanzenzelle 1000-10000 Plasmodesmen. In ihrer Grundstruktur erlauben sie den Durchtritt von Molekülen von einer Größe bis zu 800-1200 Dalton, sie können aber durch noch zu besprechende Mechanismen so stark aufgeweitet werden, um Moleküle bis zu einer Größe von 40000 Dalton passieren zu lassen. Durch die Plasmodesmen sind Pflanzenzellen in einem Gewebe zu einem großen Stoffwechselkompartiment verbunden, in dem Substrate und Produkte des Stoffwechsels durch einfache Diffusion zwischen den einzelnen Zellen ausgetauscht werden können. Dieses zusammenhängende Zellkompartiment der Pflanzenzellen (Abb. 1.6) wird als Symplast bezeichnet. Ein Gegenstück hierzu ist das zusammenhängende extrazelluläre Kompartiment, der so genannte Apoplast, der durch die Gesamtheit der Zellwände, vorzugsweise an den Verzweigungsstellen (Abb. 1.2) gebildet wird.

Abbildung 1.7 zeigt ein Plasmodesmos in schematischer Darstellung. Die röhrenförmige Öffnung der Zellwand wird durch die Plasmamembran ausgekleidet, welche die benachbaiien Zellen verbindet. Im Innern dieser Röhre befindet sich eine weitere röhrenförmige Membranstruktur, die Teil des endoplasmatischen Retikulums (ER) der benachbarten Zellen ist. Dadurch stellt das ER-System des gesamten Symplasten ein Kontinuum dar. Der manschettenförmige Raum zwischen Plasmamembran und der ER-Membran bildet den Diffusionsweg zwischen dem Cytosol der benachbarten Zellen. In die Plasmamembran und in die ER-Membran sind Proteine eingebettet, die miteinander verbunden sind. Sie bilden so ein Netz, dessen Maschen die Öffnungsweite der Plasmodesmen im Grundzustand für Moleküle bis zu 800-1200 Dalton bestimmen. Für eine Erhöhung der Durchlässigkeit gibt es offenbar zwei verschiedene Mechanismen. Durch einen "gated pathway" werden Plasmodesmen so stark auf geweitet, daß Moleküle von 20000 Dalton unspezifisch hindurch diffundieren können. Sie brauchen dazu keine Erkennungsmerkmale. Über die Regulation des "gated pathway" bestehen noch Unklarheiten. Bei dem sog. "selective trafficking" geschieht die Aufweitung durch Helferproteine, die an Makromoleküle, wie z.B. RNAs, in spezifischer Weise andocken und diese durch die Plasmodesmen geleiten. Man hat dies erstmalig bei Virusbewegungsproteinen (engl. virus movement proteins) beobachtet, welche von Viren codiert werden und Virus-RNA Komplexe bilden, die die Plasmodesmen passieren können und so die Ausbreitung der Viren über den gesamten Symplasten ermöglichen. Es sind eine Fülle derartiger Virusbewegungsproteine identifiziert worden. Dabei nutzen die Viren nur einen in der Pflanze bestehenden Mechanismus aus. Man hat dann auch bei Pflanzen Bewegungsproteine gefunden die RNAs und andere Makromoleküle durch Plasmodesmen schleusen können. Es wird diskutiert, dass auf diese Weise Transkriptionsfaktoren als Signale zwischen den Pflanzenzellen übertragen werden, was für Abwehrreaktionen gegen Pathogenbefall von Bedeutung sein könnte.

Durch cellulose- und pectinspaltende Enzyme, die aus Mikroorganismen gewonnen werden, lässt sich die Zellwand von Pflanzenzellen auflösen. Nach einer Inkubation von Blattstücken mit den genannten Enzymen können auf diese Weise Pflanzenzellen ohne umgebende Zellwand, die so genannten , gewonnen werden. Diese Protoplasten sind allerdings nur in einem isotonischen Medium haltbar, das heißt, einem Medium, dessen Osmolarität der Osmolarität der Zellflüssigkeit entspricht. In reinem Wasser würden die Protoplasten, da sie keine Zellwand besitzen, so stark anschwellen, dass sie platzen. In Zellkultur in geeignetem Medium sind die Protoplasten lebensfähig, sie können eine neue Zellwand bilden, und aus einem Protoplasten kann sich eine vollständige Pflanze regenerieren. Dies gelingt bislang aber nur bei einem Teil der Pflanzen.

1.2 Vakuolen haben vielfältige Funktionen
Die Vakuole wird von einer als Tonoplast bezeichneten Membran umgeben. In verschiedenen Pflanzenzellen sind Anzahl und Größe der Vakuolen sehr unterschiedlich. Junge Zellen enthalten eine größere Anzahl kleinerer Vakuolen, die insgesamt aber nur einen geringeren Teil des Zellvolumens einnehmen. Beim Reifen der Zellen vereinigen sich einzelne Vakuolen zu einer Zentralvakuole (Abb. 1.1, 1.2). Die Größenzunahme der Zelle beruht dann hauptsächlich auf einer Vergrößerung der Vakuole. Bei Zellen in Speicher oder Epidermisgeweben besteht mitunter fast der gesamte Zellraum aus der Vakuole.
Eine wichtige Funktion der Vakuolen besteht in der Aufrechterhaltung des Zellturgors. Hierzu werden in der Vakuole vor allem Salze von anorganischen und organischen Säuren akkumuliert. Die Akkunmlation dieser osmotisch wirksamen Substanzen zieht Wasser in die Vakuole. Dadurch drückt der Tonoplast das Protoplasma der Zelle gegen die umgebende Zellwand. Der Turgor der Pflanze ist für die Festigkeit unverholzter Pflanzenteile verantwortlich. Wenn der Turgor wegen Wassermangels abnimmt, wird die Pflanze welk.
Vakuolen haben eine wichtige Funktion bei der Wiederverwertung defekter oder nicht mehr benötigter Zellbestandteile. Vakuolen enthalten hydrolytische Enzyme zum Abbau von Makromolekülen wie Proteinen, Nokleinsäuren und vielen Polysacchariden. Strukturen wie Mitochondrien können durch Endocytose in die Vakuole aufgenommen und dort verdaut werden. Man spricht dann von lytischen Vakuolen. Die dabei entstandenen Abbauprodukte wie Aminosäuren, Zucker usw. stehen dann der Zelle wieder zur Verfügung. Dieser Vorgang ist besonders bei der Seneszenz (siehe Abschn. 19.5)
wichtig, wenn vor dem Absterben der Blätter deren Zellbestandteile teilweise mobilisiert werden, um z.B. die Entwicklung und das Wachstum von Samen zu unterstützen. Schließlich dienen Vakuolen auch als Abfalldeponie. Mit Ausnahme von gasförmigen Substanzen können Blätter Abfallprodukte oder Fremdstoffe nicht ausscheiden. Diese werden daher in der Vakuole endgelagert (Kapitel 12).
Zudem haben Vakuolen die Funktion eines Speichers. Viele Pflanzen speichern in den Vakuolen eine Reserve an Nitrat und Phosphat. Wie in Abschnitt 8.5 besprochen, findet in einigen Pflanzen im Tag-Nacht-Verlauf eine vorübergehende Speicherung von Apfelsäure in der Vakuole statt. In Speichergeweben werden in Vakuolen Saccharose (siehe Abschn. 13.3), aber auch Speicherproteine (Kapitel 14) gelagert. Manche Pflanzenzellen enthalten verschiedene Typen von Vakuolen, z.B. lytische Vakuolen und Proteinspeichervakuolen, nebeneinander.
Die Speicherfunktion der Vakuolen kann in Zukunft eine große industrielle Bedeutung gewinnen: Forschergruppen weltweit versuchen Pflanzen in natürliche Proteinfabriken zu verwandeln. Ökonomisch bedeutsame Proteine (z.B. Antigene zur Gewinnung von Antiseren, oder direkt Antikörper) werden gentechnisch in Nutzpflanzen eingebracht und dort in großen Mengen akkumuliert. Dabei könnten die Speichervakuolen eines der möglichen intrazellulären Speicher-Kompartimente sein. Die Pflanzen könnten mit herkömmlichen Techniken angebaut und geerntet werden; die Proteine würden anschließend gereinigt. Diese Technik hätte den Vorteil, dass Proteine in sehr großen Mengen, ohne großen technischen Aufwand und sehr kostengünstig produziert werden könnten.

1.3 Plastiden stammen von Cyanobakterien ab
Plastiden sind Zellorganellen, die nur in Pflanzenzellen vorkommen. Sie vermehren sich durch Teilung und werden zumeist mütterlich vererbt. Dies bedeutet, dass alle Plastiden einer Pflanze von den Proplastiden in der mütterlichen Eizelle abstammen. Bei der Zelldifferenzierung erfolgt eine Umwandlung der Proplastiden in grüne Chloroplasten, verschiedenfarbige Chromoplasten oder farblose Leukoplasten. Plastiden besitzen ein eigenes Genom, das in mehrfachen Kopien pro Plastid vorkommt und Komponenten der Maschinerie der Genduplikation, der Genexpression und der Proteinsynthese codiert. Dieser genetische Apparat der Plastiden hat die Eigenschaften eines prokaryontischen Systems, wie es auch in Cyanobakterien vorkommt. Allerdings codiert das plastidäre Genom (Plastom) nur einen kleinen Teil der plastidären Proteine. Die Mehrzahl wird im Kern codiert und nach Synthese im Cytosol in die Plastiden importiert. Es wird in nachfolgenden Abschnitten gezeigt werden, dass ein Teil der Proteine des photosynthetischen Elektronentransports und der damit verbundenen ATP-Synthese in den Chloroplasten codiert wird. Der weitaus größte Teil der plastidären Proteine wird jedoch im Zellkern codiert.
Bereits 1883 postulierte der Botaniker Andreas Schimper, dass Plastiden Abkömmlinge intrazellulärer Symbionten sind. Er hat damit die Grundlage für die Endosymbionten-Hypothese gelegt. Nach dieser Hypothese stammen Plastiden von Cyanobakterien ab. Diese wurden ursprünglich durch Phagocytose in eine Wirtszelle aufgenommen (Abb. 1.8) und lebten mit dieser in Symbiose. Im Lauf der Zeit verloren sie die Fähigkeit zum Eigenleben, indem ein großer Teil der genetischen Information vom Plastidengenom in den Zellkern übertragen wurde. Diese Endosymbionten-Hypothese wurde durch den Vergleich von Proteinsequenzen aus Chloroplasten und von als Vorläufer angesehenen Cyanobakterien inzwischen eindeutig bestätigt, sodass es jetzt gerechtfertigt ist, von einer Endosymbionten-Theorie zu sprechen. Aus vergleichenden DNA-Sequenzanalysen wurde geschlossen, dass alle Chloroplasten des Pflanzenreiches auf ein singuläres symbiotisches Ereignis zurückzuführen sind.

Proplastiden (Abb. 1.9 A) sind sehr kleine Organellen (Durchmesser 1 bis 1,5 μm). Sie sind nichtdifferenzierte Plastide und finden sich in Meristemzellen von Spross und Wurzel. Wie alle anderen Plastiden sind sie von zwei Membrauen umgeben. Für die Existenz der beiden Hüllmembranen gibt die Endosymbionten-Theorie eine Erklärung: Die innere Hüllmembran stammt von der Zellmembran des Protochlorophyten und die äußere Hüllmembran von der Plasmamembran der Wirtszelle.

Chloroplasten (Abb. 1.9 B) entstehen durch Differenzierung der Proplastiden (Abb. 1.10). Bei ergrünenden Blättern verläuft dies über Etioplasten als Zwischenform. Eine ausgewachsene Mesophyllzelle enthält etwa 50-100 Chloroplasten. Per Definition enthalten Chloroplasten Chlorophyll. Sie sind aber nicht immer grün.

In Rot- und Braunalgen wird die grüne Farbe des Chlorophylls durch andere Pigmente maskiert. Die linsenförmigen Chloroplasten richten sich in der Zelle nach dem Licht aus. In höheren Pflanzen beträgt ihre Länge 3 bis 10μm. Die beiden oben genannten Hüllmembranen umgeben das Stroma. Im Innern liegt ein System aus Membranen, die als flache Säckchen angeordnet sind (Abb. 1.11) und 1960 von Wilhelm Menke als Thylakoide (griech. „sackartig") bezeichnet wurden. Die Thykaloide entstehen bei der Chloroplastendifferenzierung aus der inneren Hüllmembran durch Einstülpungen und anschließende Abschnürung. Es wird so eine große Membranfläche erzeugt. Diese ist Träger der in Kapitel 3 besprochenen Komponenten des Photosyntheseapparats. Da die Thylakoide durch röhrenförmige Strukturen miteinander verbunden sind, entsteht ein zusammenhängender Raum. An vielen Stellen sind die Säckchen gestapelt. Diese Stapelungen sind durch das Lichtmikroskop als Körnchen zu erkennen. Man hat sie daher als Grana bezeichnet.

Es gibt demnach in Chloroplasten drei verschiedene Räume, und zwar den Intermembranraum zwischen äußerer und innerer Hüllmembran, den Stromaraum zwischen innerer Hüllmembran und der Thylakoidmembran und das Thylakoidlumen. Während die innere Hüllmembran eine Permeationsschranke für Metabolite und Nukleotide darstellt, für deren Überwindung spezifische Translokatoren (siehe Abschn. 1.9) erforderlich sind, ist die äußere Hüllmembran für Metabolite und Nukleotide (aber nicht für Makromoleküle wie Proteine oder Nukleinsäuren) durchlässig. Diese Durchlässigkeit beruht auf spezifischen Membranproteinen, den so genannten Porinen, die in der äußeren Hüllmembran Poren bilden, die für Substanzen unterhalb einer Molekulargröße von 10000 Dalton durchlässig sind (siehe Abschn. 1.11). Daher bildet die innere Hüllmembran die eigentliche Grenze des chloroplastidären Stoffwechselkompartiments. Das Stroma ist als "Protoplasma" des Plastiden zu betrachten. Im Vergleich dazu ist das Thylakoidlumen als ein Außenraum anzusehen. Er dient der Bildung eines Protonengradienten Kapitel-3.
Chloroplasten enthalten im Stroma Stärkekörner. Die Ablagerung der Stärke in den Chloroplasten dient meist als diurnaler (Tagesrythmus) Speicher. Die tagsüber gebildete Stärke dient als Reserve für die folgende Nacht Kapitel-9. Daher sind die Stärkekörner am Ende des Tages sehr groß und verkleinern sich in der Nacht. In Pflanzen erfolgt die Bildung von Stärke stets in Plastiden. Innerhalb des Stroma findet man häufig Plastoglobuli, die nicht von einer Membran umgeben sind. Sie enthalten unter anderem Lipide und Plastochinon. Besonders viele Plastoglobuli beobachtet man in Plastiden während der Seneszenz. Es handelt sich dabei um Abbauprodukte der Thylakoide. In einer spezifischen Region des Stroma, dem Nukleoid, sind etwa 10-100 identische Genome lokalisiert. Die Ribosomen in den Chloroplasten befinden sich entweder frei im Stroma oder auch gebunden an den Oberflächen der Thylakoidmembranen.
Im Dunkeln gewachsene (etiolierte) Blätter z.B. die sich in der Erde entwickelnden Keimblätter, enthalten Etioplasten. Es handelt sich um Plastiden, die viele, aber nicht alle Chloroplasten-proteine enthalten. Sie besitzen lipidhaltige Prolamellarkörper als pseudokristalline Strukturen und Vorstufen der Chlorophyllsynthese. Durch den Gehalt an Carotinoiden haben Etioplasten eine gelbliche Farbe. Belichtung löst den Übergang zum Chloroplasten aus. Chlorophyll wird aus den Vorstufen synthetisiert und die Thylakoide werden ausgebildet.
Leukoplasten (Abb. 1.9 C) umfassen eine Vielfalt von ausdifferenzierten, ungefärbten Plastiden mit den unterschiedlichsten Funktionen. Dazu zählen die Amyloplasten, welche die Funktion als Stärkespeicher Kapitel-9 in nichtgrünen Geweben, wie Wurzeln, Knollen oder Samenkörnern, haben. Leukoplasten sind auch Ort vermehrter Fettsäuresynthese in nichtgrünen Geweben. In Pflanzen ist die Lipidsynthese stets in Plastiden lokalisiert. Auch die Reduktion von Nitrit zu NH3, ein Teilschritt der Nitratassimilation Kapitel-10, ist stets an Plastiden gebunden. In den Fällen, in denen die Nitratassimilation in der Wurzel abläuft, sind Leukoplasten Ort der Nitritreduktion.
Chromoplasten (Abb. 1.9 D) sind Plastiden, die durch ihren Gehalt an Carotinoiden (siehe Abschn. 2.4) rot, orange oder gelb gefärbt sind. Chromoplasten haben die Größe von Chloroplasten. Sie sind neben dem Cytosol Ort der Isoprenoid-Synthese (Kap. 17), es werden dort Carotinoide gebildet. Auch sind Chromoplasten an der Farbgebung von Früchten und manchen Blüten beteiligt. So beruht die Rotfärbung der Tomaten auf der Synthese von Lycopin in den Chromoplasten.

1.4 Auch Mitochondrien sind durch Endosymbiose entstanden
Mitochondrien sind der Ort der Zellatmung. In ihnen findet die Oxidation von Substraten zur Gewinnung von ATP statt (Kapitel-5). Wie schon für Plastiden gezeigt, vermehren sich auch Mitochondrien durch Teilung und werden mütterlich vererbt. Sie haben wie Plastiden ein eigenes Genom, welches aus einem großen DNA-Zirkel und oft aus mehreren kleinen DNA-Zirkeln besteht, welches u.a. mitochondriale Enzyme für die Genduplikation, Genexpression und Proteinsynthese codiert. Wie in Kapitel-20 besprochen wird, codiert die mitochondriale DNA einige weitere mitochondriale Proteine, der weitaus größte Teil wird jedoch im Zellkern codiert. Auch Mitochondrien sind endosymbiontischer Herkunft. Phylogenetische Untersuchungen basierend auf dem Vergleich von DNA-Sequenzen sprechen dafür, dass alle Mitochondrien auf ein Proteobakterium, welches mit einem anaeroben Archaebakterium eine Endosymbiose eingegangenen ist, zurückzuführen sind.
Die endosymbiontische Herkunft der Mitochondrien erklärt (Abb. 1.8), dass die Mitochondrien von zwei Membranen umgeben sind (Abb. 1.12).

Die mitochondriale Außenmembran ist ähnlich wie die der Chloroplasten durch die Anwesenheit von Porinen (siehe Abschn. 1.11) für Moleküle unterhalb einer Größe von 4000 bis 6000 Dalton und damit für Metabolite und freie Nukleotide durchlässig. Die Permeationsschranke für diese Substanzen und der Träger spezifischer Translokatoren ist die mitochondriale Innenmembran. D aher ist der Intermembranraum zwischen innerer und äußerer Membran als ein Außenraum anzusehen. Das „Protoplasma der Mitochondrien, das von der Innenmembran umschlossen wird, bezeichnet man als mitochondriale Matrix. Die mitochondriale Innenmembran enthält den Enzymapparat der Atmungskette (siehe Abschn. 5.5). Zur Vergrößerung der Membranoberfläche ist die Innenmembran in Form von Röhren (Tubuli, Abb. 1.13) oder Membranfalten (Cristae mitochondriales) in die Matrix eingestülpt. Die Struktur dieser Membraneinstülpungen entspricht den Thylakoiden mit dem Unterschied, dass in den Mitochondrien die Einstülpungen nicht zu einem gesonderten Kompartiment abgeschnürt sind. Auch die mitochondriale Innenmembran dient dem Aufbau eines Protonengradienten. Daher sind aus funktioneller Sicht der mitochondriale Intermembranraum und der chloroplastidäre Thylakoidraum vergleichbare Kompartimente.


1.5 In den Peroxisomen laufen besondere Stoffwechselwege ab
Peroxisomen, die auch als Microbodies bezeichnet werden, sind kugelförmige kleine Organellen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1,5 μm (Abb. 1.14), die im Gegensatz zu Plastiden und Mitochondrien nur von einer Membran umgeben sind.

Die peroxisomale Matrix ist ein spezielles Kompartiment für den Ablauf von Reaktionen, bei denen toxische Zwischenprodukte entstehen. So enthalten Peroxisomen Enzyme, die Substanzen unter Bildung von H202 oxidieren, und Katalase, welche dieses H202 direkt am Ort der Entstehung sofort abbaut (siehe Abschn. 7.4). Peroxisomen sind ein allgemeiner Bestandteil eukaryontischer Zellen. In Pflanzen gibt es unter anderem zwei wichtige Differenzierungsformen, die Blattperoxisomen (Abb. 1.14A), die an der Photorespiration (Kapitel 7) beteiligt sind, und die Glyoxysomen (Abb. 1.14B), die in fettreichen Samenkörnern vorhanden sind und eine Rolle bei der Synthese von Kohlenhydraten aus Fett spielen (Kapitel-15). Peroxisomen vermehren sich durch Teilung, es gibt aber auch Befunde, dass sie de novo aus Vesikeln des endoplasmatischen Reticulums gebildet werden können. Da Peroxisomen keinen eigenen genetischen Apparat besitzen, ist es eher unwahrscheinlich, dass sie wie Mitochondrien oder Plastiden von prokaryotischen Endosymbionten abstammen. Phylogenetische Analysen sprechen dafür, dass Peroxisomen aus dem endoplasmatischen Reticulum eines frühen Eukaryoten entstanden sind.

1.6 Endoplasmatisches Reticulum und Golgi-Apparat bilden ein Netzwerk zur Verteilung von Biosyntheseprodukten
Das endoplasmatische Reticulum (ER) erscheint im elektronenmikroskopischen Bild als ein Labyrinth, das die Zelle durchzieht (Abb. 1.15). Vom Erscheinungsbild lassen sich zwei Strukturtypen des ER unterscheiden: die rauhe und die glatte Form. Das rauhe ER besteht aus flachen Säckchen, die mitunter zu lockeren Stapeln angeordnet sind, wobei die Außenseite der Membranen mit Ribosomen besetzt ist. Das glatte ER besteht vorwiegend aus verästelten Röhren, die nicht mit Ribosomen besetzt sind.

Obwohl rauhes und glattes ER sich morphologisch unterscheiden, handelt es sich hier doch nur um verschiedene Erscheinungsformen eines zusammenhängenden Membransystems.
Die Anwesenheit der Ribosomen auf der Oberfläche des ER ist temporär. Ribosomen befinden sich nur dann auf der ER-Membran, wenn das durch sie gebildete Protein für das ER, die Vakuolen oder den Export aus der Zelle bestimmt ist. Diese Vorstufen-Proteine besitzen einen Sequenzabschnitt (Signalsequenz), durch den die Peptidkette schon zu Beginn der Synthese über die ER-Membran in das Lumen des ER gelangt (siehe Abschn. 14.5). Der Ribosomenbesatz des ER zeigt daher in einer Momentaufnahme nur die Ribosomen, die zum Zeitpunkt der Fixierung des Gewebes an der Synthese von Proteinen beteiligt sind, die für die Einschleusung in das ER bestimmt sind. Zudem erfolgt in den Membranen des ER die Synthese von Membranlipiden. Die dazu erforderlichen Fettsäuren werden von den Plastiden bereitgestellt.
In Samen und anderen Geweben, wie etwa den Wurzelknöllchen, entwickeln sich aus der Membran des ER spezielle Ölspeicherorganellen: die Ölkörper, auch als Oleosomen bezeichnet. Die Ölkörper speichern Triglyceride und sind von großer ökonomischer Bedeutung, da die aus den Ölpflanzen gewonnenen Öle (z.B. Rapsöl) in diesen Ölkörperchen gespeichert werden. Die Ölkörper sind als einziges Organell nur mit einer halben Biomembran umgeben. Die hydrophoben Fettsäurereste der Membranlipide ragen in das Öl hinein, die hydrophilen Molekülteile in das Cytosol (siehe Abschn. 15.2).
Das ER eignet sich auch als Speicherort für gentechnisch erzeugte Proteine. Eine Möglichkeit besteht darin, die gewünschten Proteine mit einer Signalsequenz und dem aminoterminalen ER-Retentionssignal KDEL (Lys Asp Glu Leu) zu versehen. In dem ER von Blättern können sich solche Fremdproteine in sehr großen Mengen anhäufen (bis zu 5% des Blattproteins). Interessanterweise wird das ER selbst durch diese großen Mengen an Fremdprotein nicht in seiner Funktion beeinträchtigt.
Im Lumen des ER werden Proteine häufig durch N-Glycosylierung (Anknüpfung von Hexoseketten an Aminosäurereste, (siehe Abschn. 17.7) modifiziert. Der Transfer von Proteinen in die Vakuolen kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Es gibt zum einen den direkten Transfer über Vesikel zwischen dem ER und den Vakuolen. Überwiegend werden jedoch Proteine aus dem ER durch Vesikel zunächst in die cis-Seite des Golgi-Apparats (Abb 1.16) übertragen, um erst nach einem Prozessieren und Konzentrieren durch den Golgi-Apparat in die Vakuolen transferiert oder auch als sekretorische Proteine aus der Zelle ausgeschieden zu werden. Das Abschnüren der mit Proteinen beladenen Vesikel erfolgt an bestimmten Regionen der ER-Membran, die als ERES (ER export sites) bezeichnet werden.

Die Vesikel sind an der Außenseite der umgebenden Membran mit einem Hüllprotein COPII (coat protein) besetzt. Die Fusion der Vesikel mit den Membranen des Golgi-Apparats wird durch sog. SNARE-Proteine (soluble N-ethylmaleinimide sensitive attachment protein receptors) bewirkt. Für den Rückfluss entleerter Vesikel zum ER sind diese mit einem anderen Hüllprotein besetzt (COPI), die Fusion mit dem ER erfordert wiederum ein SNARE-Protein. Man hat in Arabidopsis insgesamt 15 Gene für SNARE-Proteine gefunden.
Der Golgi-Apparat, 1898 von dem Italiener Camillo Golgi mit dem Lichtmikroskop an Nervenzellen entdeckt, besteht aus bis zu 20 parallel angeordneten gekrümmten Scheiben, den sog. Golgi-Zisternen oder Dictysomen, die von glatten Membranen (nicht von Ribosmen besetzt) umgeben sind (Abb. 1.17). Zu beiden Enden der Scheiben lassen sich Abschnürungen in Form von Vesikeln verschiedener Größe erkennen. Man unterteilt den GolgiApparat in das cis-Kompartiment, das mittlere Kompartiment sowie das transKompartiment. Während des Transports durch den Golgi-Apparat werden die Proteine häufig durch 0-Glycosylierung (Anknüpfung von Hexoseketten an Serin- und Threoninreste) und weiterhin durch Fortsetzung der N-Glycosylierung modifiziert.

Für den Transport der Proteine durch den Golgi-Apparat werden zwei Mechanismen diskutiert. a) Bei dem Vesikel-Shuttle-Modell (Abb. 1.16) werden die Proteine durch die Abschnürung und Anlagerung von Vesikeln von einer Zisterne zur anderen transferiert. Dabei hat jede Zisterne ihren festen Platz. b) Bei dem Modell der Zisternenprogression werden an der cis-Seite ständig Zisternen durch Vesikelfusion neu gebildet, die dann an der trans-Seite wieder in Vesikel zerfallen. Nach bisherigen Ergebnissen wirken beide Mechanismen wahrscheinlich nebeneinander.
Durch den Golgi-Apparat werden Proteine sortiert, für eine Ausschleusung aus der Zelle durch Exocytose (Sekretion) einerseits, oder den Transfer in lytische Vakuolen oder Speichervakuolen (Abschn. 1.2) andererseits. Als Sortierungssignal für eine Zielsteuerung in die vakuolären Kompartimente dienen Sequenzabschnitte der Proteine. Die für die lytischen Vakuolen bestimmten Proteine werden in Vesikel mit einer Clathrin-haltigen Hülle (engl. clathrin coated vesicles) sortiert und zu den Vakuolen transportiert. Clathrin ist ein Protein bestehend aus zwei verschiedenen Untereinheiten (α-UE 180000 Dalton, ß-UE 35-40000 Dalton). 3 α- und 3 ß-Untereinheiten bilden einen Komplex aus 3 Armen (Triskelion), diese polymerisieren zu hexagonalen Gittern, welche das Vesikel umgeben (Abb. 1.18). Der Transport in die Speichervakuolen erfolgt über andere Vesikel, diese enthalten kein Clathrin.

Sekretorische Proteine, die außer der ER-Eintrittssequenz kein weiteres Sortierungssignal aufweisen, gelangen über Sekretvesikel, die keine Proteinhülle aufweisen, an die Plasmamembran und werden dort über Exocytose sezerniert.
Die ER-Membran und die daraus entstandenen Membranen des Golgi-Apparats, der Transfervesikel und auch der Kernhülle bezeichnet man zusammen als Endomembranen.

1.7 Aus Pflanzenzellen lassen sich funktionell intakte Zellorganellen gewinnen
Zur Isolierung von Zellorganellen ist ein Zellaufschluss erforderlich. Dazu wird das Pflanzengewebe mechanisch so zerkleinert, dass die einzelnen Zellen auf gebrochen werden und die darin enthaltenen Organellen in das Aufschlussmedium gelangen. Man bekommt so ein Zellhomogenat. Damit die freigesetzten Organellen nicht schwellen und schließlich platzen, muss das Auf- schlussmedium isotonisch sein, das heißt, es muss durch die Anwesenheit eines Osmoticums (z.B. Saccharose) im Medium ein osmotischer Druck erzeugt werden, der dem osmotischen Druck der wässrigen Lösung innerhalb der Organellen entspricht. Dazu benutzt man in der Regel Aufschlussmedien mit etwa 0,3 M Saccharose oder Sorbit, einem Zuckeralkohol.
Abbildung 1.19 zeigt beispielhaft die Versuchsanordnung zur Gewinnung isolierter Chloroplasten. Für den Aufschluss werden kleine Blattstückchen im Aufschlussmedium für wenige Sekunden durch einen Mixer zerkleinert. Es ist wichtig, dass die Aufschlusszeit kurz ist, andernfalls werden die im Aufschlussmedium vorhandenen Organellen zerstört. Dieser Aufschluss gelingt jedoch nur bei Blattmaterial mit weichen Zellwänden, wie Spinatblättern. Bei Blättern mit festen Zellwänden, zum Beispiel von Getreidepflanzen, stellt man wie in Abschnitt 1.1 beschrieben, aus Blattstückchen zunächst Protoplasten her. Diese Protoplasten werden dann aufgebrochen, indem die Protoplastensuspension durch ein Netz gedrückt wird, dessen Maschenweite viel geringer ist als die Größe der Protoplasten.

Aus dem Zellhomogenat können die gewünschten Organellen durch Zentrifugation vom Rest abgetrennt werden. Bei der Differentialzentrifugation erfolgt die Zentrifugation in einem Medium, dessen Dichte viel geringer ist als die der Organellen. Im Schwerefeld der Zentrifuge ist dann die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellbestandteile in erster Linie von der Partikelgröße abhängig (die großen Partikel sedimentieren schneller als die kleinen Teilchen). Wie in Abbildung 1.19 am Beispiel der Isolierung von Chloroplasten gezeigt, lassen sich durch aufeinander folgende Zentrifugationen mit steigender Drehzahl innerhalb kurzer Zeit relativ reine Organellen-Präparationen erhalten.
Bei der Gleichgewichtszentrifugation werden die Organellen nach ihrer Dichte getrennt. Dazu werden in einem Zentrifugenröhrchen Medien verschiedener Dichte übereinander geschichtet, sodass die Dichte von unten nach oben abnimmt. Um die Osmolarität des Mediums nicht zu ändern, benutzt man zur Erzeugung der Dichte schwere Makromoleküle wie Percoll (ein Kieselgel). Der in dem Zentrifugenröhrchen vorbereitete Dichtegradient wird mit dem Zellhomogenat überschichtet, und es wird so lange zentrifugiert, bis alle Partikel des Homogenats die Zone ihrer Dichte erreicht haben (Abb. 1.20). Diese Gleichgewichtszentrifugation erfordert hohe Umdrehungszahlen und lange Zentrifugationszeiten und wird daher oft nur als letzter Reinigungsschritt im Anschluss an die Trennung durch Differentialzentrifugationen benutzt.

Durch die beschriebenen Techniken ist es möglich, funktionell intakte Chloroplasten, Mitochondrien, Peroxisomen und Vakuolen in hoher Reinheit zu erhalten, um deren Stoffwechseleigenschaften im Reagensglas zu studieren.

1.8 Unterschiedliche Transportmechanismen vermitteln einen Stoffaustausch zwischen verschiedenen Stoffwechselräumen
Die im vorangehenden besprochenen Organellen haben jeweils spezifische Funktionen im Zellstoffwechsel. Das Zusammenspiel der Stoffwechselprozesse in den verschiedenen Räumen erfordert einen Stoffaustausch über die Membranen der Organellen sowie auch zwischen den verschiedenen Zellen. Dieser Stoffaustausch erfolgt in vielfacher Weise: durch spezifische Translokatoren, Kanäle und Poren, über Vesikeltransport und in einigen Fällen (z. B. C02 oder 02 ) als unspezifische Membrandiffusion. Der Vesikeltransport und die Funktion der Plasmodesmen wurden bereits erwähnt. Der Besprechung weiterer Transportmechanismen sollen einige grundsätzliche Überlegungen zur Einteilung der Transportvorgänge vorangestellt werden.
Abbildung 1.21 zeigt die Einteilung verschiedener Transportvorgänge nach formalen Kriterien. Ein Transport, bei dem ein Molekül unabhängig vom Transport anderer Moleküle über die Membran bewegt wird, nennt man Uniport und einen Gegentausch Antiport. Der gleichzeitige Transport von zwei Substanzen in die gleiche Richtung wird als Symport bezeichnet. Ein Transport über Uniport, Antiport oder Symport, bei dem gleichzeitig auch eine Netto-Ladung bewegt wird, bezeichnet man als elektrogenen Transport.

Als aktiven oder auch primär-aktiven Transport bezeichnet man einen vektoriellen (gerichteten) Transport, der mit einer chemischen oder photochemischen Reaktion gekoppelt ist. Beispiele für primär-aktiven Transport sind der Transport von Protonen gegen einen Konzentrationsgradienten, der durch den Elektronentransport der Photosynthesekette (Kapitel 3) oder der Atmungskette (Kapitel 5) beziehungsweise unter Verbrauch von ATP (Abb. 1.21C) getrieben wird. Ein derartiger Protonentransport ist elektrogen. Die Verschiebung einer positiven Ladung führt zur Ausbildung eines Membranpotenzials. Ein weiteres Beispiel für einen primär-aktiven Transport ist der ATP-abhängige Transport von Glutathionkonjugaten in Vakuolen (siehe Abschn. 12.2).
Bei einem sekundär-aktiven Transport ist die einzige Triebkraft ein elektrochemisches Potenzial über eine Membran. Bei einem elektrogenen Uniport kann ein Membranpotenzial die treibende Kraft sein, durch die das Substrat gegen einen Konzentrationsgradienten über die Membran befördert wird. Ein Beispiel hierfür ist die Akkumulation von Malat in einer Vakuole (Abb. 1.21C), siehe auch Kapitel 8). Ein weiteres Beispiel für einen sekundäraktiven Transport ist der Transport von Saccharose über einen H+-Saccharose-Symport, bei der ein durch primär-aktiven Transport gebildeter Protonengradient die Akkumulation von Saccharose treibt (Abb. 1.21C). Dieser Transport spielt bei der Beladung der Siebröhren mit Saccharose eine wichtige Rolle (Kapitel 13).

Translokatoren katalysieren den spezifischen Transport von Substraten und Produkten des Stoffwechsels
Spezielle Membranproteine vermitteln einen spezifischen Transport durch die Membranen. Man hat diese Proteine in der Vergangenheit als „Carrier" bezeichnet, weil man von der Vorstellung ausging, dass sie nach Bindung eines Substrats durch die Membran diffundieren und das Substrat an der anderen Seite freisetzen. Wir wissen heute, dass dieses Bild nicht zutrifft; der Transport besteht vielmehr darin, dass eine Substanz in spezifischer Weise durch eine Pore "hindurhgereicht" wird. Aus diesem Grunde bezeichnet man Proteine, die einen spezifischen Membrantransport vermitteln, als Translokatoren. Wir werden sehen, dass eine Vielzahl unterschiedlicher Translokatoren sich in ihrem Aufbau und ihrer Wirkungsweise gleichen. Daher sollen hier Struktur und Funktion eines Translokators am Beispiel des chloroplastidären Triosephosphat-Phosphat-Translokators besprochen werden. Dieser Translokator bewirkt durch einen Gegentausch von Phosphat mit Triosephosphat (Dihydroxyacetonphosphat oder Glycerinaldehydphosphat) den Export der Photoassimilate aus den Chloroplasten und ist mengenmäßig gesehen wohl das häufigste Transportprotein in einer Pflanze.
Zur Messung der Aufnahme von Substraten in Chloroplasten oder andere Organellen ist die Silikonöl-Filtrationszentrifugation eine geeignete Methode (Abb. 1.22). Man startet die Transportmessung durch Zugabe des betreffenden Substrats zu einer Suspension von isolierten Chloroplasten und beendet die Messung, indem die Chloroplasten von dem umgebenden Medium durch Zentrifugation durch eine Silikonölschicht abgetrennt werden. In den abgetrennten Chloroplasten wird dann die Menge des aufgenommenen Substrats quantitativ bestimmt.

Misst man auf diese Weise die Aufnahme von Phosphat in die Chloroplasten in Abhängigkeit von der Außenkonzentration des Phosphats, so beobachtet man einen hyperbolen Kurvenverlauf (Abb. 1.23). Bei niedrigen Phosphatkonzentrationen steigt die Aufnahmegeschwindigkeit zunächst proportional mit der Außenkonzentration an, die Kurve flacht dann aber ab und erreicht einen Sättigungswert, die Maximalgeschwindigkeit (Vmax). Der Transport zeigt demnach die gleiche Charakteristik wie die Enzymkatalyse. Bei der Enzymkatalyse wird das Substrat (S) zunächst an das Enzym (E) gebunden. Dort erfolgt die katalytische Umwandlung zum Produkt (P), welches dann vom Enzym freigesetzt wird:

Der Transport durch einen spezifischen Translokator lässt sich in analoger Weise formulieren:

Das Substrat wird an eine spezifische Bindungsstelle des Translokatorproteins (T) gebunden, durch die Membran transportiert und vom Translokatorprotein wieder gelöst. Die Maximalgeschwindigkeit Vmax entspricht einem Zustand, in dem die Bindungsstellen des Translokators mit Substrat gesättigt sind. Wie für ein Enzym lässt sich auch für einen Translokator ein Km-Wert angeben, welcher der Substratkonzentration entspricht, bei der der Transport mit halbmaximaler Geschwindigkeit verläuft. In Analogie zur Enzymkatalyse besitzt auch der katalysierte Transport eine Spezifität für die zu transportierenden Substanzen. So werden durch den chloroplastidären Triosephosphat-Phosphat-Translokator von C3-Pflanzen (siehe Abschn. 9.1) neben Phosphat, Sulfat, Dihydroxyacetonphosphat und Glycerinaldehydphosphat auch 3-Phosphoglycerat transportiert, nicht aber 2-Phosphoglycerat. Die einzelnen Substrate konkurrieren um die Bindungsstelle. Dadurch ist ein Substrat, etwa Phosphat, ein kompetitiver Inhibitor für den Transport eines anderen Substrats, wie 3-Phosphoglycerat. Der chloroplastidäre Triosephosphat-Phosphat-Translokator ist ein Antiporter. Für jedes eintransportierte Molekül (z. B. Phosphat) wird ein anderes Molekül (z. B. Dihydroxyacetonphosphat) aus den Chloroplasten austransportiert. Ein anderes Beispiel für einen Antiporter ist der mitochondriale ATP/ADP-Translokator (siehe Abschn. 5.6) der ATP und ADP, nicht aber AMP, Phosphat oder andere Nukleotide transportiert.

Der Metabolittransport wird durch Konformationsänderungen bewirkt
Translokatoren bilden als integrale Membranproteine einen Teil der Membran. Auf Grund ihrer hohen Hydrophobie sind Membranproteine in Wasser nicht löslich, was ihre Erforschung so sehr erschwert hat. Um diese Proteine aus der Membran zu lösen, bedient man sich schonender nichtionischer Detergentien, wie zum Beispiel Octylglucosid (Abb. 1.24). Die hydrophobe Kohlenwasserstoffkette des Detergens lagert sich um das hydrophobe Protein und die so gebildete Micelle ist durch den Glucoserest des Octylglucosids wasserlöslich. Bei der Entfernung des Detergens würden die Membranproteine zu einer klebrigen Masse aggregieren, die nicht wieder in Lösung gebracht werden kann.

Translokatoren durchdringen die Lipiddoppelschicht der Membran in Form von α-Helices, deren nach außen gerichtete Aminosäureseitenketten hydrophob sind. Daher enthalten transmembrane α-Helices hydrophobe Aminosäuren wie Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin oder Phenylalanin. Als ein Beispiel hierfür zeigt Abb. 1.25 das Modell der Struktur des Monomers des mitochondrialen ATP/ADP-Translokators. Sechs transmembrane α-Helices durchspannen die innere Mitochondrienmembran, die nach innen gerichteten schleifenartigen Sequenzabschnitte (engl. loops) bedingen die Spezifität des Transports. Der mitochondriale ATP/ADP-Translokator liegt in der Membran als dimeres Molekül mit identischen Monomeren vor.

Mit der Röntgenstrukturanalyse (Abschn. 3.3) des mitochondrialen ATP/ADP-Translokators gelang die Aufklärung der Raumstruktur eines Metabolittranslokators. Es zeigte sich, dass die sechs transmembranen α-Helices des Monomers in einer Fass-artigen Struktur (engl. barrel) eine Translokationspore bilden. Demnach bilden die oben genannten Dimere zwei benachbarte identische Poren. Auch der chloroplastidäre Triosephosphat-Phosphat-Translokator liegt als Dimer identischer Monomere vor, wobei es aber bislang noch unsicher ist, wieviele transmembrane Helices das Monomer aufweist.
Wie schon früher gezeigt, sind die Translokationsporen verschlossen (engl. gated pore) und besitzen jeweils nur eine Substratbindungsstelle, die entweder von außen oder von innen zugänglich ist, wobei die Zugänglichkeit durch die Konformation des Translokatorproteins bestimmt wird (Abb. 1.26). Der Transportprozeß ähnelt so einer Schleuse. Er besteht in der Bindung eines Substrats (A) an die von außen zugängliche Substratbindungsstelle; es erfolgt dann eine Konformationsänderung und das Substrat wird schließlich an der Innenseite freigesetzt. An die nun frei gewordene Bindungsstelle kann ein anderes Substrat (B) binden und so nach außen transportiert werden.

Ein obligater Gegentausch erklärt sich dadurch, dass ein Umklappen der Bindungsstellen durch Konformationsänderung nur dann erfolgt, wenn die Bindungsstelle durch ein Substrat besetzt ist. Bei dieser Art von Antiport spricht man von einem Ping-Pong-Mechanismus (Abb. 1.26A). Nach diesem Mechanismus transportiert offenbar der chloroplastidäre Triosephosphat-Phosphat-Translokator. In vielen Fällen, z.B. bei dem mitochondrialen ATP/ADP-Translokator, erfolgt ein Gegentausch jedoch nach einem simultanen Mechanismus (Abb. 1.26B), bei dem die benachbarten Poren in jeweils verschiedenen Konformationen vorliegen. Eine Pore ist nach innen geöffnet und die andere nach außen, wobei die entgegengesetzten Konformationsänderungen bei beiderseits besetzten Bindungsstellen immer simultan erfolgen und so einen obligatorischen Gegentausch bewirken.
Eine Pflanze enthält eine große Anzahl derartiger Metabolittranslokatoren. Bislang wurden etwa 20 plastidäre Translokatoren identifiziert. Die Analyse des Arabidopsis Genoms lässt vermuten, dass es in dieser Pflanze insgesamt etwa 150 plastidäre und 60 mitochondriale Translokatoren gibt.

Aquaporine machen Zellmembranen für Wasser durchlässig
Das osmotische Verhalten von Zellen und Zellorganellen zeigt, dass deren Membranen in sehr unterschiedlichem Maße für Wasser durchlässig sind. Hingegen ist die Wasserpermeabilität reiner Lipid-Doppelschichten relativ gering. Peter Agre (USA) entdeckte in Nieren und Blutzellen Proteine, die Membrankanäle für Wasser und in einigen Fällen auch für Glycerin bilden, und gab ihnen die Bezeichnung Aquaporine. Für diese wichtige Entdeckung erhielt er 2003 den Nobel-Preis für Chemie. Es stellte sich dann heraus, dass diese Aquaporine auch in Pflanzen vorkommen, u.a. in der Plasmamembran und den Vakuolen. Beide Membranen spielen eine besondere Rolle beim Wasserhaushalt einer Pflanzenzelle. Man hat in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana (Abschn. 20.1) etwa 35 verschiedene Gene der Aquapo1in-Genfamilie gefunden, allein für die Plasmamembran wurden 13 Aquaporine identifiziert.
Durch Röntgenstrukturanalyse (siehe Abschn. 3.3) wurde gezeigt, dass die Untereinheiten der Aquaporine jeweils sieben transmembrane Helices besitzen. Sie bilden in der Membran Tetramere, von denen aber jedes Monomer einen Kanal bildet, der in der Sekunde 109 bis 1011 Wassermoleküle befördert. Der Wasserkanal besteht aus einer sehr engen, vorwiegend hydrophoben Pore mit Bindungsstellen für sieben H2O-Moleküle. Diese Bindungsstellen wirken als Selektionsftlter für einen spezifischen Wassertransport. Zudem lässt sich aus der Struktur ableiten, dass aus energetischen Gründen dieser Wasserkanal für Protonen relativ undurchlässig ist.
Durch eine Regulation der Öffnung der Aquaporine kann die Wasserleitfähigkeit der Plasmamembran den Umweltbedingungen angepasst werden. Die Aquaporine von Pflanzen besitzen eine in das Innere gerichtete Peptidschleife (loop) die bei einer Konformationsänderung wie ein Deckel den Kanal verschließen kann. Auf diese Weise können sowohl bei Trockenstress wie auch bei Überflutung die Wasserkanäle verschlossen werden. Bei Trockenstress wird der Verschluss durch die Dephosphorylierung von zwei hochkonservierten Serinresten bewirkt. Bei Überflutung oder Staunässe wird durch die dabei auftretende Anoxie (Sauerstoffmangel) der pH-Wert des Cytosols erniedrigt, wodurch die Protonierung eines Histidinrestes erhöht wird. Dies führt zu einer Konformationsänderung des Kanalproteins, der Deckel klappt zu und die Wasserpore wird dadurch verschlossen.
Die inzwischen allgemein benutzte Bezeichnung Aquaporin ist unglücklich gewählt, da sich die Aquaporine in ihrer Struktur von den in Abschnitt 1.11 behandelten Porinen grundsätzlich unterscheiden. Während die Aquaporine ebenso wie Translokatoren und die im Folgenden besprochenen Ionenkanäle aus transmembranen Helices aufgebaut sind, bestehen die Porine aus ß-Faltblättern.

Ionenkanäle haben eine sehr hohe Transportkapazität
Der zuvor besprochene chloroplastidäre Triosephosphat-Phosphat-Translokator hat bei 25°C eine Wechselzahl von 80 s-1, das heißt, ein Translokatorprotein befördert in der Sekunde 80 Substratmoleküle. Die Wechselzahlen anderer Translokatoren liegen im Bereich von l0 bis 1000 s-1. Dagegen gibt es andere Ionentransportsysteme, die so genannten Ionenkanäle in den verschiedenen Membranen, die 106 bis 108 Ionen pro Sekunde durch die Membran befördern. Sie unterscheiden sich von den Translokatoren dadurch, dass ihre Pore zu gleicher Zeit nach beiden Seiten geöffnet ist. Der Ionenfluss der Ionenkanäle ist so hoch, dass es möglich ist, die Transportleistung eines einzelnen Kanals als elektrische Leitfähigkeit zu messen.
Die Arbeitsweise für derartige Einzelkanalmessungen, die so genannte patch clamp-Technik, wurde von den deutschen Wissenschaftlern Erwin Neher und Bert Sakmann entwickelt, die dafür 1991 mit dem Nobelpreis für Medizin oder Physiologie ausgezeichnet wurden. Die Messanordnung (Abb. 1.27) besteht aus einer Glaspipette, die eine Elektrode enthält und mit Elektrolytflüssigkeit gefüllt ist. Die sehr feine Spitze dieser Pipette (Durchmesser = lμm) ist mit dem Flecken (engl. patch) einer Membran dicht abgeschlossen. Die Menge der pro Zeiteinheit durch das patch transportierten Ionen lässt sich durch die Messung des elektrischen Stromes bestimmen. Sie wird gewöhnlich als Leitfähigkeit in Siemens (S) angegeben.

Abbildung 1.28 zeigt ein Beispiel für die Messung von Einzelkanalströmen an der Plasmamembran von Schließzellen der Ackerbohne. Die Registrierung der Strommessung zeigt, dass ein Kanal unterschiedlich lange öffnet (leitet) und schließt (nicht leitet). Dieses Prinzip stochastischen Schaltens zwischen einem nichtleitenden Zustand und einem definierten leitenden Zustand ist eine typische Eigenschaft von Ionenkanälen. Verschiedene Kanäle haben im geöffneten Zustand jeweils unterschiedliche Leitfähigkeiten, die zwischen wenigen pS und mehreren 100 pS liegen können. Zum anderen haben verschiedene Kanäle charakteristische mittlere Zeiten, in denen sie geöffnet beziehungsweise geschlossen sind. Je nach Kanal können diese von wenigen Millisekunden bis zu Sekunden andauern. Die Transportleistung des Kanals pro Zeiteinheit ist dann sowohl von der Leitfähigkeit des offenen Kanals als auch von der mittleren Öffnungszeit abhängig.

Man kennt inzwischen eine Fülle von Ionenkanälen, die für bestimmte Ionen mehr oder minder spezifisch sind. Es gibt in Pflanzen hochselektive Kationenkanäle für H+, K+, Na+ und Ca2+ und entsprechend selektive Anionenkanäle für Cl- und Dicarboxylate wie Malat. Die Öffnung vieler Ionenkanäle wird durch das elektrische Membran potenzial, das an der betreffenden Membran anliegt, gesteuert. Ionenkanäle haben dadurch eine sehr wichtige Funktion bei der elektrischen Regulation von Ionenflüssen. So wird in Schließzellen (siehe Abschn. 8.1) bei einer Hyperpolarisierung der Plasmamembran auf >-100 mV verstärkt ein Kanal geöffnet, durch den K+-Ionen in die Zelle einströmen (K+-Einwärtskanal), und bei einer Depolarisierung ein anderer Kanal geöffnet, durch den K+-Ionen aus der Zelle austreten (K+-Auswärtskanal). Außerdem wird die Öffnung vieler Ionenkanäle auch durch Liganden wie Ca2+-Ionen, Protonen oder auch durch Phosphorylierung des Kanalproteins kontrolliert. Es wird dadurch sowohl eine Steuerung der Kanalaktivität durch metabolische Vorgänge als auch durch Botenstoffe (siehe Kapitel 19) ermöglicht.
Von vielen Kanalproteinen wurden in letzter Zeit die Aminosäure-Sequenzen ermittelt. Dabei zeigte sich, dass bestimmte Kanäle, z.B. für K+-Ionen, in Bakterien, Tieren und Pflanzen sehr ähnlich sind. Roderick MacKinnon und Mitarbeiter von der Rockefeller Universität in New York ist es gelungen, die dreidimensionale Struktur des K+-Kanals aus dem Bakterium Streptomyces lividans mithilfe der Röntgenstrukturanalyse (Abschn. 3.3) aufzuklären. Durch diese bahnbrechenden Ergebnisse war es erstmalig möglich, die molekulare Funktion eines Ionenkanals zu erkennen. Man wusste schon seit längerer Zeit, dass das Kanalprotein aus identischen Untereinheiten aufgebaut ist, wobei jede dieser Untereinheiten zwei transmembrane Helices aufweist, die durch eine Sequenz von etwa 30 Aminosäuren (Loop) verbunden sind (Abb. 1.29A). Dieser Loop ist für die Ionenselektivität des Kanals verantwortlich. Die Strukturanalyse zeigte nun, dass ein K+-Kanal aus vier der genannten Untereinheiten aufgebaut ist (Abb. 1.29B,C). Von jeder Untereinheit ist eine Helix nach Innen gerichtet und kleidet den Kanal aus, während die andere nach außen zur Lipidmembran gerichtet ist. Im Inneren der Pore befindet sich ein wassergefüllter Kanal, der durch einen Selektivitätsfilter nach außen abgegrenzt wird. Dieser Filter wird aus den oben erwähnten Loops der vier Untereinheiten gebildet. Die Pore dieses Filters ist so klein, dass die K+-Ionen ihre Hydrathülle abstreifen müssen, um hindurch zu gelangen. Um den hohen Energiebedarf der Dehydratisierung der K+-Ionen zu kompensieren, ist die Pore des Filters mit einem Kranz von Sauerstoff-Atomen ausgekleidet, die als „Wasserersatz" die K+-Ionen komplexieren. Zudem besitzt die Pore negative Ladungen zur Bindung des Kations. Durch nachfolgende K+-Ionen werden die in der Pore gebundenen K+-Ionen zur anderen Seite des Filters herausgedrängt. Na+-Ionen sind zu klein, um in der Pore des Selektivitätsfilters komplexiert zu werden, sie können daher ihre Hydrathülle nicht abstreifen; ihr Weg durch den Filter ist so versperrt. Dies erklärt die Ionenselektivität des K+-Kanals. Es sei erwähnt, dass der untersuchte K+-Kanal aus Streptomyces in seiner Aminosäuresequenz dem K+-Einwärts-Kanal von Pflanzen sehr ähnelt, sodass die durch Röntgenstrukturanalyse erhaltenen Ergebnisse als allgemeingültig auch für pflanzliche K+-Kanäle betrachtet werden können.

Eine nachfolgende Aufklärung der Raumstruktur der Chloridkanäle, welche zu einer großen Familie von in Prokaryoten und Eukaryoten vorkommenden Anionenkanälen gehören, ergab analoge Ergebnisse. Auch diese Kanäle werden durch transmembrane α-Helices gebildet und enthalten in der Translokationspore Loops, die als Selektionsfilter wirken, in dem sie das Chloridanion zwischenzeitlich koordinativ binden. Somit zeigen die Eigenschaften des K+-Kanals aus Streptomyces ein Grundprinzip der Funktion eines spezifischen Ionenkanals.
Zwischen den Grundstrukturen von Ionenkanälen und Translokatoren bestehen Ähnlichkeiten. So wurde gezeigt, dass Translokatoren, wie der chloroplastidäre Triosephosphat-Phosphat-Translokator, durch Reaktion mit chemischen Agentien in beidseitig geöffnete Kanäle umgewandelt werden können, deren Ionenleitfähigkeit ähnlich groß ist wie die der hier besprochenen Ionenkanäle. Die funktionellen Unterschiede zwischen Translokatoren und Ionenkanälen lassen sich durch eine unterschiedliche Ausfüllung der Poren durch Peptidketten erklären. Bei Translokationsporen ist die Substratbindungsstelle jeweils nur von einer Seite zugänglich und der Transport erfordert eine Konformationsänderung, wodurch der Translokatorkanal den Charakter eine Schleuse erhält. Der geöffnete Ionenkanal besteht hingegen aus einer wässrigen Pore, die nach beiden Seiten geöffnet ist.

Porine sind aus ß-Faltblattstrukturen auf gebaut
Es wurde bereits besprochen, dass die äußeren Membranen von Chloroplasten und Mitochond1ien für Metabolite wie z.B. Mononukleotide und Zuckerphosphate unspezifisch permeabel sind. Dies wurde an isolierten Organellen gemessen. Diese relativ unspezifische Permeabilität wird auf die Anwesenheit von porenbildenden Proteinen, so genannte Porine zurückgeführt.
Die Öffnungsweite durch Porin gebildeter Poren lässt sich durch Einbau des Porins in eine künstliche Lipidmembran, die zwei mit einem Elektrolyt gefüllte Kammern trennt, bestimmen (Abb. 1.30). Dazu gibt man in Detergentien gelöste Membranproteine in eine der beiden Kammern. Wegen ihrer Hydrophobizität lagern sich die Porinmoleküle nacheinander in die Lipidmembran ein. Sie bilden dabei jeweils einen neuen Kanal, wie man durch einen stufenweisen Anstieg der Leitfähigkeit erkennen kann. Da jede stufenförmige Leitfähigkeitserhöhung der Leitfähigkeit einer einzelnen Pore entspricht, lässt sich so unter Berücksichtigung der Leitfähigkeit der Elektrolytlösung die Öffnungsweite einer Pore ermitteln. So wurde die Öffnungsweite der Porinpore von Mitochondrien mit 1,7nm und die von Chloroplasten mit etwa 3nm abgeschätzt.

Man hat Porine erstmalig in der äußeren Membran von gram-negativen Bakterien, wie z. B. E. coli, nachgewiesen. Inzwischen kennt man mehrere Klassen von Po1inen, die sich stark voneinander unterscheiden. Allgemeine Porine bilden unspezifische Diffusionsporen mit einem wassergefüllten Kanal, der eine weitgehend unspezifische Diffusion von Substratmolekülen erlaubt. Diese Porine bestehen aus Untereinheiten mit einer molekularen Masse von etwa 30000 Dalton. Oft kommen Porine in der Membran als Trimere vor, bei denen jede der drei Untereinheiten eine Pore bildet. Porine unterscheiden sich in ihren Eigenschaften ganz wesentlich von den bisher behandelten Translokatorproteinen, indem sie keine Sequenzbereiche besitzen, die ausschließlich hydrophob und dadurch zur Bildung von transmembranen Helices befähigt sind. Die Analyse der Raumstruktur eines bakteriellen Porins durch Röntgenstrukturanalyse (siehe Abschn. 3.3) ergab, dass die Wände der Poren durch ß-Faltblattstrukturen (Abb. 1.31) gebildet werden.

Ein Porinmolekül bildet insgesamt 16 Faltblätter, bestehend aus jeweils etwa 13 Aminosäuren. Diese 16 miteinander durch Wasserstoffbrücken verbundenen Faltblätter bilden die Pore (Abb. l.32A). Der Aufbau ähnelt einem Fass (engl. barrel), wobei die einzelnen Faltblätter den Fassdauben entsprechen. In den ß-Faltblättern sind die Aminosäuren abwechselnd hydrophil und hydrophob. Dadurch ist die eine Seite des Faltblattes mit hydrophoben Aminosäureseitenketten besetzt. Diese Seite ist der Lipidmembran zugewandt. Die andere Seite mit den hydrophilen Resten ist gegen die wässrige Phase gerichtet (Abb. l.32B). Die Porine sind im Vergleich zu den Ionenkanalproteinen relativ "sparsam" aufgebaut; durch ein Porinmolekül wird ein viel größerer Kanal gebildet als durch ein Kanalprotein mit doppelter Masse. Neben den allgemeinen Porinen wurden in Bakterien selektive Porine nachgewiesen, die Bindungsstellen für Ionen und auch nichtionische Substrate, wie Zucker, enthalten. So wurde in E. coli ein Maltodextrin-bindendes Porin identifiziert, welches einen Kanal bestehend aus 16 ß-Faltblättern bildet, wobei Schleifen zwischen den Faltblättern in das Kanalinnere hineinragen und die entsprechenden Bindungsstellen liefern.

Die mitochondrialen Porine entsprechen in ihrer Struktur den oben genannten allgemeinen Porinen, indem sie ebenfalls aus 16 ß-Faltblättern aufgebaut sind. Messungen in künstlichen Lipidmembranen zeigen eine leichte Anionen-Selektivität der geöffneten Pore. Durch Anlegen einer Spannung von 30 mV wird die Pore hingegen weitgehend geschlossen und zeigt dann eine Kationen-Selektivität. Daher wird das mitochondriale Porin auch als voltage-dependent anion selective channel (VDAC) bezeichnet. Die Bedeutung dieser spannungsabhängigen Regulation der Porenöffnung für den Mitochondrienstoff-wechsel ist aber noch umstritten.
In der äußeren Hüllmembran von Chloroplasten wurde ein porenbildendes Protein mit einer molekularen Masse von 24000 Dalton (outer envelope protein, OEP 24) nachgewiesen, welches eine unspezifische Diffusionspore bildet. OEP24 entspricht in seiner Funktion dem oben genannten mitochondrialen VDAC, weist aber zu diesem keine erkennbare Sequenzhomologie auf Offenbar handelt es sich bei OEP24 um einen neuen Typ eines Porins. OEP24 erlaubt in geöffnetem Zustand die Diffusion von z.B. Phosphat, Triosephosphat, 3-Phosphoglycerat, Hexosephosphaten und ATP.
Dazu gibt es in der äußeren Hüllmembran von Chloroplasten aber noch ein weiteres porenbildendes Protein (OEP21), welches Anionen-selektiv ist, und in besonderem Maße die Diffusion der oben genannten phosphathaltigen Metabolite ermöglicht. Die Öffnung der OEP21-Pore wird durch die Bindung von Substraten verändert. Es wird derzeit untersucht, inwieweit der Fluss von Metaboliten über die äußere Hüllmembran der Chloroplasten durch eine Regulation der Öffnung von OEP24 und OEP21 reguliert wird. Auf ein Porenbildendes Protein in der Grenzmembran von Peroxisomen wird in Abschn. 7.4 eingegangen. nach oben zum Kapitelanfang

2 Die Nutzung der Energie des Sonnenlichtes durch die Photosynthese ist die Grundlage für das Leben auf der Erde
Pflanzen und Cyanobakterien fangen das Licht der Sonne ein und nutzen dessen Energie, um aus anorganischen Ausgangssubstanzen wie C02 , Nitrat und Sulfat ihre Zellsubstanz durch Photosynthese selbst herzustellen: Sie sind photoautotroph. Bei der Photosynthese wird durch die Energie der Photonen Wasser in Sauerstoff und Wasserstoff, der in Form von NADPH gebunden wird, gespalten. Dieser als Lichtreaktion bezeichnete Prozess findet in den so genannten photosynthetischen Reaktionszentren statt, die in einer Membran eingebettet sind; er beinhaltet einen Transport von Elektronen, der mit der Synthese von ATP gekoppelt ist. Das auf diese Weise durch die Lichtreaktion bereitgestellte NADPH und ATP wird in einer so genannten Dunkelreaktion verbraucht, um zum Beispiel aus CO2 Kohlenhydrate zu synthetisieren (Abb. 2.1). Durch die Photosynthese der Pflanzen und Cyanobakterien wurde die gesamte Biomasse auf der Erde, einschließlich der Lager fossiler Brennstoffe, aber auch der Sauerstoff in der Atmosphäre gebildet. Tiere sind dagegen auf die Zufuhr von Kohlenhydraten und anderen organischen Substanzen durch die Nahrung angewiesen. Sie sind also heterotroph.

Sie gewinnen die für die Lebensprozesse erforderliche Energie durch die Oxidation der letztlich durch die Pflanzen gebildeten Biomasse; unter Verbrauch von Sauerstoff wird CO2 zurückgebildet. Die von den Pflanzen eingefangene Sonnenenergie bildet so auch die Energiequelle für den Ablauf der Lebensprozesse der Tiere.

2.1 Wie hat es mit der Photosynthese angefangen?
Aus Messungen der Verteilung von Radioisotopen wurde berechnet, dass die Erde vor 4,6 Milliarden Jahren entstanden ist. Die frühesten fossilen Funde bakterienähnlicher Strukturen wurden auf ein Alter von 3,5 Milliarden Jahren datiert. Als das Leben auf der Erde entstand, gab es keinen Sauerstoff in der Atmosphäre. Man schließt das unter anderem aus der Tatsache, dass in sehr frühen Sedimentgesteinen das Eisen als Fe2+ vorliegt. In Gegenwart von Luftsauerstoff wird das mineralische Eisen zu Fe3+ oxidiert. Nach heutigen Erkenntnissen enthielt die Erdatmosphäre damals vor allem Kohlendioxid, molekularen Wasserstoff, Methan, Ammoniak, Blausäure und Wasser.
Der russische Wissenschaftler Alexander Oparin stellte 1922 die viel beachtete Hypothese auf, dass in dieser so genannten Uratmosphäre durch die Einwirkung von Energie, zum Beispiel in Form von ultravioletter Strahlung (damals gab es noch keine schützende Ozonschicht), von elektrischen Entladungen (Blitzen) oder vulkanischer Hitze, sich die Bausteine für das entstehende Leben spontan bildeten und in den Urmeeren anhäuften. Die 1953 ausgeführten Experimente der amerikanischen Wissenschaftler Stanley Miller und Harold Urey haben diese Hypothese erhärtet. Die beiden Forscher simulierten die postulierte präbiotische Synthese organischer Substanzen, indem sie ein Gasgemisch aus Komponenten der Uratmosphäre, also H20, CH4, NH3 und H2 etwa eine Woche bei 80°C elektrischen Blitzentladungen aussetzten. In dem Kondensat dieses Versuchsansatzes ließen sich tatsächlich Aminosäuren nachweisen, darunter Glycin und Alanin, und andere Carbonsäuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Milchsäure und Bernsteinsäure. Untersuchungen anderer Forschergruppen mit modifizierten Versuchsansätzen, unter anderem in Gegenwart von CO2 , HCN und Formaldehyd, zeigten, dass bei Energieeinwirkung auf eine angenommene Uratmosphäre eine große Anzahl von Substanzen der belebten Materie, wie Zucker, Fettsäuren, Tetrapyrrole und die Nukleinbasen Adenin, Guanin, Cytosin und Uracil, spontan gebildet wurden.
Es gibt die Hypothese, dass vor der Entstehung des Lebens die durch abiotische Prozesse gebildeten organischen Substanzen sich in den Meeren, Seen und Tümpeln über sehr lange Zeiträume anhäuften. Es gab keinen Sauerstoff, durch den diese akkumulierten Substanzen oxidiert werden konnten, und auch keine Bakterien oder andere Organismen, die sie abgebaut hätten. Schon Oparin spekulierte, dass sich so eine Ursuppe bildete, welche die Bausteine für die Entstehung des Lebens lieferte. Da Sauerstoff damals noch nicht vorhanden war, müssen die ersten Organismen Anaerobier gewesen sein.
Viele Forscher nehmen heute an, dass frühe Organismen einen anaeroben chemolithotrophen Stoffwechsel hatten, beispielsweise durch die Reaktion:

Es ist denkbar, dass schon zu einem frühen Zeitpunkt der Evolution die Katalyse dieser Reaktion mit der Bildung einer protonenmotorischen Kraft gekoppelt war (Abschn. 4.1), welche ihrerseits durch die Katalyse einer primitiven ATP-Synthase (Abschn. 4.3) die Energie für eine Synthese von ATP lieferte. Archaebakterien, welche unter extremen Bedingungen, wie z.B. in der Umgebung heißer Quellen in der Tiefsee, zu leben vermögen und die als die nächsten noch lebenden Verwandten der frühesten Lebewesen auf der Erde angesehen werden, sind in der Lage die oben genannte Reaktion zur Bildung von ATP zu nutzen. Sicherlich war es ein Durchbruch für die Ausbreitung des Lebens auf der Erde, als es gelang, zur Bestreitung der Lebensprozesse die Energie der Sonnenstrahlung zu nutzen. Dies ist höchstwahrscheinlich schon in einem sehr frühen Stadium geschehen. Die heute verbreiteten Purpurbakterien und Grünen Schwefelbakterien können als Relikte aus der Frühzeit der Evolution der Photosynthese angesehen werden.
Vor der Behandlung der Photosynthese in Kapitel 3 wird in dem vorliegenden Kapitel zunächst besprochen, auf welche Weise das Licht von den Pflanzen eingefangen und die Energie dieses Lichtes in den Photosyntheseapparat geleitet wird.

2.2 Die Energie des Sonnenlichtes wird durch Farbstoffe eingefangen

Der Energiegehalt des Lichtes hängt von seiner Wellenlänge ab
Seit den bahnbrechenden Arbeiten der beiden Nobelpreisträger Max Planck und Albert Einstein, die in Berlin Anfang des 20. Jahrhunderts durchgeführt wurden, wissen wir, dass das Licht eine Doppelnatur hat. Man kann es sowohl als elektromagnetische Welle als auch als Strahl von Teilchen, die als Lichtquanten oder Photonen bezeichnet werden, auffassen.
Die Energie eines Photons ist seiner Frequenz v proportional:

h ist das Plancksche Wirkungsquantum (6,6•10-34 J s), eine fundamentale Naturkonstante der Quantenphysik, und c die Lichtgeschwindigkeit (3•108 m/s). λ bedeutet die Wellenlänge.
So wie man als chemisches Maß für die Anzahl von Molekülen die Einheit mol benutzt, kann man die Menge von Photonen in mol (Einstein) angeben, entsprechend 6•1023 Teilchen (Avogadro-Zahl NA). Dieses Maß braucht man für die folgende Beziehung zwischen der Photonenenergie und der freien Reaktionsenthalpie. Die Energie eines mol Photonen beträgt:

Damit die Energie eines Photons im thermodynamischen Sinn nutzbringend verwendet werden kann, muss sie mindestens gleich der freien Enthalpie der photochemischen Reaktion sein, die sie auslöst. (In Wirklichkeit geht bei der Energieübertragung viel Energie verloren, wie wir in Abschnitt 3.5 sehen werden. Die Energie des Photons muss somit größer sein.) Wir können daher die freie Reaktionsenthalpie ΔG mit der Energie des absorbierten Lichts gleichsetzen:

Setzt man die Zahlenwerte für die Konstanten h, c und NA ein, erhält man:

(siehe Tabelle 2.1)
Für einen Vergleich photosynthetischer Reaktionen mit Redoxreaktionen, die wir in Kapitel 3 besprechen, ist es oft praktisch, statt der Energie das elektrische Potenzial (ΔE) der Strahlung anzugeben. Elektrisches Potenzial und Energie sind über die Faraday-Konstante (F = Ladungsmenge pro mol = 96485 A•s/mol) miteinander verknüpft.

Aus dem weiten Spektrum der elektromagnetischen Wellen (Abb. 2.2) nimmt das menschliche Auge nur den kleinen Bereich zwischen etwa 400 und 700 nm wahr. In diesem Bereich ist die Intensität der Sonnenstrahlung besonders hoch, und dies ist auch der Lichtbereich, der bei der pflanzlichen Photosynthese genutzt wird.

Allerdings kann die bakterielle Photosynthese auch Licht im Infrarotbereich nutzen. Nach Gleichung 2.3 ist die Energie des eingestrahlten Lichtes umgekehrt proportional zur Wellenlänge. In Tabelle 2.1 sind die Lichtenergien pro mol Photonen für Licht verschiedener Farbe zusammengestellt. Demnach besitzt violettes Licht eine Energie von etwa 300 kJ/mol Photonen. Dunkelrotes Licht mit einer Wellenlänge von 700 nm - das ist das langwelligste Licht, welches von der pflanzlichen Photosynthese noch genutzt wird - hat mit 170 kJ pro mol Photonen nur noch etwas mehr als den halben Energieinhalt des violetten Lichtes.

Chlorophyll ist der zentrale Photosynthesefarbstoff
Bei der Photosynthese einer grünen Pflanze erfolgt die Absorption des Lichtes in erster Linie durch die Chlorophylle. Es handelt sich dabei um Farbstoffe (Pigmente), die Licht in einem Wellenlängenbereich unterhalb 480 nm und zwischen 550 und 700 nm absorbieren (Abb. 2.3). Wenn weißes Sonnenlicht auf eine Schicht von Chlorophyll einstrahlt, wird das grüne Licht des Wellenlängenbereiches von 480 bis 550 nm nicht absorbiert, sondern durchgelassen bzw. reflektiert. Daher haben diese Chlorophylle und die Blätter, in denen sie enthalten sind, eine grüne Farbe.

Die Strukturaufklärung des grünen Blattfarbstoff es Chlorophyll durch Richard Willstätter und seine Mitarbeiter, die zwischen 1905 und 1913 in Zürich und Berlin durchgeführt wurde, ist ein Meilenstein in der Geschichte der Chemie. Das Aufsehen, das diese Entdeckung machte, war so groß, dass Richard Willstätter dafür bereits 1915 der Nobelpreis für Chemie verliehen wurde. Es gibt verschiedene Chlorophyllklassen. Abbildung 2.4 zeigt die Strukturformel von Chlorophyll-a und -b. Die Grundstruktur ist ein Ring aus vier Pyrrolen, ein Tetrapyrrol, das auch als Porphyrin bezeichnet wird. Im Zentrum des Ringes befindet sich als Zentralatom ein Mg2+-Ion, das mit zwei N-Atomen kovalent verbunden ist, und mit den anderen beiden N-Atomen eine koordinative Bindung eingeht. Am Ring c schließt sich ein Cyclopentanon an. Chlorophyll-a (Chl-a) und -b (Chl-b) unterscheiden sich lediglich darin, dass im Ring b Chl-a einen Methylrest und Chl-b einen Formylrest besitzt. Dieser geringe Unterschied hat jedoch einen großen Einfluss auf die Lichtabsorption.

Abbildung 2.3 zeigt, dass sich die Absorptionsspektren von Chl-a und -b deutlich voneinander unterscheiden. Eine Propionylgruppe am Ring d ist mit dem Alkohol Phytol verestert. Phytol besteht aus einer langen verzweigten Kohlenwasserstoffkette mit einer Doppelbindung. Es leitet sich von einem Isoprenoid ab (diese Stoffklasse wird in Kapitel 17 näher besprochen), das aus vier Isopreneinheiten gebildet wurde. Dieser lange hydrophobe Kohlenwasser-stoffschwanz verleiht dem Chlorophyll eine hohe Lipidlöslichkeit und begünstigt damit die Anwesenheit in der Membranphase. Chlorophylle kommen stets in Verbindung mit Proteinen vor.
In Pflanzen beträgt das Verhältnis Chl-a zu Chl-b etwa drei zu eins. Nur Chl-a ist Bestandteil der photosynthetischen Reaktionzentren (Kapitel 3) und kann als zentrales Photosynthesepigment angesehen werden. Chl-a absorbiert jedoch in einem weiten Bereich des sichtbaren Spektrums kein Licht. Man spricht von einer Grünlücke. Zumindest zu einem Teil wird diese Lücke durch die Absorption des Chl-b ausgefüllt. Wie in Abschnitt 2.4 gezeigt, kann die vom Chl-b absorbierte Lichtenergie wirksam auf Chl-a übertragen werden. So erhöht die Anwesenheit des Chlorophyll-b die Effizienz der Nutzung der Sonnenenergie für die Pflanze.
Die Chlorophylle haben sich während der Evolution erstaunlich wenig verändert. Die möglicherweise schon vor mehr als drei Milliarden Jahren entstandenen Purpurbakterien haben als Photosynthesepigment ein Bakteriochlorophyll-a, das sich von dem in Abbildung 2.4 gezeigten Chlorophyll-a nur durch die Änderung einer Seitengruppe und das Fehlen einer Doppelbindung unterscheidet. Dies hat allerdings einen großen Einfluss auf die Lichtabsorption: Die beiden Absorptionsmaxima sind nach beiden Seiten verschoben, und die Grünlücke ist dadurch verbreitert. Purpurbakterien können daher für die Photosynthese auch noch Licht im Infrarotbereich nutzen.
Der Tetrapyrrolring im Chlorophyll hat im Verlauf der Evolution aber auch noch ganz andere Funktionen erhalten. Mit Nickel als Zentralatom ist er an der Methanbildung durch Bakterien beteiligt, mit Kobalt (Co) bildet er Cobalamin (Vitamin B12), das an Umlagerungsreaktionen beteiligt ist, bei denen Wasserstoff und organische Gruppen ihren Platz wechseln. Mit Fe2+ statt Mg2+ als Zentralatom bildet der Tetrapyrrolring die Grundstruktur des Häms (Abb. 3.24), das zum einen in Cytochromen als Redoxüberträger bei Elektronentransportprozessen dient (Abschn. 3.7 und 5.5) und zum anderen im Myoglobin oder Hämoglobin bei Aerobiern Sauerstoff speichert beziehungsweise transportiert. Der Tetrapyrrolring im Hämoglobin eines Tieres unterscheidet sich nur geringfügig von dem Tetrapyrrolring von Chlorophyll-a.
Es ist bemerkenswert, wie die Natur eine Substanz, die während der Evolution ursprünglich für eine bestimmte Rolle ausgewählt wurde, dann in fast unveränderter Form auch für gänzlich andere Funktionen einsetzt. Ein Grund für die Variabilität der Funktion einer Substanz wie Chlorophyll oder Häm liegt darin, dass deren Reaktivität von den umgebenden Proteinen wesentlich mitbestimmt wird.
Die Chlorophyllmoleküle befinden sich in Komplexen mit chlorophyllbindenden Proteinen. Im Proteinkomplex kann sich ihr Absorptionsspektrum, verglichen mit dem freier Chlorophylle, verschieben. Das gleiche gilt auch für die in den nächsten Abschnitten behandelten anderen lichtabsorbierenden Substanzen, wie Carotinoide, Xanthophylle und Phycobiline, die ebenfalls gebunden an Proteinen vorkommen. Zur besseren Unterscheidung wird im Folgenden für die freien Substanzen die Bezeichnung Chromophor (griech. „Farbträger") und für die Chromophor-Protein-Komplexe der Begriff Pigment benutzt. Die Bezeichnung des Pigmentes richtet sich oft nach der Wellenlänge des Absorptionsmaximums. Chl-a700 bedeutet ein Pigment des Chl-a mit dem Absorptionsmaximum 700 nm. Eine andere ebenfalls gebräuchliche Bezeichnung wäre P700, diese lässt die Natur des Chromophors offen.

2.3 Die Absorption von Licht führt zur Anregung eines Chlorophyllmoleküls
Was geschieht, wenn ein Chromophor ein Photon absorbiert? Treffen Photonen auf ein Chromophormolekül, das Licht der entsprechenden Wellenlänge absorbieren kann, so wird die Photonenenergie von anregbaren Elektronen des Moleküls aufgenommen. Dies geschieht nach dem Alles-oder-Nichts-Prinzip. Wegen des Erhaltungssatzes der Energie wird dabei die Energie des Chromophormoleküls genau um die Energie des Photons erhöht, das Molekül geht in einen angeregten Zustand über. Die Energie wird nur in diskreten Quanten absorbiert. Daraus resultieren diskrete Anregungszustände. Die Energie, die erforderlich ist, um ein Molekül anzuregen, ist von dessen Struktur abhängig. Es ist ein Charakteristikum von Chromophoren, dass sie viele konjugierte Doppelbindungen enthalten. Im Tetrapyrrolring von Chlorophyll-a befinden sich zehn Doppelbindungen. Wie in Abbildung 2.5 gezeigt, sind zwei Resonanzformen möglich. Die zehn Doppelbindungen sind delokalisiert.

Nach Energieaufnahme kann ein Elektron des konjugierten Systems in ein höheres Orbital angehoben werden. Man bezeichnet diesen Anregungszustand auch als Singulett. Abbildung 2.6 zeigt diesen Vorgang in einer schematischen Darstellung. Die Energie, die erforderlich ist, um das erste Singulett zu erreichen, ist in der Regel um so geringer, je größer die Anzahl der Doppelbindungen des konjugierten Systems ist. Während zum Beispiel Butadien mit nur zwei konjugierten Doppelbindungen energiereiches ultraviolettes Licht zur Anregung benötigt, reicht für die Anregung des Chlorophylls bereits das sehr viel energieärmere, dunkelrote Licht aus. Die Eigenschaften des konjugierten Systems des Tetrapyrrolringes werden durch Seitengruppen beeinflusst. So lassen sich die im vorigen Abschnitt besprochenen Unterschiede in der Lage der Absorptionsmaxima von Chl-a und Chl-b durch die elektronenziehende Wirkung der Carbonyl-seitenkette am Ring b von Chl-b erklären (Abb. 2.5).
Die Absorptionsspektren von Chl-a und Chl-b in Abbildung 2.3 enthalten jeweils zwei Absorptionsmaxima, die weit voneinander entfernt sind. Dies zeigt, dass es für jedes Chlorophyll zwei hauptsächliche Anregungszustände gibt. Kleinere Absorptionsmaxima zeigen, dass es noch weitere Anregungszustände gibt, auf die hier der Einfachheit halber aber nicht eingegangen werden soll. Im Folgenden werden die beiden Hauptanregungszustände als erstes und zweites Singulett bezeichnet (Abb. 2.6). Beim Betrachten der Absorptionsspektren fällt zudem auf, dass die Absorptionsmaxima sehr breit sind. Bei einer hohen Auflösung der Messung würde man sehen, dass sie eine Feinstruktur aufweisen. Sie bestehen aus sehr vielen, dicht nebeneinander liegenden Absorptionslinien. Diese Feinstruktur ist dadurch bedingt, dass die Chlorophyllmoleküle sowohl im Grundzustand als auch in den angeregten Zuständen sich in verschiedenen Rotations- und Schwingungszuständen befinden können. Im Energie-Diagrammschema von Abbildung 2.6 sind diese verschiedenen Niveaus der Rotations- und Schwingungsenergien als feine Linien eingezeichnet und die jeweiligen Grundzustände als dicke Linien.

Wie in dem Schema in Abbildung 2.6 dargestellt, überlappen die Energieniveaus der verschiedenen Rotations- und Schwingungszustände des Grundzustandes mit dem niedrigsten Energieniveau des ersten Singuletts. Analog gibt es auch eine Überlappung des ersten Singuletts mit dem zweiten Singulett. Absorbiert ein Chlorophyllmolekül Licht im Bereich seines Absorptionsmaximums im blauen Licht, wird eines seiner Elektronen in den zweiten Singulettzustand angehoben. Dieser zweittt Singulettzustand ist mit einer Halbwertszeit von 10-12 s zu instabil, als dass seine Energie für chemische Arbeit abgeschöpft werden könnte. Das angeregte Molekül verliert über Rotationen und Schwingungen Energie in Form von Wärme, bis der erste Singulettzustand erreicht ist. Dieser erste Singulettzustand kann alternativ auch durch die Absorption eines energieärmeren Photons (Licht aus dem roten Bereich des Spektrums) erreicht werden. Der erste Singulettzustand ist wesentlich beständiger als der zweite, seine Halbwertszeit beträgt circa 4•10-9 s.

Die Rückkehr des Chlorophyllmoleküls vom ersten Singulettzustand in den Grundzustand kann auf verschiedenen Wegen erfolgen
1. Der wichtigste Weg für die Umsetzung der bei der Rückkehr in den Grundzustand abgegebenen Energiedifferenz ist die Nutzung für chemische Arbeit. Das Chlorophyll überträgt das angeregte Elektron aus dem ersten Singulettzustand auf einen Elektronenakzeptor. Es bleibt ein positiv geladenes Chlorophyllradikal Chl•+ zurück. Dies ist möglich, da angeregte Elektronen weniger stark gebunden sind als im Grundzustand. Wie in Abschnitt 3.5 ausführlich besprochen wird, kann das auf den Akzeptor übertragene Elektron über eine Elektronentransportkette auf das Chl•+-Radikal unter Abschöpfung seiner Energie für chemische Arbeit zurückübertragen werden. Damit kehrt das Chlorophyll-molekül in den Grundzustand zurück. Es ist aber auch möglich, dass die Elektronenlücke des Chl•+-Radikals durch einen anderen Elektronendonor, zum Beispiel Wasser, aufgefüllt wird (Abschn. 3.6).
2. Das angeregte Chlorophyll kann in den Grundzustand zurückkehren, indem es die Anregungsenergie in Form von Licht abgibt. Man nennt diese Lichtstrahlung Fluoreszenz. Ein Teil der Anregungs-energie geht gewöhnlich vorher über Schwingungen und Rotationen als Wärme verloren, weshalb das Fluoreszenzlicht energieärmer (langwelliger) ist als die Energie des Anregungslichtes, die zur Erreichung das ersten Singuletts erforderlich war (Abb. 2.7).

3. Es ist grundsätzlich auch möglich, dass die Rückkehr aus dem ersten Singulett in den Grundzustand durch einen Abstieg über die mit dem Grundzustand überlappenden Niveaus der Rotations- und Schwingungsenergien erfolgt, wobei die Energiedifferenz vollständig als Wärme abgegeben wird.
4. Durch Abgabe eines Teils der Anregungsenergie als Wärme kann das Chlorophyllmolekül in einen anderen Anregungszustand niedrigeren Energiegehaltes übergehen, den so genannten ersten Triplettzustand. Dieser Zustand kann nur vom Singulett aus erreicht werden, nicht durch Anregung vom Grundzustand her. Dabei wird der Spin (der Eigendrehimpuls) des angeregten Elektrons umgekehrt. (Das Wort Triplett rührt daher, dass der ungepaarte Elektronenspin drei Richtungen haben kann.) Wegen der geringen Wahrscheinlichkeit einer Spinumkehr wird der Triplettzustand zwar seltener erreicht, aber insbesondere bei starker Anregung kann ein Teil des Chlorophylls diesen Zustand annehmen. Aus dem Triplettzustand kann das Chlorophyllmolekül unter Aussendung des so genannten Phosphoreszenz-lichtes wieder in den Grundzustand zurückkehren. Dabei ist auch das Phosphoreszenzlicht energieärmer (langwelliger) als das Anregungslicht für den ersten Singulettzustand. Die Rückkehr aus dem Triplettzustand in den Grundzustand erfordert eine Spinumkehr des Elektrons. Da diese wiederum sehr unwahrscheinlich ist, hat der Triplettzustand im Vergleich zum ersten Singulettzustand eine relativ große Lebensdauer (Halbwertszeit 10-4 bis 10-21s). Der Triplettzustand von Chlorophyll hat keine Bedeutung für die Photosynthese per se. Jedoch kann Chlorophyll im Triplettzustand Sauerstoff zu einem Singulettzustand anregen, wodurch der Sauerstoff sehr reaktiv (ROS, reactive oxygen species) wird und dadurch Zellbestandteile schädigt. Wie sich die Pflanze davor schützt, wird in Abschnitt 3.10 besprochen.
5. Die Rückkehr in den Grundzustand kann mit der Anregung eines benachbarten Chromophormoleküls gekoppelt sein. Dieser Transfer wird für die Antennenfunktion benötigt und im Folgenden näher besprochen.

2.4 Für das Einfangen von Licht ist eine Antenne erforderlich
Für die Anregung des photosynthetischen Reaktionszentrums muss ein Photon mit bestimmtem Energieinhalt mit dem Chlorophyllmolekül im Reaktionszentrum reagieren. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Photon genau an dem Ort des Chlorophylls im Reaktionszentrum - und dann noch mit der richtigen Energie - auftrifft, ist äußerst gering. Eine effiziente Photosynthese ist daher nur möglich, wenn die Energie von Photonen verschiedener Wellenlänge über eine gewisse Fläche durch eine so genannte Antenne (Abb. 2.8) eingefangen wird. Auch Radio- oder Fernsehapparate können ja ohne eine vergleichbare Antenne nicht funktionieren.

Die Antenne der Pflanzen besteht aus einer großen Anzahl von an Protein gebundenen Chlorophyllmolekülen, die Photonen absorbieren und deren Energie in die Reaktionszentren weiterleiten. Von den im Blatt vorkommenden Chlorophyllmolekülen sind nur wenige Tausendstel Bestandteil der eigentlichen Reaktionszentren, der Rest ist in den Antennen angeordnet. Dass die meisten Chlorophyllmoleküle sich nicht in den Reaktionszentren befinden, geht bereits aus 1932 von Robert En;terson und William Arnold in den USA gemachten Beobachtungen hervor. Die beiden Forscher belichteten eine Suspension der Grünalge Chlorella mit Lichtblitzen von 10μs Dauer, unterbrochen von Dunkelintervallen von 20ms. Als Maß für die Photosysnthese wurde die Sauerstoffentwicklung untersucht. Die Blitzdauer war so kurz bemessen, dass das Chlorophyll nur einmal einen photosynthetischen Anregungszyklus durchlaufen konnte, und die Lichtintensität wurde so hoch gewählt, dass die Sauerstoffbildung ein Maximum erreichte. Offenbar war der Photosyntheseapparat jetzt mit Photonen gesättigt. Die Analyse des Chlorophyllgehalts der Algensuspension ergab jedoch, dass bei der Sauerstoffentwicklung unter Sättigungsbedingungen nur ein Molekül O2 pro 2400 Chlorophyllmoleküle gebildet wurde.
Die weitere Verfeinerung dieser Experimente durch Emerson in den folgenden Jahren zeigte aber noch ein Weiteres: Bei Blitzen mit sehr niedriger Lichtintensität stieg die Menge an gebildetem Sauerstoff proportional mit der Lichtintensität an. Daraus wurde ein minimaler Quantenbedarf von etwa acht Photonen für die Freisetzung von einem Molekül Sauerstoff ermittelt. Damit war ein langer wissenschaftlicher Streit mit Otto Warburg entschieden, der aus seinen Experimenten einen Quantenbedarf von nur vier Photonen pro entwickeltem Molekül O2 gefordert hatte. Bei dem ermittelten Quantenbedarf von acht Photonen pro gebildetem O2 und der erst später bekannten Tatsache, dass bei der O2-Bildung zwei Reaktionszentren jeweils vier Photonen benötigen, lässt sich aus diesen Ergebnissen von Emerson und Arnold schließen, dass zu einem Reaktionszentrum insgesamt etwa 300 weitere Chlorophyllmoleküle gehören. Diese sind Bestandteil der Antennen.
Zur besseren spektralen Ausnutzung der Photonenenergie in der Grünlücke (Abb. 2.3) enthalten die Antennen noch weitere, so genannte akzessorische Pigmente. Bei höheren Pflanzen sind dies die Carotinoide , vor allem die Xanthophylle. Dazu gehören Lutein, das verwandte Violaxanthin, Neoxanthin sowie Carotin mit ß-Carotin als Hauptvertreter (Abb. 2.9). Eine sehr wichtige Funktion dieser Carotinoide in der Antenne besteht zudem in dem Schutz gegen die Ausbildung des schädlichen Triplettanregungszustandes des Chlorophylls (siehe Abschn. 3.10). Wie am Ende dieses Abschnitts besprochen wird, sind in Cyanobakterien Phycobiline wichtige Bestandteile der Antennen.



Wie wird die Anregungsenergie der in der Antenne eingefangenen Photonen in die Reaktionszentren geleitet?
Für die Energieleitung in den Antennen lässt sich die Möglichkeit eines Transports von Elektronen von Chromophor zu Chromophor im Sinne von Redoxprozessen, wie er im Prinzip in den Elektronentransportketten der Photosynthese und der mitochondrialen Atmung realisiert ist, ausschließen. Ein derartiger Transport wäre mit einer erheblichen Aktivierungsenergie verbunden. Tatsächlich lässt sich eine Weiterleitung der Anregungsenergie in der Antenne auch noch bei der Temperatur von 1K messen. Lichtabsorption und Fluoreszenz finden bei einer derartig tiefen Temperatur noch statt, während enzymatisch katalysierte chemische Prozesse völlig eingefroren sind. Es ist daher naheliegend, dass der Energietransfer in der Antenne nach einem Mechanismus abläuft, der der Lichtabsorption und Fluoreszenz verwandt ist.
Wenn Chromophore, die durch Strahlungsabsorption in angeregte Zustände überführt werden können, räumlich dicht beieinander liegen, besteht die Möglichkeit, dass das Energiepaket des eingestrahlten Photons von einem Chromophor zu einem nächsten Chromophor weiter gereicht wird. So wie ein Quant Strahlungsenergie Photon heißt, bezeichnet man ein Quant Anregungsenergie, das von Molekül zu Molekül weiter gegeben wird, als Exciton. Eine Übertragung von Excitonen setzt voraus, dass die daran beteiligten Chromophoren in spezifischer Weise zueinander ausgerichtet sind. Diese Ausrichtung wird durch Proteine bewirkt. Daher kommen die Chromophore der Antennen auch stets als Proteinkomplexe vor.
Die Antenne bei Pflanzen besteht aus einem äußeren und aus einem inneren Teil (Abb. 2.10). Der äußere Antennenteil, der durch so genannte Lichtsammelkomplexe (engl. light harvesting cqmplexes, LHC) gebildet wird, sammelt das Licht ein. Der innere Teil der Antenne, der aus so genannten Core-Komplexen besteht, ist integraler Bestandteil der Reaktionszentren, er sammelt ebenfalls Licht und leitet die durch den äußeren Antennenteil gesammelten Excitonen in die Photosynthesereaktion.

Die Lichtsammelkomplexe werden durch Polypeptide gebildet, die Chl-a, Chl-b und Xanthophylle beziehungsweise Carotin binden. Diese Proteine- als LHC-Polypeptide- werden im Kern codiert. In einer Pflanze gibt es eine große Vielfalt an LHC-Polypeptiden. Man hat z. B. in der Tomate mindestens 19 verschiedene Gene für LHC-Polypeptide gefunden, die sich untereinander sehr ähnlich sind. Sie sind homolog, das heißt, sie stammen alle von einer gemeinsamen Urform ab. Man spricht von einer Multigenfamilie.
Wie im nächsten Kapitel besprochen wird, enthalten Pflanzen zwei hintereinander geschaltete Reaktionszentren, das Reaktionszentrum von Photosystem II (PSII), welches ein Absorptionsmaximum bei 680 nm hat, und das von Photosystem I (PSI) mit einem Absorptionsmaximum bei 700 nm. Die Funktion dieser Reaktionszentren wird in den Abschnitten 3.6 und 3.8 beschrieben. Beide Photosysteme haben unterschiedliche Lichtsammelkomplexe.

Die Funktion einer Antenne lässt sich besonders gut am Beispiel der Antenne des Photosystems II zeigen
Die Antenne des PSII-Reaktionszentrums enthält hauptsächlich vier Lichtsammelkomplexe: LHC-IIa bis LHC-IId. Hauptkomponente ist LHC-IIb. Es enthält 67 % des gesamten Chlorophylls der PSII-Antenne und ist das am häufigsten vorkommende Protein der Thylakoidmembran überhaupt. Es wurde daher besonders eingehend untersucht. LHC-IIb kommt in der Membran als Trimer vor. Das Monomer (Tab. 2.2) besteht aus einem Polypeptid, das u.a. vier Xanthophyllmoleküle (Tab. 2.2) enthält. Das Polypeptid enthält einen Threoninrest, der unter Vermittlung einer Proteinkinase durch ATP phosphoryliert werden kann. Wie in Abschnitt 3.10 besprochen wird, wird die Aktivität des LHC-II durch Phosphorylierung reguliert.

Es ist gelungen, an dünnen kristallinen Schichten von LHC-IIb-Trimeren mithilfe der Elektronen-Cryo-Mikroskopie bei einer Temperatur von 4 K die räumliche Struktur des LHC-IIb aufzuklären (Abb. 2.11). Das Peptid bildet drei transmembrane Helices. Quer durch die Membran ziehen sich überkreuz die Isoprenoidketten der beiden Luteinmoleküle. Die anderen beiden Xanthophyllmoleküle sind in dem isolierten LHC-Komplex nicht sichtbar. Die Chl-b-Moleküle, deren Absorptionsmaximum im roten Spektralbereich bei einer kürzeren Wellenlänge liegt als das von Chl-a, sind am Rande des Komplexes angeordnet. Von den Chl-a-Molekülen hingegen befindet sich nur eines am Rand und die anderen im Zentrum.

Abbildung 2.12 zeigt in einer Aufsicht die Anordnung der Monomere zu einem Trimer. Das randständige Chl-a vermittelt die Energieübertragung auf benachbarte Trimere oder Reaktionszentren. Diese Trimere sind in der Membran als Oligomere angeordnet, und bilden so die Antenne zur Leitung der eingefangenen Exitonen. In LHC-Ila und LHC-Ilc ist das Chl-a/Chl-b-Verhältnis viel höher als in LHC-IIb. Man nimmt an, dass LHC-IIa und -c zwischen LHC-Ilb und dem Reaktionszentrum angeordnet sind.

Abbildung 2.13 zeigt in einem Schema den Aufbau der PSII-Antenne. Die äußeren Komplexe, die aus LHC-Ilb bestehen, sind in der Peripherie der Antenne angeordnet. Die durch Chl-b in LHC-IIb eingefangenen Excitonen werden auf Chl-a im Zentrum der LHC-IIb-Monomeren, und dann weiter über Chl-a-Kontakte zwischen den Trimeren in die nahen Antennenkomplexe geleitet. Die nahen Komplexe sind über kleinere chlorophylltragende Untereinheiten mit den Core-Komplexen verbunden, welche die Antennenproteine CP 43 und CP 47 enthalten (Abb. 3.22), von denen jedes etwa 15 Chlorophyll-a-Moleküle trägt. Da das Absorptionsmaximum von Chl-b bei einer niedrigeren Wellenlänge liegt als das von Chl-a, ist der Transfer von Excitonen von Chl-b nachChl-a mit einem Verlust an Energie in Form von Wärme verbunden. Dies begünstigt den Excitonenfluss von der Peripherie in das Reaktionszentrum. Durch Phosphorylierung (Abschn. 3.10) kann die Verbindung zwischen den äußeren Lichtsammelkomplexen (LHC-IIb) und dem PSII gelöst werden. Wie in Abschnitt 3 .10 behandelt wird, kann so die effektive Größe der Antenne den Lichtverhältnissen angepasst werden.

Photosystem 1 enthält weniger Lichtsammelkomplexe als Photosystem II (Abschn. 3.8), da dort die Core-Antenne größer ist als in PS II. Die LHC von PSI sind denen von PSII sehr ähnlich.
Es gibt zwei Mechanismen der Excitonenleitung. Je nach den Eigenschaften und der Anordnung der betreffenden Chromophoren kann es entweder dazu kommen, dass sich der Energiegehalt eines angeregten Zustandes über eine ganze Gruppe von Molekülen verteilt (man spricht dann von delokalisierten Excitonen), oder das Exciton ist zwar einem Molekül zugeordnet, kann aber von einem Molekül zu einem etwas entfernteren springen. Man bezeichnet letzteren Vorgang auch als Förster-Mechanismus. Möglicherweise erfolgt die Excitonenleitung zwischen den eng benachbarten Chlorophyllmolekülen innerhalb der Lichtsammelkomplexe über delokalisierte Elektronen und zwischen den einzelnen Lichtsammelkomplexen über den genannten Förster-Mechanismus. Absorptionsmessungen mit ultraschneller Lasertechnik haben gezeigt, dass der Excitonentransfer zwischen zwei Chlorophyllmolekülen im Zeitraum von etwa 0,1 ps (10-13s) erfolgt. Die Geschwindigkeit des Excitonentransfers in der Antenne ist damit viel schneller als die durch die Excitonen (Abschn. 3.4) bewirkte Ladungstrennung im Reaktionszentrum ( rund 3,5 ps). Die Reaktionszentren wirken als Energiefalle für die in der Antenne befindlichen Excitonen.

Durch Phycobilisomen können Cyanobakterien und Rotalgen auch noch bei geringer Lichtintensität Photosynthese betreiben
Cyanobakterien und Rotalgen besitzen Antennenstrukturen, die das Einsammeln sehr geringer Lichtintensitäten ermöglichen. Diese Antennen sind in Form von Partikeln in der Nähe der Reaktionszentren des Photosystems II auf der Membran angeordnet (Abb. 2.14). Diese Partikel, die so genannten Phycobilisomen, bestehen aus Proteinen (Phycobiliproteine), die kovalent an die Phycobiline gebunden sind. Phycobiline sind offenkettige Tetrapyrrole und dadurch strukturell mit den Chlorophyllen verwandt.

Der Name -bilin leitet sich davon ab, dass diese offenkettigen Tetrapyrrole zu den Gallenfarbstoffen gezählt werden (Gallenflüssigkeit, engl. bile). Die Verknüpfung der Phycobiline mit den Proteinen erfolgt über eine Thioetherbindung zwischen einer SH-Gruppe des Proteins und der Vinylseitenkette der Phycobiline. Das Protein Phycoerythrin ist mit dem Chromophor Phycoerythrobilin verknüpft, die Proteine Phycocyanin und Allophycocyanin mit dem Chromophor Phycocyanobilin (Abb. 2.15).

Bei den Phycobiliproteinen besteht die Grundstruktur aus einem Heterodimer, "αß". Jede dieser Untereinheiten besitzt ein bis vier Phycobiline als Chromophor. Drei dieser Heterodimere aggregieren zu einem Trimer (αß3 und bilden so die eigentlichen Bausteine der Phycobilisomen. So genannte Linker-Polypeptide wirken als "Mörtel" zwischen den Bausteinen.
Betrachten wir die Struktur eines Phycobilisoms in Abbildung 2.14: Die Anheftung des Phycobilisoms an die Membran erfolgt durch Verankerungsproteine. Drei Aggregate aus jeweils vier bis fünf (αß3-Einheiten bilden einen Core-Komplex. Dieser enthält das Pigment Allophycocyanin (AP). Daran sind zylindrische, stäbchenartige Strukturen aus jeweils vier bis sechs Bausteinen angeheftet. Die inneren Bausteine enthalten vorwiegend Phycocyanin (PC) und die äußeren Phycoerythrin (PE). Die Bedeutung dieser strukturellen Organisation wird durch die in Abbildung 2.16 gezeigten Absorptionsspektren der verschiedenen Biliproteine illustriert. Durch Phycoerythrin wird in der Peripherie der Stäbchen das kurzwelligere und durch Phycocyanin im inneren Bereich der Stäbchen das langwelligere Licht absorbiert und über den CoreKomplex in das Reaktionszentrum geleitet. Eine räumliche Verteilung zwischen den Pigmenten an der Peripherie, die im kurzwelligen Bereich des Spektrums absorbieren, und den im langwelligen Bereich absorbierenden Pigmenten im Zentrum hatten wir ja auch schon bei den PSII-Antennen höherer Pflanzen im vorigen Abschnitt kennengelernt. Die Besonderheit der Phycobilisomen liegt darin, dass durch die Phycobiliproteine besonders gut grünes Licht absorbiert werden kann (Abb. 2.16). Die Phycobilisomen ermöglichen es dadurch den Rot- und Blaualgen, auch noch tiefere Wasserschichten zu besiedeln, in die nur noch grünes Licht gelangt, das aufgrund der Grünlücke der in den oberen Schichten lebenden Grünalgen nicht absorbiert wurde. Um bei den sehr niedrigen Lichtintensitäten in den unteren Wasserschichten noch Photosynthese betreiben zu können, investieren diese Algen einen sehr hohen Anteil ihrer Zellsubstanz in die Phycobilisomen. Biliproteine können 40 % des gesamten Zellproteins der Algen ausmachen. Diese Organismen müssen also einen außerordentlichen Aufwand für das Sammeln des Lichtes betreiben, um überhaupt noch Licht abzubekommen. nach oben zum Kapitelanfang

3 Die Photosynthese ist ein Elektronentransportprozess
Im vorigen Kapitel wurde beschrieben, wie Photonen durch eine Antenne eingefangen und als Excitonen in die Reaktionszentren geleitet werden. Dieses Kapitel beschäftigt sich mit der Funktion dieser Reaktionszentren. Es soll diskutiert werden, auf welchem Weg die Energie der Photonen in für die Zelle nutzbare chemische Energie umgewandelt wird. Wie im letzten Kapitel gezeigt wurde, hat sich die pflanzliche Photosynthese im Lauf der Evolution aus der bakteriellen Photosynthese entwickelt. Die Grundmechanismen von Photosynthesereaktionen in Bakterien und Pflanzen sind daher sehr ähnlich. Da jedoch bakterielle Reaktionszentren einfacher aufgebaut sind als pflanzliche, und sich zudem auch leichter isolieren lassen, sind Bakterien besonders gut geeignet, um Prinzipien der Photosynthese zu studieren. Wegen ihres Modellcharakters wird bei der Beschreibung der pflanzlichen Photosynthese die bakterielle Photosynthese daher miteinbezogen.

3.1 Photosyntheseapparate sind aus Modulen auf gebaut
Die Photosyntheseapparate von Bakterien sind aus definierten Komplexen zusammengesetzt, die auch als Bausteine des pflanzlichen Photosyntheseapparates auftreten. Wie in Kapitel 5 besprochen wird, sind einige dieser Komplexe auch Bausteine des mitochondrialen Elektronentransports. Manche dieser Komplexe haben zudem eine allgemeine Funktion im bakteriellen Stoffwechsel. Man kann diese Komplexe als Module auffassen, die zu einem frühen Zeitpunkt der Evolution entstanden sind und zu verschiedenen Zwecken in unterschiedlicher Weise kombiniert wurden. Zum besseren Überblick sollen hier zunächst die Funktionen dieser Module bei der Photosynthese summarisch als black boxes behandelt werden. Ihre Struktur und Funktion werden in den nachfolgenden Abschnitten detailliert beschrieben.
Purpurbakterien enthalten nur ein Reaktionszentrum (Abb. 3.1). Durch die Energie des Excitons wird in dem Reaktionszentrum ein Elektron angeregt, das heißt, es wird auf ein höheres Niveau angehoben, wodurch es stärker reduzierend wirkt. Über eine Elektronentransportkette, die aus einem Cytochrom-b/c1-Komplex besteht, gelangt das Elektron wieder in den Grundzustand. Seine Energie wird in Form von chemischer Energie zum Aufbau von Biomasse (Proteine, Kohlenhydrate) genutzt. Die Energiegewinnung beruht darauf, dass mit dem Elektronentransport ein Transport von Protonen über eine Membran gekoppelt ist. Die Energie wird so in Form eines elektrochemischen H+-Potenzials über der Membran gespeichert. Aus diesem Grunde sind photosynthetisches Reaktionszentrum und die Hauptkomponenten des Elektronentransports stets in einer Membran lokalisiert.

Durch eine ATP-Synthase wird die Energie des H+-Potenzials genutzt, um aus ADP und Phosphat ATP zu synthetisieren. Da bei den Purpurbakterien die durch Licht angeregten Elektronen wieder in das Reaktionszentrum zurückfließen, spricht man von einem cyclischen Elektronentransport und einer cyclischen Photophosphorylierung. Die Reduktion von NAD+ erfolgt in den Purpurbakterien durch eine weite:re Elektronentransportkette, den NADH-Dehydrogenase-Komplex. Unter Verbrauch von Energie des H+-Potenzials werden Elektronen von einem Substrat - dies kann eine organische Säure, aber auch Schwefelwasserstoff sein - auf NAD+ übertragen. Das so gebildete NADH dient zusammen mit ATP der Synthese von Biomasse. Eine besondere Bedeutung hat dabei die Synthese von Kohlenhydraten aus CO2 unter Verbrauch von ATP und NADH durch den Calvin-Cyclus (Kapitel 6).
Das Reaktionszentrum der Grünen Schwefelbakterien (Abb. 3.2) ist homolog zu dem der Purpurbakterien, das heißt, dass beide während der Evolution aus einem gemeinsamen Vorläufer gebildet wurden. Auch in den Grünen Schwefelbakterien wird ATP durch cyclischen Elektronentransport gebildet. Die dabei beteiligte Elektronentransportkette (Cytochrom-b/c1-Komplex) und die ATP-Synthase sind denen der Purpurbakterien sehr ähnlich. Ein wesentlicher Unterschied besteht darin, dass in den Grünen Schwefelbakterien NADH durch nichtcyclischeo Elektronentransport gebildet wird. Die angeregten Elektronen werden in diesem Fall in den Ferredoxin-NAD-Reduktase-Komplex geleitet. NAD+ wird über Ferredoxin zu NADH reduziert. Da bei diesem nichtcyclischen Weg das angeregte Elektron nicht in den Ausgangszustand zurückkehrt, bleibt im Reaktionszentrum ein Elektronendefizit bestehen, das durch Elektronendonoren, wie H2S, (das dabei letztendlich zu Sulfat oxidiert wird) aufgefüllt wird.

Cyanobakterien und Pflanzen verwenden Wasser als Elektronendonor (Abb. 3.3). Da dabei Sauerstoff freigesetzt wird, spricht man von oxygener Photosynthese. Dabei sind zwei Photosysteme, die man mit I und II bezeichnet, als Tandem angeordnet. Der Apparat der oxygenen Photosynthese ist aus Modulen aufgebaut, die wir bereits bei der bakteriellen Photosynthese besprochen haben. Das Reaktionszentrum von Photosystem II entspricht in seiner Struktur dem Reaktionszentrum aus Purpurbakterien, und das von Photosystem I dem Reaktionszentrum der Grünen Schwefelbakterien. Die ATP-Synthase und die Ferredoxin-NADP-Reduktase sind den bakteriellen Systemen sehr ähnlich. Die Elektronentransportkette des Cytochrom-b6/f-Komplexes hat die gleiche Grundstruktur wie der Cytochrom-b/c1-Komplex in Bakterien.

Bei der oxygenen Photosynthese sind vier Excitonen erforderlich, um ein Molekül Wasser zu spalten:

Dabei werden die Elektronen auf NADP+ übertragen. Der nichtcyclische Elektronentransport ist mit dem Transport von Protonen gekoppelt. Der so gebildete Protonengradient treibt die Synthese von ATP. Dadurch werden für jedes bei der oxygenen Photosynthese produzierte NADPH gleichzeitig etwa 1,5 Moleküle ATP (siehe Abschn. 4.4) synthetisiert. Dieses ATP und NADPH dient hauptsächlich als Substrat für die photosynthetische CO2 Fixierung zur Bildung von Kohlenhydraten. In Pflanzen findet die oxygene Photosynthese im Chloroplasten statt, einer Zellorganelle, die zu den Plastiden gerechnet wird (siehe Abschn. 1.3).

3.2 Bei der Photosynthese entstehen ein Reduktionsmittel und ein Oxidationsmittel
In der Photosyntheseforschung galt bis Ende der zwanziger Jahre die von Otto Warburg verfochtene Theorie, dass die Energie des Lichtes direkt auf CO2 übertragen wird, und dieses so angeregte CO2 mit Wasser unter Freisetzung von Sauerstoff zu einem Kohlenhydrat reagiert. Otto Warburg postulierte, dass der bei der Photosynthese freigesetzte Sauerstoff aus dem CO2 stammt. Dagegen vertrat der Niederländer Cornelis van Niel 1931 die Ansicht, dass bei der Photosynthese zunächst ein Reduktionsmittel gebildet wird, das in einer nachfolgenden Reaktion (einer Reaktionskette, wie wir heute wissen) mit CO2 reagiert. Van Niel stellte die allgemeine Photosynthesegleichung auf:

Er erkannte damit die Grundreaktion der Photosynthese: Durch Licht erfolgt eine Spaltung einer Substanz H2A in eine reduzierende Komponente (2H) und eine oxidierende Komponente (A). Für die oxygene Photosynthese der Cyanobakterien und Pflanzen gilt:

Demnach stammt der bei der Photosynthese freigesetzte Sauerstoff aus dem Wasser.
Dass bei der Photosynthese tatsächlich ein Reduktionsmittel gebildet wird, bewies Robert Hill 1937 in Cambridge. Es war ihm damals erstmalig gelungen, aus Blättern Chloroplasten zu isolieren, die allerdings keine intakte Hüllmembran besaßen. Sie bestanden also nur aus Thylakoidmembranen. Beim Belichten dieser aufgebrochenen Chloroplasten in Gegenwart von Fe3+-Verbindungen (ursprünglich Ferrioxalat, später Ferricyanid, [Fe(CN6]3- beobachtete er eine Reduktion zu den entsprechenden Ferro-Verbindungen, bei gleichzeitiger Bildung von Sauerstoff:

Da an dieser "Hill-Reaktion" CO2 nicht beteiligt ist, war damit bewiesen, dass die photochemische Spaltung des Wassers von der Reduktion des CO2 getrennt werden kann. Der Gesamtprozess der photosynthetischen CO2-Assimilation lässt sich so in zwei Teilreaktionen trennen:

1. die so genannte Lichtreaktion, bei der durch die Energie der Excitonen unter Spaltung von Wasser Reduktionskraft und chemische Energie (in Form von ATP; siehe Kapitel 4) gewonnen wird, und
2. die so genannte Dunkelreaktion (siehe Kapitel 6), bei der mithilfe dieser Reduktionskraft und des ATP CO2 assimiliert wird.

Eine Beobachtung des Niederländers Louis Duysens im Jahre 1952 erwies sich für die Aufklärung des Photosynthesemechanismus als sehr wichtig: Bei der Bestrahlung von isolierten Membranen der Purpurbakterien Rhodospirillum rubrum mit kurzen Lichtblitzen fand er eine Abnahme der Lichtabsorption bei 890 nm, wobei sich bei Verdunkeln sofort die ursprüngliche Absorption wieder einstellte. Bei dem Purpurbakterium Rhodobacter sphaeroides fand man diesen Effekt bei 870 nm. Ein derartiges "Ausbleichen" eines Pigmentes wurde später auch an Chloroplasten bei 700 nm von Bessel Kok in den USA und bei 680 nm von Horst Witt in Berlin beobachtet. Dieses Ausbleichen wurde als Primärreaktion der Photosynthese erkannt. Die entsprechenden Pigmente der Reaktionszentren bezeichnete man damals P870 (bei R. sphaeroides) und P680 und P700 (bei Chloroplasten). Ein derartiges Ausbleichen konnte auch im Dunkeln durch die Zugabe eines Oxidationsmittels, wie [Fe(CN)6]3- erreicht werden. Daraus war zu entnehmen, dass die durch das Ausbleichen erkennbare Absorptionsänderung der Pigmente auf einem Redoxvorgang beruhte. Dies war ein wichtiger erster Hinweis, dass Chlorophyll oxidiert wird. Durch Elektronenspinresonanz-Messungen wurde gezeigt, dass bei dem Ausbleichen organische Radikale, das heißt Verbindungen mit ungepaarten Elektronen entstehen. Der Ausbleichvorgang war auch noch bei der tiefen Temperatur von 1 K nachweisbar. Dies zeigte, dass bei der Elektronenübertragung, die zur Bildung von Radikalen führt, die Reaktionspartner in so enger Nachbarschaft zueinander angeordnet sind, dass thermische Bewegungen der Reaktionspartner - normalerweise die Voraussetzung für eine chemische Reaktion - für die Reaktion nicht erforderlich sind. Dagegen war die chemische Weiterreaktion der so gebildeten Radikale bei 1 K nicht mehr nachweisbar. Es gab weiterhin Hinweise aus spektroskopischen Messungen, dass an dem primären Redoxvorgang zwei eng benachbarte Chlorophyllmoleküle beteiligt sind, die als special pair bezeichnet wurden.

3.3 Das Konstruktionsprinzip eines photosynthetischen Reaktionszentrums wurde durch Röntgenstrukturanalyse an Purpurbakterien aufgeklärt
Purpurbakterien erwiesen sich als besonders geeignete Untersuchungsobjekte, um Struktur und Funktion eines Photosyntheseapparates aufzuklären. Entscheidend für eine eingehendere Untersuchung bakterieller Reaktionszentren war eine von Roderick Clayton 1970 in den USA ausgearbeitete Methode zur Isolierung der Reaktionszentren aus Purpurbakterien. Die Analyse der Bestandteile der Reaktionszentren verschiedener Purpurbakterien - gezeigt in Tabelle 3.1 am Beispiel von Rhodobacter sphaeroides - ergab bei allen Purpurbakterien einen prinzipiell gleichen Aufbau.

Die Minimalstruktur eines bakteriellen Reaktionszentrums besteht aus den drei Untereinheiten L, M und H (light, medium, heavy). Die Untereinheiten L und M sind Peptide mit ähnlicher Aminosäuresequenz, sie sind homolog. Das Reaktionszentrum von R. sphaeroides enthält vier Bacteriochlorophyll a (BChl-a, Abbildung 3.4) sowie zwei Bacteriophaeophytin a (BPhe-a).

Phaeophytine unterscheiden sich von Chlorophyllen nur darin, dass sie kein Magnesium als Zentralatom enthalten. Ferner enthält das Reaktionszentrum ein Eisenatom, das nicht Bestandteil eines Häms ist. Man spricht daher von einem Nichthäm-Eisen. Dazu besitzt das Reaktionszentrum zwei Ubichinonrnoleküle (Abb. 3.5), die als QA und QB bezeichnet werden (Q ist die Abkürzung von quinone, der englischen Bezeichnung von Chinon). QA ist stets fest an das Reaktionszentrum gebunden, QB nur lose assoziiert.


Röntgenstrukturanalyse
Wenn es gelingt, von einem Protein geordnete Kristalle herzustellen, kann man durch Röntgenstrukturanalyse den räumlichen Aufbau des Proteinmoleküls ermitteln. In ähnlicher Weise kann durch Elektronen-Cryo-Mikroskopie eine Strukturanalyse auch an kristallinen Molekülschichten durchgeführt werden (Abschn. 2.4) . Allerdings ist hier der experimentelle Aufwand viel höher. Bei der Röntgenstrukturanalyse wird ein Proteinkristall mit einer Röntgenquelle bestrahlt. Die Elektronen der einzelnen Atome der Moleküle bewirken eine Beugung der auftretenden Röntgenstrahlen. Durch die regelmäßig im Kristall angeordneten Moleküle findet eine Interferenz der gebeugten Röntgenstrahlen statt. Das entsprechende Interferenzmuster, das aus vielen Einzelreflexen besteht, wird mithilfe eines hinter dem Kristall befindlichen Röntgenfilms oder eines anderen Detektors gemessen. Abbildung 3.6 zeigt das Prinzip. Um möglichst viele Reflexe zu messen, wird der Kristall, der in einer Kapillare montiert ist, gedreht. Für einen "Datensatz" werden je nach Kristallform und Größe des Kristallgitters wenige Dutzend bis einige Hundert Rotationsaufnahmen benötigt. Zur Ermittlung einer neuen Proteinstruktur werden zusätzlich mehrere Datensätze, bei denen das Protein durch Einbau oder Bindung eines Schweratoms verändert worden ist, herangezogen. Aus der Kenntnis der Regeln der Beugung der Röntgenstrahlen an Atomen verschiedener Elektronendichte lässt sich aus den Aufnahmen mithilfe aufwendiger Computerprogramme die räumliche Struktur des bestrahlten Moleküls rekonstruieren.

Wenngleich die Röntgenstrukturanalyse einen sehr großen technischen Aufwand und dazu auch noch einen sehr großen Zeitaufwand erfordert, so ist bei der Analyse von Proteinmolekülen in der Regel die Gewinnung brauchbarer Einkristalle ein begrenzender Faktor. Dies gilt in besonderem Maße für Membranproteine. Bis 1980 hatte man es für unmöglich gehalten, dass man aus hydrophoben Membranproteinen für die Strukturanalyse brauchbare Kristalle herstellen kann. Einen Durchbruch brachte die Verwendung des Detergens N,N'-Dimethyldodecylamin-N-oxid (Abb. 3.7), das mit Membranproteinen wasserlösliche Protein-Detergens-Mizellen bildet, die beispielsweise durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder Polyethylenglycol zur Kristallisation gebracht werden können.

In diesen Kristallen sind die Mizellen regelmäßig angeordnet (Abb. 3.8). Da die hydrophoben Bereiche der Membranproteine, die normalerweise an die hydrophobe Membranphase grenzen, in diesen Kristallen mit den hydrophoben Ketten des Detergens besetzt sind, bewahrt das Protein im Kristall seinen nativen Zustand.

Es gelang so Hartmut Michel am Max-Planck-Institut für Biochemie in München, Kristalle von dem Reaktionszentrum des Purpurbakteriums Rhodopseudomonas viridis zu gewinnen und zusammen mit seinem Kollegen Johann Deisenhofer aus der Abteilung Robert Hubers die Röntgenstrukturanalyse durchzuführen. Den immensen Aufwand dieser Untersuchungen illustriert die Tatsache, dass allein die Auswertung der gespeicherten Daten der Aufnahmen zweieinhalb Jahre in Anspruch nahm. Die Aufklärung der Struktur eines photosynthetischen Reaktionszentrums, und damit des ersten Membranproteins überhaupt, durch das Münchener Team hat sehr große Beachtung gefunden. Die drei Forscher wurden für diese Leistung 1988 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet. Als mit der gleichen Methode die Struktur des Reaktionszentrums von Rhodobacter sphaeroides analysiert wurde, zeigte sich, dass die Grundstruktur der beiden Reaktionszentren eine erstaunliche Ähnlichkeit aufweist.

Das Reaktionszentrum von Rhodopseudomonas viridis ist symmetrisch auf gebaut
Abbildung 3.9 zeigt die räumliche Struktur des Reaktionszentrums des Purpurbakteriums Rhodopseudomonas viridis. Das Molekül hat eine längliche Form. Die Länge beträgt 8 nm. Die homologen Untereinheiten L (rot) und M (schwarz) lassen sich durch eine Drehung von 180° um eine Symmetrieachse ineinander überführen. Sie bilden zusammen eine Tasche und umschließen die Chlorophyll- und Phaeophytinmoleküle. Diese Chromophore sind als Drahtmodelle in der Abbildung gezeigt. An der unteren Seite des Zylinders befindet sich die H-Untereinheit wie ein Deckel.

In gleicher Projektion wie Abbildung 3.9 zeigt Abbildung 3.10 die Lage der Chromophoren in dem Proteinmolekül. Alle Chromophore treten paarweise entlang der Symmetrieachse auf In dem Bild sind oben zwei BChl-a-Moleküle (DM, DL) zu erkennen. Sie liegen so nahe beieinander, dass sich im angeregten Zustand ihre Orbitale überlappen. Die Entfernung zwischen den beiden Tetrapyrrolringen beträgt lediglich 0,3 nm. Damit war bestätigt, dass das special pair der Chlorophyllmoleküle, das aufgrund spektroskopischer Untersuchungen als Ort des primären Redoxvorganges bei der Photosynthese postuliert worden war, auch tatsächlich existiert. Unter diesem Chlorophyllpaarsind die Chromophore in zwei annähernd symmetrischen Ästen angeordnet.

Dicht unter dem Paar befinden sich zu beiden Seiten die restlichen beiden BChl-a-Moleküle (BA, BB) als Monomere, unter diesen dann jeweils ein Bacteriophaeophytin (ΦA, ΦB) . Während das Chlorophyllpaar (DM, DL) von den Untereinheiten L und M gemeinsam gebunden wird, sind Chlorophyll BA und Phaeophytin ΦA vorwiegend mit der Untereinheit L, und BB und ΦB mit der Untereinheit M assoziiert. Der Chinonring von QA wird durch Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechsel-wirkungen an die Untereinheit M gebunden, während sich die Bindungsstelle für das lose assoziierte QB an der Untereinheit L befindet.

3.4 Wie funktioniert das Reaktionszentrum?
Aus der Kenntnis der Struktur des Reaktionszentrums und dem Ergebnis umfangreicher kinetischer Untersuchungen des Reaktionszentrums, zu denen unter anderem Absorptions- und Fluoreszenzspektroskopie nach Lichtblitzen im Bereich von bis zu weniger als 10-13 s, sowie Kern- und ElektronenspinResonanz-Messungen herangezogen wurden, können wir uns jetzt ein Bild über die Funktion des bakteriellen Reaktionszentrums machen. Obgleich das Reaktionszentrum eine Symmetrie mit zwei fast identischen Ästen aufweist, verläuft der Elektronentransfer nur über den rechten Ast in Abbildung 3.10. Das Chlorophyllmonomer BB auf der M-Seite steht in engem Kontakt miteinem Carotinoidmolekül. Dadurch kann ein durch Fehlfunktion gebildeter Triplettzustand des Chlorophyllpaares wieder in den Grundzustand übergehen (siehe Abschn. 2.3 und 3.7). Die Bedeutung des Phaeophytins (ΦB) im linken Ast und auch die Funktion des Nichthäm-Eisens sind noch unklar.
Abbildung 3.11 zeigt die Funktion des Reaktionszentrums in einer schematischen Darstellung, bei der die Partner ungefähr nach ihrem elektrochemischen Potenzial angeordnet sind. Die primäre Reaktion des Reaktionszentrums mit dem durch die Antenne angelieferten Exciton (Abschn. 2.4) besteht in einer Anregung des Chlorophyllpaares. Dieser primäre Zustand hat eine nur sehr kurze Lebensdauer, innerhalb von drei Picosekunden wird durch das Phaeophytin (BPhe) über eine große Potenzialdifferenz ein Elektron "abgesaugt".

Wahrscheinlich wird das Elektron zunächst auf das BChl-Monomer (BA) übertragen und erst dann auf das Phaeophytinmolekül (ΦB). Der zweite Elektronentransfer erfolgt mit einer Halbwertszeit von 0,9 ps etwa viermal so schnell wie der zu BA und wurde daher lange nicht erkannt. Das so gebildete Phaeophytinradikal tendiert dazu , dieses Elektron wieder zurückzugeben. Um dem zuvorzukommen, wird - ausgelöst durch eine hohe Potenzialdifferenz - das Elektron des Phaeophytinradikals innerhalb von 200 ps auf ein Chinon (QA (Abbildung 3.11) abgezogen. Das daraus resultierende Semichinonradikal überträgt durch eine weitere Potenzialdifferenz sein Elektron auf das lose gebundene Ubichinon (QB) (Abb. 3.12).

QB kann im Gegensatz zu QA zwei Elektronen aufnehmen. Es wird zunächst durch ein Elektron zu Ubisemichinon reduziert und nach erneuter Anregung des Reaktionszentrums und die erneute Bildung eines Semichinonradikals durch ein weiteres Elektron unter Aufnahme von Protonen weiter zu Ubihydrochinon reduziert. Die Bildung des Ubihydrochinons dauert insgesamt 100 μs. Ubihydrochinon ist im Gegensatz zu den sehr instabilen radikalischen Zwischenprodukten des bislang besprochenen Weges ein stabiles Reduktionsmittel. Diese Stabilität hat aber auch ihren Preis: Für die Bildung des Ubihydrochinons als erstes stabiles Produkt aus dem primären Anregungsstand des Chlorophylls sind mehr als die Hälfte der Energie der Excitonen als Wärme verloren gegangen.

Ubichinon trägt eine lsoprenoidseitenkette (Abb. 3.5). Ubichinon ist daher lipophil und in der Lipidphase der Photosynthesemembran sehr gut löslich. Diesen Effekt einer Isoprenoidseitenkette haben wir bereits bei Chlorophyll (Abschn. 2.2) kennengelernt. Im Gegensatz zu Chlorophyll, Phaeophytin und QA, die in der Membran fest an Proteine gebunden sind, kann das im Reaktionszentrum liegende Ubihydrochinon (QB) gegen Ubichinon ausgetauscht werden. Das Ubihydrochinon bleibt in der Membranphase und kann sich darin durch Diffusion bewegen. Es dient so als Transportmetabolit für Reduktionsäquivalente in der Membranphase. Es speist die Elektronen in den ebenfalls in der Membran liegenden Cytochrom-b/c1-Komplex ein, durch den die Elektronen über Cytochrom-c in das Reaktionszentrum zurückgeleitet werden. Dabei wird Energie zur Ausbildung eines Protonenpotenzials (siehe Abschn. 4.1) abgeschöpft, welches zur ATP-Synthese genutzt wird. Aufbau und Mechanismus des Cytochrom~b/c1-Komplexes und des Enzymapparates der ATP-Synthese werden im Zusammenhang mit der pflanzlichen Photosynthese in Abschnitt 3.7 und Kapitel 4 besprochen.
Der am Beispiel der Purpurbakterien gezeigte cyclische Elektronentransport der Photosynthese lässt sich durch ein einfaches Schaltschema zusammenfassen (Abb. 3.13). Das Chlorophyllpaar und das Phaeophytin, zwischen denen durch Lichtenergie ein Elektron übertragen wird, verhalten sich wie die Platten eines geladenen Kondensators, zwischen denen eine Spannung aufgebaut wird. Diese Spannung treibt einen Elektronenfluss, einen Strom. Der Spannungsabfall erfolgt zunächst über einen Widerstand, bei dem ein sehr großer Teil der Elektronenenergie irreversibel in Wärme umgewandelt wird. Dieser erste Spannungsabfall wirkt als Elektronenfalle: Er sorgt dafür, dass die Elektronen schnell von dem Kondensator abgezogen werden. Nach diesem Widerstand ist ein Generator geschaltet, der die verbleibende Spannung zur Leistung von Arbeit ausnutzt.

Bei der Photosynthese in Algen und Pflanzen sind zwei photosynthetische Reaktionszentren hintereinandergeschaltet
Wie in Abschnitt 2.4 besprochen, wurde für die photosynthetische Wasserspaltung durch Grünalgen ein Quantenbedarf (absorbierte Photonen pro gebildetem Molekül O2) von etwa acht ermittelt. Statt dem Begriff Quantenbedarf benutzt man auch den reziproken Begriff Quantenausbeute (produzierte Moleküle O2 pro absorbiertem Photon). Bei der Untersuchung der Abhängigkeit der Quantenausbeute von der Farbe des eingestrahlten Lichtes - man bezeichnet dies als Wirkungsspektrum - zeigte es sich, dass mit rotem Licht oberhalb einer Wellenlänge von 680 nm die Quantenausbeute sehr steil abfällt (Abb. 3.14). Dieser als red drop bezeichnete Effekt blieb zunächst rätselhaft, da in den Algen Chlorophylle vorhanden sind, die bei 700 nm Licht absorbieren. Der Amerikaner Robert Emerson und seine Mitarbeiter beobachteten 1957, dass die Quantenausbeute im Spektralbereich oberhalb von 680 nm dramatisch zunimmt, wenn zusätzlich zu dem langwelligen Rotlicht auch hellrotes Licht von 650 nm eingestrahlt wurde. Die Quantenausbeute bei gemeinsamer Einstrahlung war höher als die Summe der Ausbeuten, die man erhält, wenn man beide Wellenlängen separat einstrahlt.

Aus diesem Emerson-Effekt wurde geschlossen, dass an der Photosynthese der Grünalgen (und auch der Cyanobakterien und Pflanzen) zwei verschiedene Photosysteme, die aus Antennen und Reaktionszentren bestehen, beteiligt sind. Robert Hill und Fay Bendall postulierten 1960 ein Reaktionsschema (Abb. 3.15), bei dem zwei Photosysteme in Serie geschaltet sind, die durch eine Elektronentransportkette mit den Cytochromen-b6 und dem Cytochrom-f (einem Cytochrom des c-Typs) verbunden sind (Abschn. 3.7). Für die Anregung des einen Reaktionszentrnms sind Antennen verantwortlich, die noch bei 700 nm absorbieren, während für die Anregung des anderen Reaktionszentrums vorwiegend Antennen verantwortlich sind, die höher energetisches, also kurzwelligeres Licht (unter 680 nm) absorbieren. Die Auftragung der Reaktionsfolge nach den Redoxpotenzialen ergibt einen Zickzack- Verlauf, man spricht daher von einem Z-Schema. Die Nummerierung der Photosysteme wurde nach der Reihenfolge ihrer Entdeckung vorgenommen. Das Photosystem II (PS II) hat sein Wirkungsoptimum bei einer Wellenlänge von 680 mn, und Photosystem 1 bei 700 mn. Die Hintereinanderschaltung der beiden Photosysteme sorgt dafür, dass am PS II ein sehr starkes Oxidationsmittel zur Oxidation des Wassers und am PS 1 ein sehr starkes Reduktionsmittel zur Reduktion des NADP+ erzeugt wird.

Abbildung 3.16 gibt einen Überblick über den Elektronentransport der Photosynthesekomplexe, wobei die Trägersubstanzen (Carrier) des Elektronentransports wie in Abbildung 3.11 nach den elektrischen Potenzialen angeordnet sind.

Abbildung 3.17 zeigt die Anordnung der Photosynthesekomplexe in der Thylakoidmembran. Zwischen der Oxidation des Wassers und der Reduktion des NADP+ besteht eine Potenzialdifferenz von etwa 1,2 Volt. Die zwei absorbierten Photonen von 680 und 700 nm entsprechen insgesamt einer Potenzialdifferenz von 3,45 Volt (Abschn. 2.2, Gleichung 2.7). Es wird also nur etwas mehr als ein Drittel der Energie des in den Photosystemen absorbierten Lichtes dazu genutzt, um Elektronen vom Wasser auf NADP+ zu übertragen. Zusätzlich wird etwa ein Achtel der von beiden Photosystemen absorbierten Lichtenergie dazu verwendet, um über PS II und den Cytochrom-b6/f-Komplex Abbildung 3.17 Protonen in das Lumen der Thylakoide zu pumpen. Dieser Protonentransport führt zur Bildung eines Protonengradienten zwischen dem Lumen und dem Stromaraum. Eine H+-ATP-Synthase, die ebenfalls in der Thylakoidmembran lokalisiert ist, nutzt die Energie des Protonengradienten zur Synthese von ATP.

Demnach wird etwa die Hälfte der Energie der von beiden Reaktionszentren übernommenen Excitonen nicht zur Leistung von Arbeit genutzt, sondern geht als Wärme verloren. Im vorigen Abschnitt wurde die Bedeutung dieses Wärmeüberganges bei der Photosynthese am Beispiel der Purpurbakterien ausführlich besprochen.

3.5 Durch Photosystem II wird Wasser gespalten
Die dreidimensionale Struktur des PSII wurde erstmalig von den Arbeitsgruppen Horst Witt und Wolfram Saenger (beide in Berlin) durch eine hochauflösende Röntgenstrukturanalyse von Kristallen des PSII aus dem thermophilen Cyanobakterium Thermosynechococcus elongatus aufgeklärt. Es zeigt sich dabei, dass PSII, und wie später gezeigt auch PSI, nach dem gleichen Grundprinzip aufgebaut sind wie das in Abschnitt 3.4 besprochene Reaktionszentrum der Purpurbakterien. Hieraus, und auch aus Sequenzanalysen der beteiligten Proteine gebt klar hervor, dass alle diese Photosysteme von einer gemeinsamen Urform abstammen. So befindet sich auch in PSII ein Chl-a-Paar im Zentrum, wobei allerdings der Abstand zwischen den beiden Molekülen so groß ist, dass bei der Anregung durch ein Exciton wahrscheinlich nur eines der beiden Chl-a-Moleküle allein reagiert. Von diesem zentralen Paar leiten sich wie in Abbildung 3.19 zwei Arme mit je einem Chl-a und einem Phaeophytin (einem spezialisierten Chlorophyllmolekül ohne Mg2+ als Zentralatom) ab. Wie bei den Purpurbakterien läuft der Elektronentransport nur über einen dieser Arme.
Im Gegensatz zum bakteriellen Reaktionszentrum wird nach Anregung durch ein Exciton ein Elektron vom Chl-a-Monomer des Reaktionszentrums auf Phaeophytin (Phe) abgegeben. Phe überträgt sein Elektron dann weiter auf ein festgebundenes Plastochinon (QA (Abb. 3.18). Dabei entsteht ein Semichinonradikal. Das Elektron wird dann auf ein locker gebundenes Plastochinon (QB) übertragen.

Dieses Plastochinon (PQ) Abbildung 3.19 nimmt nacheinander insgesamt zwei Elektronen sowie zwei Protonen auf und wird dadurch zu einem Hydrochinon (PQH2) reduziert. Das Hydrochinon wird von dem Photosynthesekomplex freigesetzt und bildet so das eigentliche Produkt des Photosystems II. Dieser Übergang von der Einzelelektronenübertragung zwischen dem (Ch1-a)2 und QA und der Zweielektronenübertragung zwischen QA und QB entspricht dem Reaktionsablauf bei R. sphaeroides mit dem Unterschied, dass die Chinone in den Bakterien Ubichinon oder Menachinon und im PS II Plastochinon sind.
Die Ähnlichkeit des Reaktionsablaufes im PS II und im Photosystem der Purpurbakterien betrifft aber nur den Elektronenakzeptorbereich. Die Elektronendonorfunktion im PS II ist anders als bei Purpurbakterien. Die durch den nichtcyclischen Elektronentransport entstehende Elektronenlücke in (Chl-a)•2+ wird durch Elektronen, die vom Wasser abgezogen werden, aufgefüllt. Es wird so Wasser zu O2 oxidiert. Am Transport der Elektronen von Wasser auf Chlorophyll sind Mangan-Ionen und ein Tyrosinrest beteiligt. Das (Chl-a)•2+-Radikal mit einem Redoxpotenzial von etwa +1,1 Volt ist ein so starkes Oxidationsmittel, dass es einem Tyrosinrest des Reaktionszentrums ein Elektron entreißen kann. Es entsteht ein Tyrosinradikal. Dieser reaktive Tyrosinrest wird in der Literatur auch mit "Z" bezeichnet. Die Elektronenlücke im Tyrosinradikal wird durch die Oxidation eines Mangan-Ions aufgefüllt (Abb. 3.20). Der PS-II-Komplex enthält mehrere Mn-Ionen - wahrscheinlich vier - , die dicht nebeneinander angeordnet sind. Man spricht von einem Mn-Cluster. Das Mn-Cluster stellt ein Redoxsystem dar, das insgesamt vier Elektronen aufnehmen und wieder abgeben kann. Dabei wechseln die Mn-Ionen wahrscheinlich zwischen den Oxidationsstufen Mn3+ und Mn4+.

Die Freisetzung von einem Molekül O2 aus Wasser erfordert die Abgabe von vier Elektronen und damit das Einfängen von vier Excitonen. Je nach Belichtungsstärke sind die Zeitabstände zwischen dem Eintreffen der Excitonen im Reaktionszentrum unterschiedlich. Wenn die Oxidation des Wassers schrittweise erfolgte, würden insbesondere bei niedrigen Lichtintensitäten Sauerstoffradikale als Zwischenprodukte entstehen. Sauerstoffradikale wirken auf Biomoleküle wie Proteine und Lipide stark zerstörend. Der Wasserspaltungsapparat des Mn-Clusters minimiert die Bildung radikalischer Zwischenstufen des Sauerstoffs, indem von dem Cluster nach Bedarf zunächst vier Elektronen nacheinander über das Tyrosin in das Reaktionszentrum abgegeben werden (Abb. 3.20). Das Mn-Cluster durchläuft dabei nach dem Grundzustand vier verschiedene Oxidationsstufen (diese werden auch als S0 und S1 bis S4 bezeichnet).
Das Vorhandensein dieser fünf verschiedenen Oxidationsstufen des Wasserspaltungsapparates geht aus Experimenten von Pierre Joliot und Bessel Kok hervor (Abb. 3.21).

Bei der Belichtung von vorher dunkel gehaltenen Chloroplasten durch eine Serie von Lichtblitzen wurde eine Oszillation der O2-Freisetzung beobachtet. Während nach den ersten beiden Blitzen fast kein O2 freigesetzt wird, erfolgt die größte O2-Freisetzung nach drei Blitzen, dann nach weiteren vier Blitzen und so weiter. Allerdings wird bei steigender Blitzzahl die Oszillation immer stärker gedämpft. Diese Dämpfung lässt sich dadurch erklären, dass manche Blitze keine Anregung des PS II verursachen und so die Oszillation desynchronisiert wird. Der Wasserspaltungsapparat in den Chloroplasten liegt im Dunkeln offenbar im Zustand S1 vor. Nach Erreichen der vierten Oxidationsstufe (S4) wird O2 in einer Reaktion freigesetzt, und das Mn-Cluster kehrt wieder in den Grundzustand zurück. Bei diesem Prozess werden die aus dem Wasser gebildeten Protonen in das Lumen der Thylakoide abgegeben. Formal kann die Reaktion wie folgt beschrieben werden:

Bildlich gesprochen wird durch den Mn-Cluster der Bedarf von vier Elektronen im Reaktionszentrum vorfinanziert, um dann in einem Schlag durch die Oxidation des Wassers beglichen zu werden. Dadurch dürfte das Mn-Cluster einen wichtigen Beitrag zur Verringerung der Bildung von O-Radikalen bei der Photosynthese liefern. Trotz dieser Verminderung ist die Bildung von O-Radikalen im PS-II-Komplex jedoch immer noch groß genug, um eine schädigende Wirkung auf Proteine des Komplexes zu haben. Die Auswirkungen dieser Schädigung werden in Abschnitt 3.10 näher besprochen.

Der Photosystem-II-Komplex ist dem Reaktionszentrum in Purpurbakterien sehr ähnlich
Der Enzymapparat des PS II ist in einem Komplex angeordnet, der aus mindestens 20 verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt ist (Tabelle 3.2), von denen zwei das eigentliche Reaktionszentrum darstellen.

Das in Abb. 3.22 gezeigte Schema des PS-II-Komplexes beschränken sich daher auf nur einige Untereinheiten (Tabelle 3.2). Der PS-II-Komplex ist von einer Antenne, bestehend aus Lichtsammelkomplexen (Abb. 2.13) umgeben.
Das Zentrum des PS-II-Komplexes ist ein Heterodimer aus den Untereinheiten D1 und D2. An diesem Heterodimer findet man sechs Chl-a-Moleküle, zwei Phaeophytine, zwei Plastochinone und ein bis zwei Carotinoide gebunden. D1- und D2 Protein sind zueinander und auch zu den L- und M-Proteinen aus den Reaktionszentren der Purpurbakterien {Abscbn. 2.4) homolog. Wie bei den Purpurbakterien ist auch beim PS II nur das an D1-Protein gebundene Phaeophytinmolekül am Elektronentransport beteiligt. QA ist hingegen an das D2-Protein gebunden und QB wiederum an das D1-Protein. Das Mn-Cluster wird wahrscheinlich von den D1- und D2-Proteinen zusammengehalten. Das bei der Elektronenübertragung reaktive Tyrosin ist ein Bestandteil von D1. Die Untereinheiten O,P,Q stabilisieren den Mn-Cluster. Die beiden Untereinheiten CP 43 und CP 47 (CP steht für Chlorophyll-Protein) binden jeweils etwa 15 Chlorophyllmoleküle und bilden den in Abbildung 2.10 gezeigten Core-Komplex der Antenne. CP 43 und CP 47 flankieren beide Seiten des D1-D-Komplexes. Cyt-b 559 ist für den Elektronentransport im PS II nicht essenziell, möglicherweise besitzt es eine Schutzfunktion gegen eine Lichtschädigung des PS-II-Komplexes. In der Peripherie sind die Lichtsammelkomplexe des LHC II angeordnet, nämlich die Chlorophyllbindenden Proteine Lhcb 4-6 und Lhcb 1-3.

Das D1-Protein unterliegt einem hohen Turnover, es wird ständig neu synthetisiert. Offenbar verschleißt das D1-Protein während seiner Funktion, möglicherweise verursacht durch Sauerstoff-Radikale, die trotz aller Schutzmechanismen immer noch auftreten. Man hat überschlagen, dass ein D1-Protein im Mittel nach 106-107 katalytischen Zyklen des Reaktionszentrums von PSII ersetzt wird. Eine Reihe von Substanzen, deren Struktur dem Plastochinon ähnlich ist, binden an das D1-Protein und verursachen dadurch eine Hemmung der Photosynthese. Diese Substanzen finden Verwendung als Herbizide. Vor einer Besprechung dieser Substanzen wollen wir kurz auf die Anwendung von Herbiziden eingehen.

Maschinelle Landwirtschaft erfordert zumeist den Einsatz von Herbiziden
Von den weltweit produzierten Pflanzenschutzmitteln entfallen umsatzmäßig etwa die Hälfte auf Herbizide - Mittel zur Bekämpfung von Unkräutern. Die Unkrautbekämpfung in der Landwirtschaft dient nicht nur der Eindämmung von Ertragsverlusten durch Unkrautkonkurrenz. Unkrautfreie Äcker sind auch Voraussetzung für eine mechanisierte Landwirtschaft, da bei hohem Unkrautbesatz eine maschinelle Ernte stark behindert ist oder sogar unmöglich sein kann. Einer der wesentlichen Gründe für die große Bedeutung der Herbizide in der Landwirtschaft der Industrieländer sind die Kosten der menschlichen Arbeitskraft. Ein Feld lässt sich billiger mit Herbiziden als mit menschlicher Arbeitskraft unkrautfrei halten.
Man verwendet als Herbizide verschiedenartige Substanzen, die essenzielle Reaktionen des Pflanzenstoffwechsels blockieren und eine möglichst geringe toxische Wirkung gegenüber Tieren (und damit auch gegenüber den Menschen) aufweisen. Eine große Anzahl von Herbiziden (Beispiele werden am Ende dieses Abschnitts gegeben) wirken dadurch, dass sie als Plastochinon-Antagonisten das Photosystem II hemmen. Um hierbei eine Wirkung zu erzielen, muss das Herbizidmolekül an die Mehrzahl der sehr vielen Photosynthesezentren gebunden werden. Die Aufwandmenge für diese Herbizide beträgt zwischen 125 und 4000 g pro Hektar.
Im Bestreben, den Eintrag von Herbiziden möglichst gering zu halten, haben sich in zunehmendem Maße Herbizide durchgesetzt, die in Biosynthesereaktionen, wie der Synthese von Fettsäuren, bestimmter Aminosäuren, Carotinoiden oder Chlorophyll, eingreifen. Auch gibt es Herbizide, die als Phytohormonanalogon oder als Mitosehemmer wirken. Bei diesen Herbiziden kann die Bindung von relativ wenigen Molekülen bereits eine starke Wirkung erzielen, bei manchen reicht eine Auftragsmenge von nur 5 g pro Hektar aus. Es gibt Herbizide, die nur durch die Wurzeln, und andere, die über die Blätter auf genommen werden.
Zur Verwendung von Herbiziden gibt es verschiedene Strategien. Um beispielsweise Gleiskörper der Bahn unkrautfrei zu halten, verwendet man Totalherbizide, das heißt, Herbizide, die die gesamte Vegetation vernichten. In diesem Fall benutzt man oft Herbizide, die nur langsam abgebaut und über die Wurzeln aufgenommen werden. Totalherbizide werden aber auch in der Landwirtschaft verwendet, um beispielsweise Citrusplantagen unkrautfrei zu halten. Hierbei werden jedoch Herbizide verwendet, die nur durch die Blätter aufgenommen werden. Von ganz besonderem Interesse sind selektive Herbizide, die nur die Unkräuter und möglichst nicht die Kulturpflanzen treffen Absehn. 12.2 (, 15.3, 19.1). Eine Selektivität kann unterschiedliche Ursachen haben, zum Beispiel Unterschiede zwischen der Aufnahme der Herbizide in die verschiedenen Pflanzen, zwischen der Empfindlichkeit des Stoffwechsels gegenüber den Herbiziden oder auch zwischen der Fähigkeit der Pflanzen, diese Fremdstoffe zu entgiften. Wichtige pflanzliche Mechanismen zur Entgiftung von Herbiziden und anderen Fremdstoffen (Xenobiotica) sind die Einführung von Hydroxylgruppen durch P450-Monooxigenasen (Abschn. 18.2) und die Bildung von Glutathionkonjugaten (Abschn. 12.2). Selektive Herbizide haben unter anderem den Vorteil, dass man die Unkräuter je nach Bedarf erst zu einem späteren Wachstumsstadium der Nutzpflanzen vernichtet, und dass so die abgestorbenen Unkräuter eine wassersparende und erosionsvermeidende Mulchschicht bilden können.
Wie an einem Beispiel in Abschnitt 10.4 gezeigt wird, ist es nach spontan auftretenden Mutationen mit klassischen Züchtungstechniken gelungen, herbizidresistente Kulturpflanzen zu erhalten. Im Gegensatz zu diesen zufallsbedingten Ergebnissen ermöglicht es die Gentechnik, gezielt Kulturpflanzen zu erzeugen, die gegen ein bestimmtes Herbizid resistent sind. Dies eröffnet die Möglichkeit, Herbizide, die besonders schnell in umweltverträgliche Produkte abgebaut werden oder in besonders geringen Mengen wirken , als selektive Herbizide zu verwenden. Beispiele hierfür werden in den Abschnitten 10.1 und 10.4 besprochen.
Eine große Anzahl von Herbiziden hemmt die Photosynthese: Das Harnstoffderivat DCMU (Diuron, DuPont), das Triazin Atrazin (früher Ciba Geigy), Bentazon (BASF) (Abb. 3.23) sowie viele ähnliche Substanzen wirken als Herbizide, indem sie an die Plastochinonbindungsstelle am D1-Protein binden und so eine Blockierung der Photosynthese verursachen.

Allerdings wird DCMU wegen der erforderlichen hohen Dosis und des langsamen Abbaus nur noch wenig verwendet. Man benutzt es häufig im Labor, um die Photosynthese von beispielsweise Blättern oder isolierten Chloroplasten zu hemmen. Atrazin wirkt selektiv: Maispflanzen sind gegen dieses Herbizid relativ unempfindlich, da sie einen besonders effizienten Mechanismus zu dessen Entgiftung besitzen. Wegen des relativ langsamen Abbaus im Boden ist der Gebrauch von Atrazin in Deutschland nicht mehr erlaubt. Auf Feldern, in denen Herbizide kontinuierlich viele Jahre verwendet wurden, konnte bei einigen Unkräutern die Entwicklung einer Herbizidresistenz beobachtet werden. In einigen Fällen wurde als Ursache dieser Resistenz ein durch Mutation verursachter Austausch einer Aminosäure im D1-Protein nachgewiesen. Diese Mutation hatte nur geringen Einfluss auf die Photosynthese der betreffenden Unkräuter, verhinderte aber die Bindung des Herbizids.

3.6 Der Cytochrom-b6/f-Komplex vermittelt den Elektronentransport zwischen Photosystem II und Photosystem I

Eisenatome in Cytochromen und Eisen-Schwefel-Zentren haben eine zentrale Funktion als Redoxüberträger
Cytochrome kommen in allen Organismen, mit Ausnahme einiger obligater Anaerobier, vor. Es sind Proteine, die einen bis vier Tetrapyrrolringe gebunden enthalten. Diese Tetrapyrrole sind strukturell den Chromophoren der Chlorophylle sehr ähnlich. Während jedoch die Chlorophylle Mg2+ als Zentralatom im Tetrapyrrol enthalten, besitzen Cytochrome dort ein Eisenatom (Abb. 3.24). Der Tetrapyrrolring der Cytochrome mit Eisen als Zentralatom wird als Häm bezeichnet. Das gebundene Eisenatom kann durch Aufnahme oder Abgabe eines Elektrons zwischen den Oxidationsstufen Fe3+ und Fe2+ wechseln. Cytochrome wirken daher als Einelektronenüberträger, die im Gegensatz zu Chinonen, NADP+ und FAD (Abb. 5.16) nicht gleichzeitig Protonen übertragen. Man teilt die Cytochrome nach der Struktur des gebundenen Häms in drei Hauptgruppen ein, die Cytochrome-a, -b und -c. Diesen sind jeweils Häm a, b und c entsprechend zugeordnet. Abbildung 3.24 vergleicht die Strukturen von Häm-b und -c.

Häm-b ist als Grundstruktur anzusehen. Bei Häm-c wurde an die beiden Vinylgruppen des Häm-b jeweils die SH-Gruppe eines Cysteins addiert. Über die so gebildeten Thioetherbindungen ist das Häm-c mit dem Protein des Cytochroms kovalent verknüpft. Eine derartige Verknüpfung haben wir schon beim Phycocyanin (Abb. 2.15) kennengelernt, und tatsächlich gibt es auch eine strukturelle Verwandtschaft der entsprechenden Apoproteine. Beim Häm-a ist an eine der Vinylgruppen des Häm-b eine Isoprenoidseitenkette, die aus drei Isopreneinheiten besteht, angeknüpft. Diese Seitenkette dient als hydrophober Membrananker, wie wir es bereits bei den Chinonen gesehen haben (Abb. 3.5, 3.19). Das Häm-a wird hier nur der Vollständigkeit halber erwähnt, es spielt bei der Photosynthese keine Rolle. Wir werden uns mit dieser Substanz erst bei der Besprechung der mitochondrialen Atmung (Abschn. 5.6) wieder befassen.
Das Fe-Atom im Häm kann insgesamt sechs koordinative Bindungen eingehen. Vier dieser Bindungen sind durch den Tetrapyrrolring, der annähernd eine Ebene bildet, abgesättigt. Die verbleibenden zwei koordinativen Bindungen zum Fe-Atom werden beim Cyt-b durch zwei sich senkrecht zur Ebene gegenüberliegende Histidinreste geknüpft (Abb. 3.25). Cyt-f (f = foliar, in Blättern) enthält wie das Cyt-c ein Häm-c und wird daher zu den c-Typ-Cytochromen gezählt. Beim Cyt-fwird eine koordinative Bindung des Fe-Atoms durch die terminale Aminogruppe des Proteins und die andere durch einen Histidinrest abgesättigt.

Auch Eisen-Schwefel-Zentren haben eine allgemeine Bedeutung als Elektronenüberträger in Elektronentransportketten, und so auch beim photosynthetischen Elektronentransport. In Eisen-Schwefel-Zentren (Abb. 3.26) sind Cysteinreste von Proteinen mit Fe-Atomen verknüpft. Mehrere solcher Fe-Atome sind durch S-Brücken miteinander verbunden. Bei Ansäuern der Proteine entweicht der Schwefel zwischen den Fe-Atomen als H2S.

Man bezeichnet daher die Schwefelatome zwischen den Fe-Atomen als labilen Schwefel. Eisen-Schwefel-Zentren kommen vorwiegend als 2Fe-2S- oder 4Fe- 4S-Zentren vor. In den Zentren liegen die Fe-Atome in der Oxidationsstufe Fe2+ und Fe3+ vor. Unabhängig von der Anzahl der Fe-Atome in einem Zentrum unterscheiden sich der oxidierte und reduzierte Zustand nur durch eine Ladung. Dadurch können Eisen-Schwefel-Zentren immer nur ein Elektron aufnehmen und wieder abgeben. Eisen-Schwefel-Zentren haben je nach dem umgebenden Protein sehr unterschiedliche Redoxpotenziale.

Der Elektronentransport durch den Cytochrom-b6f-Komplex ist mit einem Transport von Protonen gekoppelt
Das durch PS II gebildete Plastohydrochinon (PQH2) diffundiert durch die Lipidphase der Thylakoidmembran und überträgt seine Elektronen auf den Cytochrom-b6f-Komplex (Abb. 3.17). Dieser Komplex wiederum überträgt die Elektronen auf Plastocyanin, das dabei reduziert wird. Der Cyt-b6f-Komplex kann so auch als Plastohydrochinon-Plastocyanio-Oxidoreduktase bezeichnet werden. Plastocyanin ist ein Protein mit einer Molekularmasse von 10,5 kDa, das ein Kupferatom enthält, welches von einem Cystein-, einem Methionin- und zwei Histidinresten des Proteins koordinativ gebunden ist (Abb. 3.27). Dieses Kupferatom wechselt zwischen den Oxidationsstufen Cu2+ und Cu+, wobei es ein Elektron aufnehmen und wieder abgeben kann. Plastocyanin ist in Wasser löslich und befindet sich im Lumen der Thylakoide. Der Elektronentransport durch den Cyt-b6f-Komplex verläuft über eine Potenzialdifferenz von etwa 0,4 Volt (Abb. 3.16). Die bei diesem Redoxgefälle freiwerdende Energie wird genutzt, um Protonen in das Lumen der Thylakoide zu befördern.

Der Cyt-b6f-Komplex ist ein aus mindestens acht Untereinheiten bestehendes Membranprotein. Die Hauptkomponenten dieses Komplexes sind vier Untereinheiten; Cyt-b6, Cyt-f; ein Eisen-Schwefel-Protein, das nach seinem Entdecker allgemein als Rieske-Protein bezeichnet wird, und eine Untereinheit IV. Dazu kommen einige kleinere Peptide, sowie ein Chlorophyll und ein Carotinoid unbekannter Funktion. Das Rieske-Protein ist ein 2Fe-2S-Zentrum mit einem für ein Eisen-Schwefel-Zentrum ungewöhnlich positiven Redoxpotenzial von +0,3 Volt. Dies beruht möglicherweise darauf, dass die Fe-Atome des Zentrums teilweise auch von Histidinresten koordiniert sind.
Der Cyt-b6f-Komplex hat einen asymmetrischen Aufbau (Abb. 3.28). Cyt-b6 und die Untereinheit IV durchspannen die Membran. Cyt-b6 enthält zwei Häm-b-Moleküle die übereinander annähernd senkrecht zur Membranebene angeordnet sind und eine durch die Membran gerichtete Redoxkette bilden. Darüber hinaus enthält Cyt-b ein Häm-c, dessen Funktion noch nicht eindeutig geklärt und in der Abbildung nicht berücksichtigt ist. Cyt-b6 besitzt zwei Bindungsstellen für PQH2/PQ, eine in der Lumenregion und eine in der Stromaregion der Membran.

Auf die Funktion dieser Bindungsstellen wird in den Reaktionsschemata in Abb. 3.29 und 3.30 eingegangen. In das Lumen ragt ein Eisen-Schwefel-Protein, das nach seinem Entdecker als Rieske-Protein bezeichnet wird, und in enger Nachbarschaft dazu befindet sich das Cyt-f, welches ein Häm-c enthält und die Bindungsstelle für die Reduktion von Plastocyanin enthält. Rieske-Protein und Cyt-f sind mit einem Membran-Anker versehen.
Der Cyt-b6f-Komplex entspricht in seinem Aufbau dem Cyt-b/c1-Komplex in Bakterien und in Mitochondrien. Tabelle 3.3 gibt eine Zusammenfassung der Funktionen dieser Cyt-b6f- beziehungsweise Cyt-b/c1-Komplexe. Alle diese Komplexe besitzen ein Eisen-Schwefel-Protein. Die Aminosäuresequenz des Cyt-b im Cyt-b/c1-Komplex von Bakterien und Mitochondrien entspricht der Summe der Sequenzen von Cyt-b6 und der Untereinheit IV im Cyt-b6f-Komplex. Offenbar ist während der Evolution eine Spaltung des Cyt-b-Gens in die beiden Gene für Cyt-b6 und die Untereinheit IV erfolgt. Während der Cyt-b6f-Komplex in Pflanzen Plastocyanin reduziert, wird durch den Cyt-b/c1-Komplex von Bakterien und Mitochondrien Cyt-c reduziert. Cyt-c ist ein sehr kleines Cytochrom-Molekül, das wasserlöslich ist und, ähnlich wie Plastocyanin, Redoxäquivalente (e-) über die wässrige Phase zum nächsten Komplex transportiert. Cyanobakterien und Algen können Plastocyanin oder Cyt-c6 als Elektronenakzeptor nutzen, Pflanzen jedoch nur Plastocyanin. Das pflanzliche Cyt-c6, das vor einigen Jahren entdeckt wurde, kann Plastocyanin nicht ersetzen. Die große Ähnlichkeit zwischen dem Cyt-b6f-Komplex in Pflanzen mit den Cyt-b/c1-Komplexen in Bakterien und Mitochondrien lässt erwarten, dass diese Komplexe sowohl bei der Photosynthese als auch bei der mitochondrialen Oxidation eine prinzipiell gleiche Funktion haben. Sie sind Protonentranslokatoren, die durch eine Hydrochinon-Plastocyanin (bzw. -Cyt-c)-Reduktase getrieben werden.

Durch das Zusammenwirken von PS II und dem Cyt-b6f-Komplex werden beim Elektronentransport Protonen vom Stromaraum in den Thylakoidraum gepumpt. Das Übersichtsschema in Abb. 3.29 soll auf der Grundlage des Strukturschemas in Abb. 3.28 das Prinzip dieses Protonentransports erklären. Entscheidend dabei ist, dass die Reduktion und Oxidation des Chinons an verschiedenen Seiten der Thylakoidmembran erfolgt.

Für die Reduktion des PQ (QB) im PSII-Komplex werden die erforderlichen Protonen aus dem Stromaraum aufgenommen. Das PQH2 gelangt an die Bindungsstelle in der Lumenregion des Cyt-b6f-Komplexes, wo es über das Rieske-Protein und Cyt-f unter Reduktion von Plastocyanin oxidiert wird. Die dabei anfallenden Protonen werden in das Lumen freigesetzt. Nach diesem Schema werden nach der Aufnahme von vier Excitonen im PS-II-Komplex vier Protonen vom Stromaraum in das Lumen überführt. Hinzu kommen die vier Protonen, die bei der Wasserspaltung durch PS II in das Lumen abgegeben werden.

Durch einen Q-Cyclus kann die Anzahl der durch den Cytochrom-b6/f-Komplex gepumpten Protonen verdoppelt werden
Untersuchungen an Mitochondrien haben aber gezeigt, dass beim Elektronentransport durch den Cyt-b/c1-Komplex die Anzahl der gepumpten Protonen pro transportiertem Elektron größer ist als nach dem in Abbildung 3.29 gezeigten Mechanismus zu erwarten. Peter Mitchell, dem wir die chemiosmotische Hypothese der Energiekonservierung verdanken (siehe Abschn. 4.1), hat einen so genannten Q-Cyclus postuliert, durch den die Menge der pro Elektron im Cyt-b/c1-Komplex transportierten Protonen verdoppelt wird. Es zeigte sich dann, dass der Q-Cyclus auch beim photosynthetischen Elektronentransport eine Rolle spielt.
Abbildung 3.30 zeigt das Prinzip eines im Detail noch nicht geklärten Q-Cyclus bei der chloroplastidären Photosynthese. Der Cyt-b6f-Komplex enthält zwei verschiedene Bindungsorte für die Umsetzung der Chinone, von denen sich einer an der Stroma- und der andere an der Lumenseite der Thylakoidmembran befindet (siehe Abb. 3.28). Das im PS-II-Komplex gebildete Plastohydrochinon (PQH2) wird an der Lumenseite durch das Rieske-Eisen- Schwefel-Zentrum zu Semichinon oxidiert. Durch sein sehr positives Redoxpotenzial entreißt das Rieske-Protein dem Plastohydrochinon ein Elektron. Das verbleibende Semichinon ist durch sein sehr negatives Redoxpotenzial instabil und überträgt sein Elektron auf das erste Häm-b des Cyt-b6 (bp) und von dort auf das zweite Häm-b (bn). Es wird so das Redoxpotenzial des Häm-bn um etwa -0,1 Volt angehoben. Dabei werden insgesamt vier Protonen pro zwei Plastohydrochinon in das Thylakoidlumen transportiert. Von den zwei gebildeten Plastochinonmolekülen (PQ), die Teil eines über die Membran verteilten Plastochinonpools darstellen, kehrt zunächst nur ein Molekül zu dem PS-II-Komplex zurück. Das andere PQ diffundiert in der Lipidphase der Membran außerhalb des Cyt-b6f-Komplexes von der Lumen-seitigen zu der Stroma-seitigen Bindungsstelle, wo es durch das Häm-b von Cyt-b6 mit seinem hohen Reduktionspotenzial über Semichinon zu Hydrochinon reduziert wird.

Dabei werden sequenziell zwei Protonen aus dem Stromaraum aufgenommen. Das so rückgebildete PQH2 diffundiert nun durch die Membran zurück zu der Lumen-seitigen Bindungsstelle um dort oxidiert zu werden, und es schließt sich erneut ein Q-Cyclus an, und so weiter. Insgesamt wird so durch den Q-Cyclus die Zahl der transportierten Protonen verdoppelt (1/2 + 1/4 + 1/8 + 1/16 + 1/n = 1). Bei vollständig operierendem Q-Cyclus würden beim Transport von vier Elektronen durch den Cyt-b6f-Komplex insgesamt acht Protonen in das Lumen transportiert. Die Gültigkeit des hier skizzierten Q-Cyclus ist für die in Abschnitt 5.5 behandelte mitochondriale Atmung inzwischen nicht mehr umstritten. Aus der Analogie des Cyt-b6f-Komplexes mit dem Cyt-b/c1-Komplex ist zu erwarten, dass der Q-Cyclus auch in Chloroplasten eine wichtige Rolle spielt. In Pflanzen wurde ein Ablauf des Q-Cyclus vorzugsweise unter Bedingungen mit geringer Lichtintensität beobachtet. Möglicherweise wird der Q-Cyclus durch einen hohen Protonengradienten über der Thylakoidmembran, wie er bei Bedingungen mit hoher Lichtintensität anzutreffen ist, unterdrückt. Es ist vorstellbar, dass auf diese Weise der Elektronenfluss durch den Q-Cyclus dem Energiebedarf der Pflanzenzelle angepasst wird.

3.7 Photosystem I reduziert NADP+
Das durch den Cyt-b6f-Komplex reduzierte Plastocyanin diffundiert durch das Lumen der Thylakoide, bindet an eine positiv geladene Bindungsstelle des Reaktionszentrums des PS I, überträgt dort sein Elektron und diffundiert in oxidierter Form zum Cyt-b6f-Komplex zurück (Abb. 3.31).
Das Reaktionszentrum des PS I mit einem Absorptionsmaximum von 700 nm enthält wiederum ein Chlorophyllpaar (Chl-a)2 Wie im PS II bewirkt ein Exciton wahrscheinlich die Anregung nur eines der beiden Chlorophyll-Moleküle. Das durch Abgabe eines Elektrons gebildete (Chl-a)2+ wird durch Plastocyanin reduziert. Man nimmt an, dass (Chl-a)2 sein Elektron auf ein Chl-a-Monomer (A0) überträgt, das seinerseits das Elektron auf ein fest gebundenes Phyllochinon (Q) (Abb. 3.32) weiterleitet. Phyllochinon besitzt die gleiche Phytylseitenkette wie Chl-a und entspricht in seiner Funktion dem QA im Photosystem-II. Von der Semichinonform des Phyllochinons wird das Elektron auf ein Eisen-Schwefel-Zentrum, in diesem Fall als Fx bezeichnet, übertragen.

Fx ist ein 4Fe-4S-Zentrum mit einem sehr negativen Redoxpotenzial. Es überträgt ein Elektron auf zwei weitere 4Fe-4S-Zentren (FA FB), durch die schließlich Ferredoxin, ein 11 kDa großes, lösliches Protein mit einem 2Fe-2S-Zentrum reduziert wird. Ferredoxin nimmt ebenfalls nur ein Elektron auf. Die Reduktion erfolgt auf der Stromaseite der Thylakoidmembran. Das Ferredoxin in bindet dazu an eine positiv geladene Bindungsstelle der Untereinheit D von PSI (Abb. 3.33). Durch die Reduktion von NADP+ durch Ferredoxin, katalysiert durch die Ferredoxin-NADP-Reduktase, entsteht NADPH als Endprodukt des photosynthetischen Elektronentransports; in diesem Schritt wird wiederum ein Proton pro Elektron aus dem Stroma aufgenommen. Der PS-I-Komplex besteht aus mindestens 17 verschiedenen identifizierten Untereinheiten (Tab. 3.4). Auch das Zentrum des PS-I-Komplexes ist ein Heterodimer (wie das Zentrum von PS II) bestehend aus den Untereinheiten A und B (Abb. 3.33).

Die Molekularmassen von A und B (jeweils 82 bis 83 kDa) entsprechen etwa der Summe der Molekularmassen von D1 und CP 43 beziehungsweise D2 und CP 47 in PS II (Tab. 3.2). Tatsächlich haben die Untereinheiten A und B jeweils eine Doppelfunktion. Sie binden zum einen wie D1 und D2 die Chromophore (Chl-a) und Redoxträger (Phyllochinon, FeX) des Reaktionszentrums und zum anderen auch insgesamt etwa 100 Chl-a-Moleküle als Antennenpigmente. Das Heterodimer von A und B ist so Reaktionszentrum und Core-Antenne zugleich. Es ist gelungen, mithilfe der Röntgenstrukturanalyse die dreidimensionale Struktur des Photosystems I aus Cyanobakterien, Grünalgen und Pflanzen zu ermitteln. Die Ergebnisse zeigen, dass die Grundstruktur von Photosystem I der des in Abbildung 3.10 gezeigten bakteriellen Photosystems und damit auch des Photosystems II recht ähnlich ist. Auch das Photosystem-I besitzt ein zentrales Paar aus 2 Chl-a-Molekülen und 2 Äste aus jeweils 2 Chlorophyll-Molekülen, wobei allerdings nicht eindeutig geklärt ist, ob beide oder nur einer dieser Äste am Elektronentransport beteiligt sind. Der Untereinheit C werden die Fe-S-Zentren FA und FB zugeschrieben, und die Untereinheit F wird als Bindungsstelle für Plastocyanin diskutiert.

Beim cyclischen Elektronentransport über PSI wird die Lichtenergie nur zur Synthese von ATP genutzt
Neben dem bisher besprochenen nichtcyclischen Elektronentransport ist bei der Photosynthese auch ein cyclischer Elektronentransport möglich, bei dem Elektronen aus dem angeregten Photosystem I in den Grundzustand des PS I zurückfließen. Die dabei freiwerdende Energie wird zur Synthese von ATP genutzt. Man spricht wie bei den Purpurbakterien von cyclischer Photophosphorylierung. Unzweifelhaft ist, dass in Bündelscheiden-Chloroplasten bestimmter C4-Pflanzen (siehe Abschn. 8.4), die neben einem sehr stark ausgeprägten Photosystem I nur sehr geringe Mengen an Photosystem II aufweisen und die dazu einen sehr hohen ATP-Bedarf haben, die cyclische Photophosphorylierung mit sehr hoher Aktivität ablaufen muss. Wahrscheinlich wird der cyclische Elektronenfluss durch den Redoxzustand des Akzeptors von Photosystem I bestimmt, indem ein erhöhter Reduktionsgrad des NADP+-Systems die Ableitung der Elektronen in den Cyclus fördert. Der cyclische Elektronentransport dient offenbar dazu, die Raten der Bereitstellung von ATP und NADPH jeweils dem Bedarf anzupassen.
Man hat in Thylakoidmembranen von Chloroplasten überraschenderweise Untereinheiten des NADH-Dehydrogenase-Komplexes der mitochondrialen Atmungskette (Abschn. 5.5) nachgewiesen, deren Funktion in Chloroplasten nicht sicher ist. Bisherige Untersuchungen zeigen, dass die Proteine dieses Komplexes besonders häufig in Chloroplasten der Bündelscheidenzellen von C4-Pflanzen vorkommen, die eine besonders hohe Aktivität der cyclischen Photophosphorylierung aufweisen.
Nach neueren Erkenntnissen sind zwei Wege des cyclischen Elektronentransports zu postulieren (Abb. 3.34).

Beide nutzen die angeregten Elektronen des Photosystem I und transferieren sie auf oxidiertes Ferredoxin. Reduziertes Ferredoxin gibt die Elektronen entweder an eine NADPH-Dehydrogenase oder an einen PGR5/PGRL1-Komplex ab. Der NADPH-Dehydrogenase abhängige Weg ist Antimycin unabhängig. Die Elektronen werden von der Dehydrogenase über Plastoquinon, Cyt-b6f und Plastocyanin zum Photosystem I zurückgeschleust. Der andere Weg, der durch das Antibiotikum Antimycin A blockiert werden kann, leitet die Elektronen von PGR5/PGRL1 zum Plastoquinon, Cyt-b6f, Plastocyanin zum Photosystem I. In der Alge Chlamydomonas reinhardtii existieren auch PGR5/PGRL1 homologe Proteine jedoch im Gegensatz zu den Landpflanzen ist PGRLl Teil eines Photosystem I/Cyt-b6f-Superkomplexes.

Durch das Photosystem I werden Elektronen auf Sauerstoff übertragen, wenn andere Akzeptoren fehlen
Bei einem hohen Reduktionsgrad des Ferredoxins besteht die Möglichkeit, dass Elektronen von PS I unter Bildung des Superoxidradikals (•O2-) auf Sauerstoff übertragen werden (Abb. 3.35). Dieser Vorgang wird als Mehler-Reaktion bezeichnet. Das Superoxidradikal reduziert in der Zelle vorhandene Metall-Ionen, wie Fe3+ und Cu2+ (Mn+):

Durch Superoxid-Dismutase erfolgt die Disproportionierung von •O2 zu H2O2 und O2 unter Aufnahme von zwei Protonen:

•02, H202 und •OH werden unter der Bezeichnung ROS (reactive Oxygen Species) zusammengefasst. Das H202 kann durch die Reaktion mit den durch Superoxid reduzierten Metall-Ionen Hydroxylradikal bilden:

Das Hydroxylradikal ist eine überaus agressive Verbindung. Durch seine Oxidationswirkung schädigt es Enzyme und Lipide. Gegen •OH besitzt die Pflanzenzelle keine Schutzenzyme. Ein Schutz besteht nur in einer Verhinderung der •OH-Bildung. Dafür ist es vor allem wichtig, dass durch eine schnelle Entfernung des •02 über die Superoxid-Dismutase eine Reduktion der Metall-Ionen unterdrückt wird. Aber auch H2O2 hat eine schädigende Wirkung auf viele Enzyme. H2O2 wird durch eine in den Thylakoidmembranen vorhandene Ascorbat-Peroxidase eliminiert. Ascorbat, ein wichtiges Antioxidans in Pflanzenzellen (Abb. 3.36), wird dabei zu dem radikalischen Monodehydroascorbat oxidiert, das spontan durch Photosystem I über reduziertes Ferredoxin wieder zu Ascorbat umgesetzt wird.

Monodehydroascorbat kann auch durch eine NAD(P)H-abhängige Monodehydroascorbat-Reduktase, die im Chloroplastenstroma und im Cytosol vorkommt, zu Ascorbat reduziert werden.
Alternativ können zwei Moleküle Monodehydroascorbat zu Ascorbat und Dehydroascorbat disproportionieren und letzteres unter Beteiligung von Glutathion als Reduktionsmittel wieder zu Ascorbat reagieren (Abb. 3.37). Glutathion (GSH), ein in allen Pflanzenzellen vorkommendes Antioxidans (Abschn. 12.2), ist ein Peptid aus den Aminosäuren Glutamat, Cystein und Glycin (Abb. 3.38). Bei der Oxidation bildet sich zwischen den S-Atomen von zwei Cysteinresten ein Disulfid (GSSG). Die Reduktion des GSSG erfolgt durch NADPH über eine Glutathion-Reduktase (Abb. 3.37).

Abbildung 3.35 zeigt die Bilanz eines Mehler-Ascorbat-Peroxidase-Cyclus, dessen Hauptfunktion darin liegt, dass überschüssige Anregungsenergie des Photosystems I in Wärme, die leicht abgegeben werden kann, dissipiert wird. Die Absorption von insgesamt acht Excitonen führt am PS I zur Bildung von zwei Superoxidradikalen und zwei Molekülen reduziertem Ferredoxin. Letzteres dient als Reduktant zur Eliminierung des H2O2. Durch die Übertragung von Elektronen auf Sauerstoff durch die Mehler-Reaktion wird letztlich die Spaltung des Wassers durch das Photosystem II wieder rückgängig gemacht. Wie im folgenden Abschnitt besprochen, erfolgt die Mehler-Reaktion bei einer übermäßigen Reduktion des Ferredoxins. Der einzige Gewinn bei dieser Reaktion ist die Bildung eines Protonengradienten beim Transport von Elektronen durch Photosystem II und den Cyt-b6f-Komplex. Dieser Protonengradient kann zur Synthese von ATP genutzt werden, falls ADP vorhanden ist. Da jedoch meist unter den Bedingungen der Mehler-Reaktion ADP-Mangel herrscht, wird durch die Mehler-Reaktion oft ein hoher pH-Gradient gebildet. Der Mehler-Reaktion-Ascorbat-Peroxidase-Cyclus ähnelt dem cyclischen Elektronentransport darin, dass NADP+ nicht reduziert wird. Man hat daher diesen Cyclus auch als pseudocyclischen Elektronentransport bezeichnet.
Es wurde in Pflanzen eine weitere Klasse von Antioxidantien entdeckt, die so genannten Peroxiredoxine. Es handelt sich dabei um Proteine, die schon länger im Tierreich bekannt sind, und SH-Gruppen als Redoxüberträger besitzen. In der Modellpflanze Arabidopsis hat man 10 verschiedene Peroxiredoxin-Gene nachgewiesen. Peroxiredoxine sind in Chloroplasten, aber auch in anderen Zellkompartimenten lokalisiert. Sie zeichnen sich gegenüber den bislang besprochenen Antioxidantien Glutathion und Ascorbat dadurch aus, dass sie ein besonders breites Spektrum von Peroxiden, wie H2O2, Alkylperoxide und Peroxinitrite, reduzieren. In Chloroplasten werden oxidierte Peroxiredoxine durch photosynthetischen Elektronentransport des Photosystem I unter Vermittlung von Ferredoxin und Thioredoxin reduziert.
Photosystem I kann anstatt Ferredoxin auch Methylviologen - als Herbizid unter dem Namen Paraquat bekannt (Abb. 3.39) - reduzieren.

xxxxxxxxxxxxxx Die Herbizidwirkung beruht darauf, dass durch reduziertes Paraquat Sauerstoff zu Superoxid reduziert wird. Zudem konkurriert Paraquat mit Dehydroascorbat um die durch Photosystem I bereitgestellten Reduktionsäquivalente. Dadurch wird in Gegenwart von Paraquat alles Ascorbat in Dehydroascorbat umgewandelt, und die Reaktion der Ascorbat-Peroxidase kann nicht mehr ablaufen. Durch die vermehrte Bildung von Superoxid und die verminderte Entgiftung des H2O2 führt Paraquat zu sehr schweren Schäden der Mesophyllzellen durch Oxidation, wie man durch das Ausbleichen der Blätter erkennen kann. Man hat Paraquat in Südamerika benutzt, um Marihuanafelder zu vernichten.

3.8 Regulationsvorgänge sorgen dafür, dass die eingefangenen Photonen zwischen den beiden Photosystemen verteilt werden
Der lineare photosynthetische Elektronentransport über die zwei hintereinander geschalteten Photosysteme macht es erforderlich, dass die als Excitonen eingefangenen Photonen auf beide Photosysteme gleichmäßig verteilt werden. In Abschnitt 2.4 wurde besprochen, dass die Excitonen vorzugsweise zu dem Chromophor geleitet werden, der die niedrigste Energie zur Anregung benötigt. Die Energie zur Anregung von Photosystem I (P700) ist niedriger als die zur Anregung von Photosystem II (P680). Bei einer ungehinderten Konkurrenz der beiden Photosysteme um die Excitonen würden letztere vorwiegend in das PS I geleitet werden. Man erkennt hieraus, dass die Verteilung der Excitonen auf beide Photosysteme reguliert werden muss. Ein wichtiges Element dieser Regulation ist eine räumliche Trennung der Antennen von PS I und PS II in den Thylakoidmembranen.
In einem Chloroplasten liegen die Thylakoidmembranen in zwei verschiedenen Anordnungen vor. Bei den ungestapelten Membranen hat die Außenseite einen freien Zugang zum Stromaraum, man spricht von Stromalamellen (Abb. 3.40). Die gestapelten Membranen sind im Lichtmikroskop als Körnchen (Grana) zu erkennen und werden daher auch als Granalamellen bezeichnet. Sie bestehen aus unabhängigen Grana-Scheiben. Nach neuen Erkenntnissen winden sich freie Stromalamellen mit einer rechtsgängigen Helix um die Grana-Scheiben und verbinden so die individuellen Grana-Scheiben (Helix-Modell). Da auch andere Grana-Modelle diskutiert werden kann daraus geschlossen werden, dass das exakte Bild über Entstehung und Ausprägung der Grana-Struktur noch nicht bekannt ist.

Die ATP-Synthase, der PS-I-Komplex und Cyt-b6f-Komplex sind in den Stromalamellen und bieten dadurch ADP und NADP+ einen freien Zugang. Der PS-II-Komplex befindet sich dagegen hauptsächlich in den Granalamellen. An den PSIl-Komplex assoziierte LHC-II-Untereinheiten Abschnitt 2.4 besitzen eine aus der Membran herausragende Proteinkette, die wahrscheinlich mit den LHC-II-Untereinheiten benachbarter Membranen interagieren kann und so eine enge Membranstapelung bewirkt. Die gestapelten Membranen enthalten sonst nur noch PGRLl-Homodimere. PS-I und die F-ATP-Synthase passen wegen ihrer in den Stromaraum herausragenden Proteine in den Zwischenraum der gestapelten Membranen nicht hinein. Die in den gestapelten Membranen vorhandenen PS-II-Komplexe sind somit von den PS-I-Komplexen in den ungestapelten Membranen isoliert. Man nimmt an, dass so ein unkontrolliertes Überfließen der Excitonen (spillover) von PS II zu PS I vermieden wird.
Jedoch kann die räumliche Trennung der beiden Photosysteme und damit auch das spillover der Excitonen von PS II nach PS I reguliert werden. Ist die Anregung von PS II größer als von PS 1, so führt dies zu einem Anstau von Plastohydrochinon, da dieses nicht in ausreichendem Maße über den Cyt-b6f-Komplex durch das PS I oxidiert werden kann. Unter diesen Bedingungen wird eine Protein-Kinase (STN7) aktiviert, durch welche OH-Gruppen in Threoninresten der peripheren LHC-II-Untereinheiten durch ATP phosphoryliert werden. Durch diese Phosphorylierung ändert sich die Konformation der LHC-II-Untereinheiten, wodurch die Affinität zu PS II erniedrigt wird, und sich LHC-II-Untereinheiten von den PS-II-Komplexen ablösen. Andererseits können durch die geänderte Konformation LHC-II-Untereinheiten an den PS-I-Komplex andocken. Als Bindungsstelle wurde kürzlich die H-Untereinheit von PS-II identifiziert. Dadurch können LHC II Excitonen vermehrt in das niederenergetische PS I überfließen. So würde bei einem Anstau von Plastohydrochinon über eine Proteinkinase die Anregung von PS II zugunsten von PS I heruntergeregelt. Durch eine Protein-Phosphatase (TAP38/PPH1) ist eine Rückregelung möglich. Der hier in starker Vereinfachung dargestellte Mechanismus ermöglicht es der Pflanze, die eingestrahlten Photonen weitgehend unabhängig von den spektralen Eigenschaften des Lichtes optimal auf beide Photosysteme zu verteilen. Ein langfristiger Mechanismus, um das Gleichgewicht zwischen den Photosystem wieder herzustellen, ist die Änderung des PSII/PSI-Verhältnisses.

Überschüssige Lichtenergie wird in Form von Wärme abgegeben
Bei Pflanzen besteht ein generelles Problem darin, dass die Energie des eingestrahlten Lichtes höher sein kann als der NADPH-und ATP-Bedarf des Photosynthesestoffwechsels. Dies ist zum Beispiel der Fall bei sehr hohen Belichtungsstärken, wenn der Metabolismus nicht nachkommt, bei hohen Temperaturen, wenn zur Vermeidung des Wasserverlustes die Stomata geschlossen sind, oder bei tiefen Temperaturen, wenn aufgrund verminderter Enzymaktivitäten der Stoffwechsel verlangsamt ist. Eine überschüssige Anregung der Photosysteme könnte zu einer übermäßigen Reduktion der Komponenten des photosynthetischen Elektronentransports führen.
Bei PS II kann eine übermäßige Anregung, die sich durch einen Anstau von Plastohydrochinon zu erkennen gibt, zu einer Schädigung des Photosyntheseapparates führen, die als Photoinhibition bezeichnet wird. Ein Grund für diese Schädigung ist, dass übermäßig angeregte Chlorophyllmoleküle der Reaktionszentren in den Triplett-Zustand übergehen, wodurch chemisch sehr aggressiver Singulett-Sauerstoff erzeugt wird (Abschn. 2.3). Die schädliche Wirkung des Chlorophylls lässt sich in einem Tierversuch demonstrieren: Bringt man eine kleine Menge Chlorophyll unter die Haut und belichtet diese, so sind schwere Hautschäden die Folge. Man nutzt dieses so genannte photodynamische Prinzip in der Medizin für eine selektive Krebstherapie u. a. in Hautbereichen.
Carotinoide (z.B. ß-Carotin, Abb. 2.9) haben die Eigenschaft, sowohl den Triplettzustand des Chlorophylls wie auch den Singulettzustand des Sauerstoffes wieder in die entsprechenden Grundzustände zu überführen. Es entsteht dabei angeregtes Triplettcarotinoid, dessen Energie nicht mehr zur Bildung von Singulettsauerstoff ausreicht, und das seine Energie als Wärme abgibt. Dadurch haben Carotinoide eine wichtige Schutzfunktion. Es wird diskutiert, dass bei übermäßiger Anregung des PS II die Schutzfunktion der Carotinoide nicht ausreicht, und der vermehrt gebildete Singulettsauerstoff den PS-II-Komplex schädigt. Ein Angriffsort für die Schädigung ist wahrscheinlich das D1-Protein des photosynthetischen Reaktionszentrums in PS II, das unter normalen Photosynthesebedingungen bereits einen hohen Turnover hat (siehe Abschn. 3.6). Eine Photoinhibition liegt vor, wenn die Geschwindigkeit der Schädigung des D1-Proteins so hoch ist, dass dessen Neusynthese nicht nachkommt.
Zur Verminderung derartiger Lichtschäden des Photosyntheseapparates besitzen Pflanzen Schutzmechanismen, welche die Energie überschüssiger Excitonen als Wärme ableiten. Man spricht von einer nichtphotochemischen Löschung der Excitonenenergie. Nach bisherigen Untersuchungen bewirkt Zeaxanthin (Abb. 3.41) durch Interaktion mit Chlorophyllbindenden Proteinen des Photosystem-II die Umwandlung der Excitonenenergie in Wärme. Zeaxanthin wird über Reduktion durch Ascorbat aus dem Diepoxid Violaxanthin über das Monoepoxid Antheraxanthin als Zwischenprodukt gebildet, und kann durch Epoxidbildung mit NADPH und 0 2 wieder zu Violaxanthin umgesetzt werden (Abb. 3.41).

Die Bildung von Zeaxanthin über die De-Epoxidase erfolgt an .der Lumenseite der Thylakoidmembran bei einem pH-Optimum von pH 5,0, während die Rückbildung des Violaxanthins durch die Epoxidase auf der Stromaseite der Thylakoidmembran bei etwa pH 7,6 erfolgt. Die Zeaxanthinbildung erfordert demnach einen hohen pH-Gradienten über der Thylakoidmembran. Wie bei der Mehler-Reaktion (Abschn. 3.9) besprochen wurde, kann ein sehr hoher pH-Gradient ein Indiz für eine erhöhte Anregung des Photosystems II sein. Bei einem Überschuss an Excitonenenergie wird über den erhöhten pH-Gradienten die Synthese von Zeaxanthin ausgelöst und dadurch überschüssige Excitonenenergie im PS-II-Komplex durch den Übergang in Wärmeenergie unschädlich gemacht. Bei den meisten Pflanzen werden auf diese Weise bei vollem Sonnenlicht 50-70% aller absorbierten Photonen in Wärme überführt. Diese nichtphotochemische Löschung der Excitonenenergie bildet den Hauptweg, durch den sich die Pflanze vor einem Überangebot von Lichtenergie schützt. Im Vergleich dazu haben die Mehler-Reaktion (Abschn. 3.9) und die in Abschnitt 7.7 behandelte Photorespiration unter den meisten Bedingungen einen geringeren Anteil an der Beseitigung überschüssiger Anregungsenergie.nach oben zum Kapitelanfang

4 Bei der Photosynthese wird ATP erzeugt
Im vorigen Kapitel wurde beschrieben, dass beim photosynthetischen Elektronentransport Protonen über die Thylakoidmembran transportiert werden und so ein elektrochemischer Gradient aufgebaut wird. Dieses Kapitel beschäftigt sich damit, wie dieser Protonengradient genutzt wird, um ATP zu synthetisieren.
Daniel Arnon entdeckte im Jahre 1954 in Berkeley, dass bei Belichtung von suspendierten Thylakoidmembranen aus ADP und Phosphat ATP gebildet wird. Dieser Vorgang wird als Photophosphorylierung bezeichnet. Weitere Experimente ergaben, dass die Photophosphorylierung mit der photosynthetischen Bildung von NADPH gekoppelt ist. Dies war damals ein unerwarteter Befund. Bis zu diesem Zeitpunkt hatte man geglaubt, dass die Synthese von ATP wie bei den Mitochondrien durch einen Elektronentransport vom NADPH zum Sauerstoff erfolgt. Es zeigten sich dann aber doch Parallelen zwischen der mit dem photosynthetischen Elektronentransport gekoppelten Photophosphorylierung und der mit dem Elektronentransport der mitochondrialen Atmungskette gekoppelten ATP-Synthese, der oxidativen Phosphorylierung (siehe Abschn. 5.6). Peter Mitchell (Edinburgh) postulierte 1961 in seiner chemiosmotischen Hypothese, dass bei der Elektronentransport-gekoppelten ATP-Synthese beider Prozesse ein Protonengradient über die Membran als energiereicher Zwischenzustand gebildet wird, dessen protonenmotorische Kraft zum Antrieb der ATP-Synthese dient. Diese damals revolutionäre Theorie stieß zunächst auf sehr großen Widerstand, ist dann aber in ihren Grundzügen voll bestätigt worden. Peter Mitchell wurde dafür 1978 der Nobelpreis für Chemie verliehen.

4.1 Ein Protonengradient dient als energiereicher Zwischenzustand
Wieviel Energie ist erforderlich, um ATP zu synthetisieren? Die freie Enthalpie zur Synthese von ATP aus ADP und Phosphat kann man nach der van't Hoffschen Gleichung berechnen:

Die freie Standardenthalpie für die Synthese von ATP beträgt:

Die Konzentrationen von ATP, ADP und Phosphat im Chloroplastenstroma sind sehr stark vom Stoffwechsel abhängig. Typische Konzentrationen sind: ATP = 2,5 • 10-3mol/L, ADP = 0,5 • 10-3mol/L, P = 5 • 10-3mol/L. Eingesetzt in Gleichung 4.1 (R = 8,32 J/mol • K, T = 298 K) erhält man für die ATP-Synthese einen Energiebedarf von

Dieser Wert ist natürlich variabel und sehr stark von der Stoffwechsellage abhängig, da die aktuellen Konzentrationen der Reaktanten mit in die Gleichung eingehen. Für die weiteren Überlegungen können wir für ΔGATP einen Richtwert von 50 kJ/mol verwenden.
Der Transport von Protonen über eine Membran kann verschiedene Auswirkungen haben. Falls die Membran für ein Gegen-Ion des Protons, zum Beispiel für das Chlorid-Ion, durchlässig ist (Abb. 4.1A), erfolgt ein Ladungsausgleich, indem für jedes importierte Proton ein Chlorid-Ion nachgezogen wird. Es kann sich so ein Konzentrationsgradient der Protonen bilden, ohne dass eine elektrische Spannung aufgebaut wird. Die freie Enthalpie für den Transport von Protonen von A nach B beträgt:

Falls die Membran für Gegen-Ionen undurchlässig ist (Abb. 4.1B), kann ein Ladungsausgleich für das transportierte Proton nicht stattfinden. Die Verschiebung einiger Protonen über die Membran führt in diesem Falle zur Bildung eines Membranpotenzials ΔΨ, die als Spannungsdifferenz über die Membran in Volt gemessen wird. Konventionsgemäß gilt dabei: Wenn ein Kation in Richtung des positiveren Bereiches transportiert wird, ist ΔΨ positiv. Spannung und freie Enthalpie sind über folgende Beziehung miteinander verbunden:

Dabei ist m die Ladung des Ions (1 im Fall des Protons) und F die Faraday-Konstante, 96485 A • s/mol.

Beim Transport von Protonen über biologische Membranen werden sowohl ein Protonenkonzentrationsgradient als auch ein Membranpotenzial auf gebaut. Die freie Enthalpie für den Gesamtvorgang des Transports von Protonen von A nach B ergibt sich daher aus der Summe der freien Enthalpien zum Aufbau des H+-Konzentrationsgradienten und des Membranpotenzials:

Die Arbeitsfähigkeit des Protonengradienten entspricht der Änderung der freien Enthalpie beim Fluss der Protonen vom Lumen in das Stroma.

S = Stroma, L = Lumen, ΔΨ = Spannungsdifferenz zwischen Stroma und Lumen. Wandelt man den natürlichen in den dekadischen Logarithmus um, so erhält man:

Der logarithmische Faktor ist die negative pH-Differenz zwischen Lumen und Stroma:

Durch Umformen ergibt sich:

Bei 25 °C beträgt die Enthalpiedifferenz 5700 J/mol. Es ergibt sich:

Ausdruck ΔG/F nennen wir protonenmotorische Kraft, PMK. Ihre Einheit ist Volt.

Es ergibt sich:

Gleichung 4.13 hat eine allgemeine Bedeutung für die Elektronentransportgekoppelte ATP-Synthese. Die relativen Anteile des Membranpotenzials und des H+-Konzentrationsgradienten an der protonenmotorischen Kraft sind bei verschiedenen biologischen Systemen unterschiedlich. Während bei der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung das Membranpotenzial den Hauptanteil ausmacht, ist bei Chloroplasten der Anteil des Membranpotenzials klein. Dafür findet man in belichteten Chloroplasten über der Thylakoidmembran ein ΔpH von etwa 2.5. Nach Einsetzen in Gleichung 4.11 ergibt dies unter Vernachlässigung des sehr kleinen ΔΨ:

Vergleicht man diesen Wert mit ΔG für die Bildung von ATP (50 kJ/mol), so erkennt man, dass für die ATP-Synthese aus ADP und Phosphat mindestens vier Protonen erforderlich sind.

4.2 Entkoppler bewirken die Dissipation des elektrochemischen Protonengradienten in Wärme
Der photosynthetische Elektronentransport vom Wasser zum NADP+ ist mit der Photophosphorylierung gekoppelt. Der Elektronentransport erfolgt nur dann, wenn ADP und Phosphat als Ausgangssubstrate für die ATP-Synthese vorhanden sind. Durch Zugabe von Entkopplern kann der Elektronentransport mit hoher Geschwindigkeit auch in Abwesenheit von ADP ablaufen, der Elektronentransport ist dann von der ATP-Synthese entkoppelt. Es findet dann auch in Gegenwart von ADP und Phosphat keine ATP-Synthese mehr statt.
Die chemiosmotische Hypothese erklärt die Wirkung der Entkoppler (Abb. 4.2) auf die ATP-Synthese. Entkoppler verursachen durch ihre Fähigkeit, Protonen beziehungsweise Alkali-Ionen über biologische Membranen zu befördern, ein Zusammenbrechen des H+-Konzentrationsgradienten beziehungsweise des Membranpotenzials. Dies bewirkt eine hohe Rate des Elektronentransports. Da kein Protonengradient vorhanden ist, werden durch die ATP-Synthase (Abb. 3.17) unter Spaltung von ATP in ADP und Phosphat Protonen aus dem Stroma in das Lumen der Thylakoide transportiert. Es findet so in Umkehrung der ATP-Synthese eine ATP-Hydrolyse statt (ATPase).
Entkoppler sind amphiphile Substanzen, die sowohl in Wasser als auch in Lipiden löslich sind. Diese Eigenschaft ermöglicht es ihnen, die Lipidphase einer Membran durch Diffusion zu durchdringen. Die Entkopplerwirkung beruht darauf, dass Entkoppler beim Durchtritt durch die Membran ein Proton oder ein Alkali-Ion transportieren. Abbildung 4.2A zeigt die Wirkungsweise des Entkopplers Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP), einer schwachen Säure.

FCCP diffundiert in der undissoziierten (protonierten) Form von dem Kompartiment mit hoher Protonenkonzentration (in Abbildung 4.2A links) durch die Membran in das Kompartiment mit niedriger Protonenkonzentration; es erfolgt dort eine Dissoziation. Das Proton bleibt zurück, und das FCCP-Anion kehrt durch Diffusion in das Ausgangskompartiment zurück, in dem es wieder protoniert wird. Bereits eine FCCP-Konzentration von nur 7•10-8 mol/L führt auf diese Weise zu dem vollständigen Zusammenbruch des Protonengradienten über einer Membran. Eine noch höhere Entkopplerwirkung hat die Substanz SF 6847 (3,5-Di(tert-butyl)-4-hydroxybenzyldimalononitril) (Abb. 4.3).

Entkoppler wie FCCP oder SF 6847, die Protonen über eine Membran transportieren, werden auch als Protonophore bezeichnet.
Neben den Protonophoren gibt es eine weitere Klasse von Entkopplern, die Ionophoren. Diese können Alkali-Kationen über eine Membran transportieren und führen so zur Dissipation eines Membranpotenzials. Ein solches Ionophor ist Valinomycin, ein Antibiotikum aus Streptomyces (Abb. 4.2B). Valinomycin ist ein cyclisches Molekül, das in dreimaliger Wiederholung die Sequenz (Lactat )-( L-Valin)-( D-Hydroxyisovalerat )-( D-Valin) enthält. Aufgrund seiner hydrophoben Außenseite kann Valinomycin durch eine Membran diffundieren. Sauerstoffatome, die in das Innere des Moleküls gerichtet sind, sind eine Bindungsstelle für dehydratisierte Rb+- und K+-Ionen. Na+-Ionen werden nur sehr schwach gebunden. In Gegenwart von K+-Ionen führt die Anwesenheit von Valinomycin zum Zusammenbruch eines Membranpotenzials. Das Ionophor Gramicidin, das hier nicht näher behandelt wird, ist ebenfalls ein Polypeptid. Dieses bildet einen transmembranen Ionenkanal, der die Diffusion sowohl von Alkali-Kationen als auch von Protonen durch die Membran erlaubt.

Die chemiosmotische Hypothese wurde experimentell bestätigt
Ein wichtiger Beweis für die Gültigkeit der chemiosmotischen Hypothese für die Photophosphorylierung der Chloroplasten wurde 1966 von dem amerikanischen Wissenschaftler Andre Jagendorf geliefert (Abb. 4.4). Er inkubierte Thylakoidmembranen in einem sauren Medium von pH 4, um durch eine unspezifische Aufnahme von Protonen den Wasserraum des Lumens auf pH 4 anzusäuern. Er gab anorganisches Phosphat und ADP zu der Thylakoidsuspension und erhöhte dann durch Zugabe eines alkalischen Puffers den pH-Wert des Mediums auf pH 8. Er erzeugte so plötzlich über der Thylakoidmembran einen Protonengradienten von ΔpH = 4. Hierbei beobachtete er eine kurzzeitige Synthese von ATP. Da diese Experimente im Dunkeln ausgeführt wurden, war damit bewiesen, dass die Synthese von ATP in Chloroplasten allein durch einen pH-Gradienten über der Thylakoidmembran getrieben werden kann.

4.3 H+-ATP-Synthasen in Bakterien, Chloroplasten und Mitochondrien besitzen eine einheitliche Grundstruktur
Auf welchem Weg wird die Energie, die in dem vorher besprochenen Protonengradienten gespeichert ist, genutzt, um ATP zu synthetisieren?
Eine protonengekoppelte ATP-Synthase (H+-ATP-Synthase) ist keine Besonderheit der Chloroplasten, sondern wurde schon im sehr frühen Verlauf der Evolution gebildet und kommt in praktisch gleichem Aufbau sowohl in Bakterien und Chloroplasten als auch in Mitochondrien vor. In Bakterien bewirkt dieses Enzym nicht nur die durch einen Protonengradienten getriebene ATP-Synthese, sondern auch in umgekehrter Weise den ATP-abhängigen Transport von Protonen gegen einen Konzentrationsgradienten. Möglicherweise war dies die ursprüngliche Funktion dieses Enzyms. In manchen Bakterien werden durch ein prinzipiell gleich aufgebautes Enzym unter Verbrauch von ATP auch Na+-Ionen transportiert und umgekehrt.
Unser heutiges Wissen über den Aufbau der H+-ATP-Synthase basiert auf den Untersuchungen an Mitochondrien, Chloroplasten und Bakterien. Durch Fortschritte der Elektronenmikroskopie wurden um 1960 an den inneren Membranen der Mitochondrien und an den Thylakoidmembranen von Chloroplasten kleine, durch einen Hals mit der Membran verbundene Partikel entdeckt, die zum Matrix- beziehungsweise Stromaraum gerichtet waren. Ephraim Racker (Cornell Universität, USA) gelang es kurze Zeit später, diese Partikel durch Zugabe von Harnstoff von der mitochondrialen Membran abzulösen. Diese abgelösten Partikel katalysierten die Hydrolyse von ATP zu ADP und Phosphat und wurden von Racker als F1-ATPase bezeichnet.
Aus den Innenmembranen intakter Mitochondrien ließen sich Vesikel herstellen, deren Membran die F1-Partikel enthielten. Diese Membranvesikel waren zur atmungsgekoppelten ATP-Synthese befähigt. Wie bei intakten Mitochondrien (Abschn. 5.6) bewirkte die Zugabe von Entkopplern eine hohe ATPase-Aktivität. Ebenfalls wie in intakten Mitochondrien wurden bei diesen Vesikeln sowohl die ATP-Synthese als auch die Entkoppler-abhängige ATPase durch das Antibiotikum Oligomycin gehemmt. Mitochondriale Vesikel, von denen die F1-Partikel zuvor abgelöst worden waren, zeigten keine ATPase-Aktivität, aber eine hohe Durchlässigkeit für Protonen. Diese Durchlässigkeit wurde durch Oligomycin aufgehoben. Dagegen wurde die ATPase-Aktivität der abgelösten F1-Partikel durch Oligomycin nicht beeinflusst. Aus diesen und anderen Ergebnissen wurde geschlossen, dass die H+-ATP-Synthase der Mitochondrien aus zwei Teilen besteht, einem löslichen Faktor 1 (F1), der die Synthese von ATP katalysiert, und einem membrangebundenen Faktor, der für den Fluss der Protonen und die Bindung des Oligomycins verantwortlich ist und von Racker als Fo (O für Oligomycin) bezeichnet wurde (Abb. 4.5). Gleiche Ergebnisse hat man dann auch für die H+-ATP-Synthasen von Chloroplasten und Bakterien gefunden. Allerdings wirkt Oligomycin bei der H+-ATP-Synthase von Chloroplasten nicht hemmend. Man hat dennoch die Bezeichnung Fo auch für den Membranteil der chloroplastidären und bakteriellen ATP-Synthasen beibehalten. Die H+-ATP-Synthasen von Chloroplasten, Mitochondrien und Bakterien sowie entsprechende H+- und Na+-ATPasen von Bakterien bezeichnet man daher auch mit dem Sammelbegriff F-ATP-Synthasen oder F-ATPasen. Außerdem ist noch die Bezeichnung FoF1-Synthase beziehungsweise -ATPase gebräuchlich.

F1 ist nach Abtrennung von der Membran ein lösliches, oligomeres Protein mit der Zusammensetzung α3β3γ3δε: (Tab. 4.1). Diese Zusammensetzung wurde sowohl in Chloroplasten, Bakterien als auch in Mitochondrien gefunden.
Fo ist ein stark hydrophober Proteinkomplex, der nur durch den Einsatz von Detergentien aus der Membran herausgelöst werden kann. Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD) (Abb. 4.6), ein Hemmer der F-ATP-Synthasen, bindet an das in die Membran eingebettete Fo. Durch diese Bindung wird der Protonenkanal geschlossen und so die ATP-Synthese gehemmt. Als Hauptbestandteile von Fo wurden in den verschiedenen Organismen vier unterschiedliche Untereinheiten nachgewiesen, die mit a, b, b', und c bezeichnet werden. Untereinheit c, welche bei Chloroplasten in 12-14 Kopien vorkommt, enthält zwei transmembrane Helices und ist der Bindungsort für DCCD. Nach bisherigen Erkenntnissen bilden die c-Untereinheiten einen Zylinder, der die Membran durchspannt (Abb. 4.7, Tabelle 4.1).

In der Membran, an der Außenseite des Zylinders, sind die Untereinheiten a, b, b' angeordnet, wobei die letzteren beiden über die Untereinheit δ Kontakt mit dem F1-Teil haben. Die Untereinheiten γ und ε stellen eine zentrale Verbindung zwischen dem F1- und Fo-Teil her.

Wie bereits besprochen, sind die F1-Teile im Elektronenmikroskop als Partikel sichtbar. Zwar sind wegen der geringen Größe der Partikel auf einem einzelnen elektronenmikroskopischen Bild Einzelheiten der Struktur nicht zu erkennen. Führt man jedoch mit einer sehr großen Anzahl derartiger Bilder eine computergestützte Bildanalyse durch, so werden Details der Struktur sichtbar. Abbildung 4.8 zeigt gemittelte Bilder der F-ATPase aus Chloroplasten. In der Seitenansicht ist der Stiel, der den F1-Teil mit der Membran verbindet, deutlich zu sehen. Bei einer weiteren Verfeinerung der Bildanalyse (hier nicht gezeigt) hat man sogar zwei Stiele zwischen F1 und Fo gefunden, einen dicken und einen dünnen. In der Aufsicht des F1-Teils erkennt man einen hexagonalen Aufbau, der einer alternierenden Anordnung von α- und ß-Untereinheiten entspricht. Aus Untersuchungen am isolierten F1-Protein ging hervor, dass ein FoF1-Protein drei katalytische Bindungsstellen für ADP oder ATP besitzt. Jeweils eine dieser Bindungsstellen enthält ATP sehr fest gebunden, seine Ablösung erfolgt nur nach Zufuhr von Energie, die von dem Protonengradienten bereitgestellt wird.


Die Röntgenstrukturanalyse des F1-Teils der ATP-Synthase liefert einen Einblick in die ATP-Synthese
Erst 1994 ist es der Gruppe von John Walker in Cambridge (England) gelungen, die räumliche Struktur des F1-Teils durch Röntgenstrukturanalyse aufzuklären. Für diese Analyse wurden Kristalle von F1 aus Rinderherz-Mitochondrien verwendet. Die untersuchte F1-Präparation wurde vor der Kristallisation mit einem Gemisch aus ADP und einem ATP-Analogon (5'-Adenylyl-imidodiphosphat, AMP-PNP) beladen. (Dieses ATP-Analogon unterscheidet sich von ATP dadurch, dass die letzten beiden Phosphate durch ein N-Atom verbunden sind. Es bindet an die ATP-Bindungsstelle wie ATP, wird aber nicht durch ATPase gespalten.) Die Strukturanalyse bestätigte die alternierende Anordnung der α- und ß-Untereinheiten (Abb. 4.7, 4.9). Jeweils eine α - und eine ß-Untereinheit bilden zusammen eine Einheit mit der Bindungsstelle für ein Adeninnukleotid, wobei an der Katalyse vor allem die ß-Untereinheit beteiligt ist. In dem untersuchten F1-Kristall trug eine α+ß-Einheit ein ADP, die zweite das ATP-Analogon, während die dritte α+ß-Einheit unbesetzt war. Diese drei ß-Untereinheiten lagen auch in deutlich verschiedenen Konformationen vor. In Abbildung 4.9 sind diese strukturellen Unterschiede der ß-Untereinheiten symbolisch markiert.

Eine weitere Asymmetrie betrifft die Anordnung der γ-Untereinheit; diese zieht sich durch das Zentrum des F1-Teils und ist nach der Seite der mit ADP beladenen α+ß-Einheit geneigt (Abb. 4.7, 4.9. Die beobachteten Asymmetrien geben wichtige Einblicke in die Funktionsweise des F1-Teils der ATP-Synthase. Bevor darauf näher eingegangen wird, sollen zunächst einige grundsätzliche Überlegungen zur ATP-Synthese vorangestellt werden.

4.4 Die Synthese des ATP wird durch eine Konformationsänderung des Proteins bewirkt
Für die Hydrolyse von ATP gilt:

Aufgrund der hohen freien Enthalpie der Hydrolyse ist ATP eine energiereiche Substanz. Es sei jedoch betont, dass der Standardwert !:,.GO' für eine wässrige Lösung von 1 mol/L ATP ermittelt wurde, dies entspricht einer Wasserkonzentration von 55 mol/L. Hätte man eine Wasserkonzentration von nur 10-4 mol/L, dann wäre für die ATP-Hydrolyse ein ΔG gleich +2,2 kJ/mol. Das bedeutet, dass bei sehr niedrigen Wasserkonzentrationen die Reaktion in Richtung ATP-Synthese abläuft. Wir sehen aus diesem Beispiel: Bei Abwesenheit von Wasser benötigt die Synthese von ATP keine Energiezufuhr.
Ein Reaktionsort unter Ausschluss von Wasser könnte das katalytische Zentrum eines Enzyms sein. Katalytische Zentren liegen häufig in einem hydrophoben Bereich des Enzymproteins, in dem Substrate unter Wasserausschluss gebunden werden. Bei einer festen Bindung von ADP und Phosphat an das Enzym könnte die ATP-Synthese freiwillig, das heißt ohne Verbrauch von Energie erfolgen (Abb. 4.10). Dies ist für die H+-ATP-Synthase auch experimentell bewiesen worden. Wenn die eigentliche ATP-Synthese keine Energie verbraucht, muss der Energiebetrag, der in der wässrigen Phase für die Bildung von ATP aus ADP und Phosphat erforderlich ist, an anderer Stelle aufgewendet werden - wahrscheinlich für die Ablösung des festgebundenen, neusynthetisierten ATP von der Bildungsstelle. Dies könnte durch eine energieabhängige Konformationsänderung geschehen.

Paul Boyer (USA) stellte 1977 die Hypothese auf, dass in einem F1-Protein drei identische katalytische Bindungsstellen für ADP oder ATP in ihrer Funktion alternieren (Abb. 4.11). Zu jedem Zeitpunkt liegt eine der Bindungsstellen in der L-Form vor, die ADP und Phosphat locker bindet, aber katalytisch nicht aktiv ist. Eine zweite Bindungsstelle T bindet ADP und ATP sehr fest (engl. tight) und ist katalytisch aktiv. Die dritte Bindungsstelle O ist offen, sie bindet ADP und ATP nur sehr schwach und ist katalytisch inaktiv. Nach dieser binding-change-Hypothese wird bei der Synthese von ATP ein Cyclus durchlaufen: Als erstes werden ADP und Phosphat an die leichte Bindungsstelle L gebunden. Durch eine Konformationsänderung des F1-Proteins wird die Stelle L in eine Bindungsstelle T verwandelt, an der unter Ausschluss von Wasser aus ADP und Phosphat ATP synthetisiert wird, wobei das gebildete ATP sehr fest gebunden ist. Durch eine weitere Konformationsänderung wird die Bindungsstelle T in eine offene Bindungsstelle O umgewandelt, und das gebildete ATP wird freigesetzt. Ein entscheidender Punkt bei dieser Hypothese ist, dass bei jedem durch die Energie des Protonengradienten getriebenen Konformationswechsel von F1 die Konformation der drei Zentren gleichzeitig in die jeweils nächste Konformation übergeht (L➨T T➨O, O➨L). Die besprochenen Ergebnisse der Röntgenstrukturanalyse unterstützen diese Hypothesen. Die nach der „binding-change"-Hypothese geforderten, jeweils unterschiedlichen Konformationen der drei katalytischen Zentren wurden nachgewiesen. Für diese Ergebnisse wurden Paul Boyer und John Walker 1997 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet. Allerdings sind Details dieses Mechanismus immer noch umstritten.

Aus den Strukturanalysen wurde gefolgert, dass die zentrale γ-Untereinheit eine Drehbewegung ausführt. Dabei bilden die γ- und ε-Untereinheiten mit den c-Untereinbeiten von Fo einen Rotor (in Abb. 4.7 rot markiert) der sich in einem Stator, bestehend aus den Untereinheiten a, b, b', δ und (αß)3, dreht. Nach diesem Modell dreht sich innerhalb des starr an die Membran gekoppelten F1-Teils die von dem Rotor angetriebene γ-Untereinheit und bewirkt mit jeder vollständigen Umdrehung die in Abb. 4.11 gezeigten Konformationsänderungen zur Bildung von drei ATP-Molekülen.
Dieses Modell wurde durch ein Aufsehen erregendes Experiment von Masasuka Yoshida und Kazohiko Kinosita aus Japan bestätigt. Die Forscher hefteten bei einem in einer Membran befindlichen Fo-Teil an das obere Ende der γ-Untereinheit ein großes fluoreszierendes Molekül und zeigten durch spezielle Video-Mikroskopie, dass sich, durch die Hydrolyse von ATP angetrieben, die γ-Untereinheit tatsächlich drehte. Somit kann der Fo-Teil als ein sehr kleiner Nano-Motor angesehen werden. Für die F-ATP-Synthese der Chloroplasten wurde eine Drehgeschwindigkeit von maximal 160 Umdrehung pro Sekunde errechnet.
Es stellt sich die Frage, wie dieser Nano-Motor durch einen Protonengradienten angetrieben wird. Zur Erklärung wurde von Wolfgang Junge (Osnabrück) auf Grund bekannter Strukturdaten das in Abb. 4.12 gezeigte Modell entwickelt. Hierbei besitzt die a-Untereinheit des Stators (in grau) einen Kanal durch welchen Protonen von der Außenseite der Membran an eine Bindungsstelle einer c-Untereinheit des Rotors, möglicherweise ein Glutamatrest, gelangen können. An einer anderen Stelle des Stators befindet sich ein weiterer Kanal, durch welchen an die c-Untereinheit gebundene Protonen in den Innenraum entlassen werden. Durch eine Drehung des Rotors (in rosa), hervorgerufen durch Brownsche Bewegung, können so Protonen von außen nach innen geleitet werden. Wie kommt es aber, dass die Drehung nur in einer Richtung erfolgt? Hierfür sind zwei Faktoren verantwortlich, die seitliche Versetzung der beiden Zugangskanäle und ein positiv geladener Argininrest der Untereinheit a des Stators, der die mit Protonen beladenen c-Untereinheiten abstößt, wodurch eine Rückwärtsdrehung des Rotors verhindert wird und dadurch eine Drehung durch Brownsche Bewegungen nach nur einer Richtung möglich ist.

Getrieben durch den angelegten Protonengradienten, der eine Beladung und Entladung der Protonenbindungsstellen an den betreffenden Kanälen bewirkt, dreht sich der Nano-Motor nach dem Modell einer Ratsche Schritt für Schritt in einer Richtung und bewirkt so mit einer vollständigen Umdrehung die Konformationsänderungen im F1-Teil welche die Synthese von 3 Molekülen ATP bewirken. Wenngleich dieses Modell in seinen Details noch experimentell überprüft werden muss, vermittelt es doch eine plausible Vorstellung, wie der Nano-Motor der ATP-Synthase durch einen Protonengradienten angetrieben wird.
Wie bereits erwähnt, gibt es in manchen Bakterien eine F-ATP-Synthase, die durch einen Na+-Gradienten getrieben wird. Das hier geschilderte Modell lässt sich auch auf einen Na+-Gradienten übertragen, wo bei die beiden partiellen Ionenkanäle Na+ leiten und die Untereinheit-c Na+ bindet. Es besteht immer noch Unsicherheit darüber, aus wie vielen c-Untereinheiten der Rotor besteht. Wahrscheinlich ist diese Zahl variabel. Bisherige Untersuchungen der Anzahl der c-Untereinheiten pro F-ATP-Synthase Molekül, die allerdings noch mit Unsicherheiten behaftet sind, ergaben Werte von 12-14 für Chloroplasten, 10 für Hefemitochondrien und 12 für E. coli. Da sich in verschiedenen Organismen die Anzahl der c-Untereinheiten im Rotor von Fo unterscheidet, ist entsprechend auch eine unterschiedliche Anzahl von Protonen für eine Umdrehung, und damit pro drei ATP gebildet, erforderlich.

Beim photosynthetischen Elektronentransport ist die Stöchiometrie zwischen der Bildung von NADPH und ATP noch nicht endgültig geklärt
Nach dem im vorangehenden Abschnitt besprochenen Rotormodell würde in Chloroplasten mit 14 c-Untereinheiten pro Rotor eine vollständige Umdrehung 14 Protonen erfordern. Da bei einer Umdrehung 3 Moleküle ATP gebildet werden, entspräche dies einer H+/ATP-Stöchiometrie von 4,7. Unabhängige Messungen sprechen dafür, dass in Chloroplasten mindestens 4 Protonen für die Synthese von 1 ATP erforderlich sind, was mit der Protonenstöchiometrie des Rotormodells übereinstimmen würde. Es ist noch unklar, in welchem Maße der Q-Cyclus am Protonentransport beteiligt ist. Beim linearen (nicht-cyclischen) Elektronentransport werden pro gebildetes NADPH ohne Q-Cyclus vier (PSII 2H+, Cyt-b6/f-Komplex 2H+), mit Q-Cyclus (Cyt-b6/f-Komplex 4H+) sechs Protonen in das Lumen transportiert (siehe Abschn. 3.7). Bei einer Stöchiometrie H+/ATP = 4,7 würden im nichtcyclischen Elektronentransport mit Q-Cyclus pro NADPH 1,3 ATP gebildet werden, ohne Q-Cyclus nur 0,9. Für die in Kapitel 6 behandelte C02-Assimilation werden 1,5 ATP pro l NADPH gebraucht. Die Frage der Stöchiometrie der Photophosphorylierung ist noch nicht endgültig beantwortet.

Die H+-ATP-Synthase der Chloroplasten wird durch Licht reguliert
Die H+-ATP-Synthase katalysiert eine im Prinzip reversible Reaktion. In Chloroplasten wird ein pH-Gradient über die Thylakoidmembran nur bei Belichtung aufgebaut. Eine Reversibilität der ATP-Synthase würde daher im Dunkeln dazu führen, dass dann die ATP-Synthese in umgekehrter Richtung operiert und unter Spaltung von ATP Protonen in den Thylakoidraum transportiert. Um diese "verlustreiche" Rückreaktion auszuschalten, wird die chloroplastidäre ATP-Synthase strikt reguliert. Hierfür gibt es zwei Wege. Wenn der pH-Gradient über der Thylakoidmembran unter einen Schwellenwert absinkt, werden die katalytischen Zentren auf den ß-Untereinheiten augenblicklich abgeschaltet und bei Belichten wieder eingeschaltet. Der Mechanismus dieses Weges wird noch nicht verstanden. Außerdem unterliegt die chloroplastidäre ATP-Synthase einer Modulation durch ein Thiol. Durch diesen Vorgang, den wir in Abschnitt 6.6 noch ausführlich besprechen, wird unter Lichteinwirkung eine S-S-Brücke in der γ-Untereinheit von F1 durch Ferredoxin unter Vermittlung von Thioredoxin zu zwei SH-Gruppen reduziert und dadurch F1 eingeschaltet. Im Dunkeln werden die beiden SH-Gruppen durch Luftsauerstoff wieder zu dem Disulfid oxidiert und so die katalytischen Zentren in den ß-Untereinheiten abgeschaltet. Die Überlagerung der zwei Regulationsmechanismen erlaubt eine effiziente Kontrolle der ATP-Synthase in Chlroplasten.

Eine V-ATPase ist mit der F-ATP-Synthase verwandt
Vakuolen enthalten eine protonentransportierende V-ATPase (V = Vakuole). Diese ist in allen Eukaryoten konserviert; manche V-ATPasen transportieren auch anstatt von Protonen Na+-Jonen. Die V-ATPase hat die gleiche Grundstruktur wie die F-ATP-Synthase. Sie enthält einen in das Cytosol hineinragenden Kopf, bestehend aus 3 A- und 3 B-Untereinheiten (die wie die α- und ß-Untereinheiten der F-ATP-Synthase alternierend angeordnet sind), einen Stiel sowie einen Fo-Teil in der Membran. F-ATP-Synthase und V-ATPase stammen offensichtlich von einem gemeinsamen Vorläufer ab. Die Anzahl von Protonenen, die pro verbrauchtem ATP transportiert werden, hängt davon ab, wie viele c-Untereinheiten der Rotor im Fo-Teil enthält. In Pflanzen kommt die V-ATPase in Membranen der Vakuole und des Golgi-Apparates vor. Hauptfunktion dieser Protonenpumpe ist die Ansäuerung der Vakuole und die Erzeugung eines Protonengradienten für den Transport von Ionen. Sie kann in Vakuolen titrierbare Protonenkonzentrationen von bis zu 1,4 mol/L erzeugen (siehe Abschn. 8.5). Daneben enthalten Vakuolenmembranen eine H+-Pyrophosphatase, die unter Spaltung von einem Molekül Pyrophosphat zu Phosphat ein Proton in die Vakuole pumpt, dabei aber nicht so hohe Gradienten erzielt wie die V-ATPase. Die H+-Pyrophosphatase besteht nur aus einem einzigen Protein mit wahrscheinlich 16 transmembranen Helices. Über die Arbeitsteilung zwischen der H+-Pyrophosphatase und der V-ATPase beim Pumpen von Protonen in die Vakuole wird derzeit intensiv geforscht. Die Frage ist noch nicht beantwortet, warum es in der Vakuolenmembran zwei H+ -transportierende Enzyme gibt. In Plasmamembranen gibt es eine protonentransportierende P-ATPase, auf die in Abschnitt 8.2 eingegangen wird.nach oben zum Kapitelanfang

5 Mitochondrien sind die Kraftwerke der Zellen
Bei der biologischen Oxidation werden Substrate, wie zum Beispiel Kohlenhydrate, durch Luftsauerstoff oxidiert, es entstehen dabei Wasser und C02. Die biologische Oxidation stellt somit eine Umkehrung der Photosynthesereaktion dar. Sie hat sich ja auch erst nach der Entstehung des Sauerstoffs in der Atmosphäre durch die Photosynthese entwickelt. Die biologische Oxidation dient ebenso wie die Photosynthese der Erzeugung von Energie in Form von ATP. Sie verläuft über einen Transport von Elektronen durch eine mitochondriale Elektronentransportkette. Diese weist auffallende Ähnlichkeiten mit der in Kapitel 3 besprochenen photosynthetischen Elektronentransportkette auf. Wie in diesem Kapitel dargestellt wird, ist sie ebenfalls bausteinartig aus drei Komplexen zusammengesetzt, von denen der mittlere Komplex in Struktur und Funktion dem im vorigen Kapitel beschriebenen Cytochrom-b6/f-Komplex der Chloroplasten entspricht. Wie bei der Photosynthese sind auch bei der mitochondrialen Oxidation Elektronentransport und ATP-Synthese über die Bildung eines Protonengradienten miteinander gekoppelt. Die Synthese des ATP erfolgt über eine F-ATP-Synthase, wie sie bereits bei der Behandlung der Photosynthese im vorigen Kapitel besprochen wurde. Bei der Behandlung der mitochondrialen Oxidation können wir daher in einigen wesentlichen Teilen auf die Beschreibung der betreffenden Reaktionen im Rahmen der Photosynthese in den Kapiteln 3und 4 zurückgreifen.

5.1 Vor der biologischen Oxidation werden die Substrate in gebundenen Wasserstoff und Kohlendioxid zerlegt
Die biologische Oxidation entspricht in ihrer Gesamtreaktion einer Verbrennung. Im Gegensatz zur Verbrennung erfolgt jedoch die biologische Oxidation in vielen Teilschritten, wodurch der größte Teil der dabei umgesetzten freien Enthalpie für die Synthese von ATP genutzt werden kann. Das Prinzip der biologischen Oxidation wurde 1932 von dem Nobelpreisträger Heinrich Wieland formuliert:

Demnach wird von einem Substrat XH2 zunächst Wasserstoff abgespalten und dieser dann zu Wasser oxidiert. So erfolgt bei der Oxidation von Kohlenhydraten [CH20]n zunächst unter Verbrauch von Wasser eine Zerlegung des Substrats in C02 und gebundenen Wasserstoff [H], letzterer wird dann zu Wasser oxidiert:

Otto Warburg (Nobelpreisträger für Medizin 1931) zeigte 1934, dass die Übertragung dieses Wasserstoffs vom Substrat zum Sauerstoff in gebundener Form über NADH erfolgt. Anhand von Untersuchungen an Homogenaten aus Taubenmuskel formulierte Hans Krebs 1937 den Citratcyclus (der auch als Krebs-Cyclus bezeichnet wird) als einen Mechanismus der Substratzerlegung, der bei der biologischen Oxidation die Reduktionsäquivalente für die Reduktion von Sauerstoff liefert. Er erhielt dafür 1953 den Nobelpreis für Medizin. Der Ablauf des Citratcyclus wird in Abschnitt 5.3 ausführlich behandelt.

5.2 Zellatmung findet in den Mitochondrien statt
Um die Mitte des 19. Jahrhunderts wurden durch lichtmikroskopische Studien in vielen verschiedenen Zellen kleine Granula, die in ihrer Form Bakterien ähnelten, nachgewiesen. Der Botaniker C. Benda prägte um 1900 für diese Granula die Bezeichnung Mitochondrien, das heißt fadenförmige Körper. Die Funktion dieser Mitochondrien blieb jedoch lange ungeklärt.
Otto Warburg erkannte bereits 1913, dass die Zellatmung an granuläre Zellbestandteile gebunden ist. Es gelang ihm, aus Hefe ein „Atmungsferment" zu isolieren, das die Oxidation durch Sauerstoff katalysiert, außerdem erkannte er die wichtige Funktion des Eisens bei dieser Katalyse. David Keilin aus Cambridge (England) entdeckte 1925 die Cytochrome und ihre Beteiligung an der Zellatmung. Mit Hilfe eines Handspektroskops identifizierte er die Cytochrome-a, -a3, -b und -c (Abb. 3.24). Otto Warburg zeigte 1928, dass das von ihm isolierte "Atmungsferment" Cytochrom-a3 enthält. Ein weiterer Meilenstein für die Aufklärung der Zellatmung war die Beobachtung von Hermann Kalckar im Jahre 1937, dass in aeroben Systemen die Bildung von ATP vom Sauerstoffverbrauch abhängig ist. Damit wurde das Zusammenspiel zwischen Zellatmung und ATP-Synthese, die oxidative Phosphorylierung, erkannt. Eugene Kennedy und Albert Lehninger gelang 1948 der Nachweis, dass Mitochondrien die Träger der Enzyme des Citratcyclus und der oxidativen Phosphorylierung sind. Seit dieser Zeit wissen wir, dass die Mitochondrien die Kraftwerke der Zelle sind.

font color="ff0000">Mitochondrien bilden ein eigenes Stoffwechselkompartiment
Wie die Plastiden, so bilden auch Mitochondrien ein eigenes Stoffwechselkompartiment. Die Struktur des mitochondrialen Kompartiments wird in Abschnitt 1.4 ausführlich behandelt. Abbildung 5.1 zeigt den mitochondrialen Stoffwechsel in einem Überblick. Die Fragmentierung von Substraten zu C02 und Wasserstoff (gebunden an den Transportmetaboliten NADH) erfolgt in der mitochondrialen Matrix. Das gebildete NADH gelangt durch die Matrix an die Innenseite der mitochondrialen Innenmembran und wird durch die in dieser Membran lokalisierte Atmungskette oxidiert. Die Atmungskette besteht aus einer Sequenz von Redoxreaktionen, durch die Elektronen vom NADH auf Sauerstoff übertragen werden. Ebenso wie beim photosynthetischen Elektronentransport wird auch beim mitochondrialen Elektronentransport die freiwerdende Energie zur Bildung eines Protonengradienten genutzt, der dann die Synthese von ATP treibt. Das so gebildete ATP wird aus den Mitochondrien exportiert und dient der Zelle als Energiequelle für alle energieverbrauchenden Prozesse. Diese Bereitstellung von ATP für die Zelle ist die universelle Funktion der Mitochondrien aller eukaryontischen Zellen.

5.3 Die Substrate für die biologische Oxidation werden im Matrixraum fragmentiert
Ein Ausgangsprodukt für die Substratfragmentierung durch den Citratcyclus ist Pyruvat, das durch den glycolytischen Abbau der Glucose im Cytosol gebildet wird. Abbildung 5.2 zeigt eine Bilanz des Vorganges. Das Pyruvat wird zunächst zu Acetat (in Form von Acetyl-Coenzym A) oxidiert, im eigentlichen Cyclus erfolgt dann der vollständige Abbau zu C02.

Dabei werden insgesamt zehn reduzierende Äquivalente [H] gebildet, deren Oxidation durch Sauerstoff zur Synthese von ATP genutzt wird. Abbildung 5.3 zeigt die Reaktionsschritte des Citratcyclus in einer Übersicht.


Pyruvat wird durch einen Multienzymkomplex oxidiert
Die Oxidation des Pyruvats wird durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex katalysiert, einen Multienzymkomplex in der mitochondrialen Matrix. Dieser besteht aus drei verschiedenen katalytischen Untereinheiten, die man als Pyruvat-Dehydrogenase, Dihydrolipoyl-Transacetylase und Dihydrolipoyl-Dehydrogenase bezeichnet (Abb. 5.4). Die Pyruvat-Dehydrogenase-Untereinheit enthält Thiaminpyrophospbat (TPP, Abb. 5.5A ) als prosthetische Gruppe (der Teil eines Proteins, der keine Aminosäuren enthält). Reaktive Gruppe des TPP ist der Thiazolring. Aufgrund des positiv geladenen N-Atoms enthält der Thiazolring ein azides C-Atom. Nach Abspaltung eines Protons bildet sich ein Carbanion, das sich an den Carbonylkohlenstoff des Pyruvats anlagert. Das positiv geladene N-Atom des Thiazolringes fördert die Decarboxylierung des gebundenen Pyruvats, es entsteht so Hydroxyethyl-TPP (Abb. 5.4).

Die Hydroxyethylgruppe wird nun auf Liponsäure übertragen. Die Liponsäure ist eine prosthetische Gruppe der Dihydrolipoyl-Transacetylase-Untereinheit. Sie ist über die Carboxygruppe als Säureamid an einen Lysinrest des Enzymproteins kovalent gebunden (Abb. 5.5B). Der Liponsäurerest hängt dadurch praktisch an einer langen Kette und kann so mit verschiedenen Reaktionsorten innerhalb des Multienzymkomplexes reagieren. Die Liponsäure enthält zwei S-Atome, die durch eine Disulfidbrücke verknüpft sind. Bei der Übertragung des Hydroxyethylrestes auf den Liponsäurerest findet eine Redoxreaktion statt: Die Liponsäure wird zur Dihydroliponsäure reduziert und der Hydroxyethylrest zu einem Acetylrest oxidiert. Letzterer ist als Thioester mit der Dihydroliponsäure verbunden. Auf diese Weise wird die bei der Oxidation der Carbonylgruppe freiwerdende Energie durch die Bildung eines energiereichen Thioesters konserviert. Der Acetylrest wird nun von der Dihydrolipoyl-Transacetylase auf die Sulfhydrylgruppe des Coenzyms A übertragen (Abb. 5.5C) , und es entsteht so Acetyl-Coenzym A. Acetyl-CoA - das auch als aktive Essigsäure bezeichnet wird - wurde von dem Münchner Feodor Lynen (Nobelpreis für Medizin 1964) entdeckt. Die Dihydroliponsäure wird durch die Dihydrolipoyl-Dehydrogenase wieder zur Liponsäure oxidiert, dabei wird unter Vermittlung von FAD (siehe Abb. 5.16) NAD+ zu NADH reduziert. Es sei hier erwähnt, dass es einen Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex auch in den Chloroplasten gibt, dessen Funktion bei der Lipidbiosynthese in Abschnitt 15.3 besprochen wird.


Im Citratcyclus wird Acetat vollständig oxidiert
Acetyl-Coenzym A tritt nun in den eigentlichen Citratcyclus ein und kondensiert mit Oxalacetat zu Citrat (Abb. 5.6) . Diese Reaktion wird durch das Enzym Citrat-Synthase katalysiert. Die Thioestergruppe begünstigt die Ablösung eines Protons am Acetylrest, das so gebildete Carbanion bindet an den Carbonylkohlenstoff des Oxalacetats. Die darauf folgende Abspaltung des CoA-SH macht die Reaktion irreversibel.

Das Enzym Aconitase (Abb. 5.7) katalysiert die reversible Isomerisierung des Citrats zum Isocitrat. Dabei erfolgt zunächst eine Wasserabspaltung, das dabei gebildete cis-Aconitat bleibt am Enzym gebunden und reagiert durch Wasseranlagerung zu Isocitrat. Neben der mitochondrialen Aconitase gibt es auch ein lsoenzym der Aconitase im Cytosol.

Die Oxidation des Isocitrats zu α-Ketoglutarat durch die NAD-Isocitrat-Dehydrogenase (Abb. 5.8) führt zur Bildung von NADH. Dabei entsteht als Intermediat Oxalsuccinat, das noch am Enzym gebunden zu α-Ketoglutarat decarboxyliert wird. Diese Reaktion ist dadurch irreversibel.

Neben der NAD-lsocitrat-Dehydrogenase der Mitochondrien gibt es dort auch ein NADP-abhängjges Enzym. NADP-Isocitrat-Dehydrogenasen kommen auch im Chloroplastenstroma und im Cytosol vor. Die Funktion letzteren Enzyms wird in Abschnitt 10.4 behandelt.
Die Oxidation des α-Ketoglutarats zum Succinyl-CoA (Abb. 5.8) erfolgt durch den α-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex unter Beteiligung von Thiaminpyrophosphat, Liponsäure und FAD analog zu der oben besprochenen Oxidation des Pyruvats zu Acetyl-CoA.
Die Thioesterbindung des Succinyl-CoA ist eine energiereiche Bindung. Durch die Succinat-Thiokinase wird die freie Enthalpie bei der Hydrolyse dieses Thioesters zur Bildung von ATP genutzt (Abb. 5.9). Das gebildete Succinat wird durch die Succinat-Dehydrogenase zu Fumarat oxidiert. Die Succinat-Dehydrogenase ist das einzige Enzym des Citratcyclus, das nicht in der Matrix lokalisiert ist, sondern als Komponente der Atmungskette in der mitochondrialen Innenmembran angeordnet ist (siehe Abschn. 5.5).

Die bei der Succinatoxidation anfallenden Redoxäquivalente werden auf Ubichinon übertragen. Durch die Fumarase wird an die C=C-Doppelbindung des Fumarats in trans-Addition Wasser angelagert, und es entsteht dabei L-Malat. Diese Reaktion (Abb. 5.9) ist reversibel. Die Malat-Dehydrogenase katalysiert den letzten Schritt des Citratcyclus, unter Reduktion von NAD+ wird Oxalacetat gebildet (Abb. 5.9). Eine Besonderheit dieser Reaktion ist, dass das Gleichgewicht weit auf der Seite der Edukte liegt:

Für den Ablauf des Citratcyclus ist es daher entscheidend, dass (wie oben besprochen) die Citratsynthase-Reaktion irreversibel ist. Es kann so das Oxalacetat dem Malat-Debydrogenase-Gleicbgewicht entzogen werden, um im Cyclus weiter zu reagieren. Isoenzyme der Malat-Dehydrogenase kommen auch außerhalb der Mitochondrien vor. Sowohl das Cytosol wie auch die peroxisomale Matrix enthalten NAD-Malat-Dehydrogenase und das Chloroplastenstroma eine NADP-Malat-Dehydrogenase. Die Funktion dieser Enzyme wird in Kapitel 7 behandelt.

Durch anaplerotische Reaktionen wird ein Verlust von Intermediaten des Citratcyclus ausgeglichen
Der Citratcyclus kann nur ablaufen, wenn Oxalacetat als Akzeptor des Acetylrestes vollständig regeneriert wird. Der pflanzliche Citratcyclus läuft insbesondere am Tag oft nicht als Cyclus ab, weil z. B. bei der Nitratassimilation dem Citratcyclus Citrat und α-Ketoglutarat entzogen werden. Ein weiteres Beispiel tritt bei der Mobilisierung von Speicherlipiden zur Synthese von Hexosen während der Samenkeimung auf. Bei diesem Prozess wird den Mitochondrien Oxalacetat entzogen und dem Citratcyclus in Form von Succinat wieder zugeführt. Der Verlust an Intermediaten des Citratcyclus muss daher durch ein Auffüllen ausgeglichen werden. Reaktionen, die solche Zwischenprodukte nachliefern, nennt man anaplerotische Reaktionen. Pflanzenmitochondrien können im Gegensatz zu Mitochondrien aus tierischen Geweben Oxalacetat durch einen spezifischen Translokator (Abschn. 5.8) über die innere Mitochondrienmembran transportieren. Durch die Aufnahme von Oxalacetat, das durch Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (siehe Abschn. 8.2) im Cytosol gebildet wird, kann so der Citratcyclus aufgefüllt werden. Dies kann auch durch die Oxidation von Malat bewirkt werden. Malat wird in der Vakuole gespeichert (Abschn. 1.2, 8.2) und ist ein wichtiges Substrat für die mitochondriale Atmung. Über NAD-Malat-Enzym in der Matrix - eine Besonderheit von Pflanzenmitochondrien - wird Malat unter Reduktion von NAD+ und Decarboxylierung zu Pyruvat oxidiert (Abb. 5.10). Es kann so durch ein Zusammenspiel von Malat-Dehydrogenase und NAD-Malat-Enzym aus Malat allein Citrat gebildet werden, ohne dass dabei der komplette Citratcyclus abläuft (Abb. 5.3). Es sei hier erwähnt, dass auch ein NADP-abhängiges Malat-Enzym in Chloroplasten vorkommt (Abschn. 8.4).

Ein weiteres wichtiges Substrat der mitochondrialen Oxidation ist Glutamat. Glutamat ist ein Hauptprodukt der Nitratassimilation (Abschn. 10.1) und ist in vielen Pflanzenzellen neben Saccharose die am höchsten konzentrierte organische Verbindung. Die Oxidation des Glutamats unter Bildung von NADH wird durch die in der mitochondrialen Matrix lokalisierte Glutamat-Dehydrogenase katalysiert (Abb. 5.11). Das Enzym reagiert auch mit NADP+. NADP-Glutamat-Dehydrogenaseaktivität ist auch in Plastiden vorhanden.

In Mitochondrien aus Mesophyllzellen ist während der Lichtphase vor allem Glycin das Substrat der Atmung. Die Oxidation von Glycin ist ein Teilschritt des Photorespirationsweges und wird in diesem Zusammenhang in Abschnitt 7.1 behandelt.

5.4 Wieviel Energie wird bei der Oxidation von NADH umgesetzt?
Wieviel Energie wird bei der mitochondrialen Atmung frei, oder genauer gesagt, wie groß ist die Änderung der freien Enthalpie bei den ablaufenden Redoxprozessen? Zur Beantwortung dieser Frage ermitteln wir zunächst die Differenz der Potenziale der beteiligten Redoxpaare. Das Potenzial eines Redoxpaares lässt sich aus der Nernstschen Gleichung berechnen:

Für das Redoxpaar NAD+/NADH beträgt das Standardpotenzial Eo' = -0,320 V Unter bestimmten Stoffwechselbedingungen wurde in Mitochondrien aus Blättern ein Verhältnis NAD+/NADH = 3 gemessen. Daraus erhält man:

Für das Redoxpaar H20/02 beträgt das Standardpotenzial:

Für das entsprechende erste Potenzial kann für [O2] der Partialdruck des Sauerstoffs in der Luft eingesetzt werden.

Der Partialdruck des O2 in der Luft (pO2) beträgt 0,2. Wir erhalten also:

Die Differenz der Potenziale beträgt:

Für die Verknüpfung von freier Enthalpie (ΔG) mit ΔE gilt:

Da bei der Reaktion zwei Elektronen umgesetzt werden, ergibt sich nach Einsetzen von ΔE obige Gleichung, dass bei der Oxidation von NADH durch die Atmungskette die Änderung der freien Enthalpie ΔG = - 214 kJ/mol beträgt.
Wieviel Energie ist zur Bildung von ATP erforderlich? In Abschnitt 4.1 wurde berechnet, dass die Synthese von ATP bei den im Chloroplastenstroma herrschenden Konzentrationen mit einer Änderung der freien Enthalpie ΔG = + 50 kJ/mol einhergeht. Dieser Wert gilt in etwa auch für das ATP, das von den Mitochondrien für das Cytosol bereitgestellt wird.
Die bei der Oxidation von NADH freiwerdende Energie würde demnach für die Bildung von mehr als vier Molekülen ATP ausreichen. Tatsächlich ist die Menge an gebildetem ATP jedoch wesentlich geringer (siehe Abschn. 5.6).

5.5 Die mitochondriale Atmungskette besitzt Gemeinsamkeiten mit der Elektronentransportkette der Photosynthese
Der Photosynthese der Cyanobakterien verdanken wir den Sauerstoff der frühen Erdatmosphäre und damit die Grundlage des oxidativen Stoffwechsels der Mitochondrien. Viele Cyanobakterien können ihren Energiebedarf sowohl durch Photosynthese als auch durch Oxidationsstoffwechsel decken. Wie in Kapitel 3 besprochen, enthalten Cyanobakterien eine Photosynthesekette, die aus drei Modulen (Komplexen) besteht: Photosystem II, dem Cytb6/f- Komplex und Photosystem I (Abb. 5.12). Diese Komplexe sind in der inneren Membran der Cyanobakterien lokalisiert. In der gleichen Membran enthalten Cyanobakterien aber auch einen Enzymapparat, den sie zur Atmung benötigen, die Atmungskette. Diese besteht wiederum aus drei Modulen: einem NADH-Dehydrogenase-Komplex, der die Oxidation des NADH bewirkt, dem gleichen Cyt-b6/f-Komplex, der auch Teil der photosynthetischen Elektronentransportkette ist, sowie einem Cyt-a/a3-Komplex, durch den Sauerstoff zu Wasser reduziert wird. Dabei stellt Plastochinon nicht nur bei der Photosynthese (Abschn. 3.7), sondern auch beim oxidativen Elektronentransport die Verbindung für den Elektronentransport zum Cytb6/f-Komplex her. Gleichermaßen wird durch Cyt-c sowohl die Verbindung vom Cyt-b6/f-Komplex zum Photosystem I als auch zum Cyt-a/a3-Komplex hergestellt.

Am Beispiel der Cyanobakterien wird die Verwandtschaft zwischen dem photosynthetischen und oxidativen Elektronentransport deutlich: Beide Elektronentransportketten besitzen mit dem Cyt-b6/f-Komplex das gleiche Modul als Mittelteil. In Abschnitt 3.7 wurde beschrieben, dass der Cytb6/f- Komplex einen Transport von Protonen bewirkt, wodurch die beim Elektronentransport freiwerdende Energie zur Bildung eines Protonengradienten genutzt wird. Man erkennt daraus, dass das Prinzip der Energiekonservierung beim photosynthetischen und oxidativen Elektronentransport gleich ist.
Die Atmungskette der Mitochondrien ist analog zur Atmungskette der Cyanobakterien aufgebaut (Abb. 5.13). Sie unterscheidet sich von der der Cyanobakterien lediglich darin, dass Ubichinon anstelle von Plastochinon Redoxüberträger ist und andere geringfügig veränderte Cytochrome beteiligt sind. Statt einem Cyt-b6/f-Komplex besitzen die Mitochondrien den verwandten Cyt-b/c1-Komplex. Cyt-c und Cyt-f enthalten beide Häm-c.


Die Komplexe der mitochondrialen Atmungskette
Die Untergliederung der Atmungskette in einzelne Komplexe geht auf Arbeiten von Youssef Hatefi zurück, dem es 1962 gelang, aus Rinderherz-Mitochondrien vier verschiedene Komplexe (die von ihm als Komplexe I bis IV bezeichnet wurden) zu isolieren. In den Komplexen I, III und IV ist der Elektronentransport jeweils mit einem Abfall des Redoxpotenzials verbunden (Abb. 5.14), dort wird die freiwerdende Energie zur Bildung eines Protonengradienten genutzt.

Der NADH-Dehydrogenase-Komplex (Komplex I) (Abb. 5.15) "füttert" die Elektronen von dem bei der Substratzerlegung in der Matrix gebildeten NADH in die Atmungskette ein. Über ein Flavin und mehrere Eisen-Schwefel-Zentren gelangen die Elektronen von hier auf Ubichinon. Dieser Komplex besitzt von allen mitochondrialen Elektronentransportkomplexen den kompliziertesten Aufbau: Er ist aus insgesamt mehr als 40 verschiedenen Untereinheiten (von denen je nach Organismus 7-9 in den Mitochondrien codiert sind) zusammengesetzt und besteht aus einem Teil, der in die Membran eingebettet ist (Membranteil), und einem peripheren Teil, der in den Matrixraum hineinragt.

Der periphere Teil enthält die Bindungsstelle für NADH, ein gebundenes Flavinmononukleotid (FMN) (Abb. 5.16) sowie mindestens acht Fe-S-Zentren (Abb. 3.26). Der Membranteil enthält einen bislang unbekannten Elektronenüberträger sowie die Bindungsstelle des Ubichinons. Die Bindungsstelle des Ubichinons befindet sich innerhalb des peripheren Teils in der Nähe der Berührungsfläche mit dem Membranteil. Es wird vermutet, dass die Reduktion des Ubichinons Konformationsänderungen im Membranteil induziert, die eine Verschiebung von Protonen aus der mitochondrialen Matrix in den Intermembranraum bewirken. Die Aktivität des Komplex I wird durch eine Vielzahl pflanzlicher oder bakterieller Gifte, beispielsweise Rotenon (es schützt Pflanzen vor tierischem Fraß), das Antibiotikum Piericidin A sowie durch Amytal, ein Barbiturat, gehemmt. Der durch Komplex I katalysierte Elektronentransport ist dabei reversibel. Es ist daher möglich, dass durch die protonenmotorische Kraft des Protonengradienten Elektronen vom Ubichinon auf NAD+ übertragen werden. Auf diese Weise wird in Purpurbakterien durch einen homologen NADH-Dehydrogenase-Komplex NADH bereitgestellt (siehe Abb. 3.1).

Die Succinat-Dehydrogenase (Komplex II) (Abb. 5.9) enthält als Elektronenakzeptor ein Flavinadenindinukleotid (FAD, Abb. 5.16) und als weitere Redoxüberträger mehrere Fe-S-Zentren (Abb. 3.26) sowie ein Cytochrom b, dessen Funktion nicht bekannt ist. Der Elektronentransport durch die Succinat-Dehydrogenase erfolgt ohne größeres Redoxgefälle auf Ubichinon. Daher wird beim Elektronentransport vom Succinat zum Ubichinon keine Energie gewonnen.
Das durch den NADH-Dehydrogenase-Komplex, beziehungsweise die Succinat-Dehydrogenase reduzierte Ubichinon wird durch den Cyt-b/c1-Komplex (Komplex III) (Abb. 5.15) oxidiert. Der Komplex besteht in Mitochondrien aus zehn Untereinheiten, von denen eine (die Cyt-b-Untereinheit) in den Mitochondrien codiert ist. In Struktur und Funktion entspricht der Cyt-b/c1-Komplex im Wesentlichen dem chloroplastidären Cyt-b6/f-Komplex, der bereits in Abschnitt 3.7 eingehend besprochen wurde. Dabei werden die Elektronen an der zum Intermembranraum gerichteten Seite der Membran schließlich auf Cyt-c übertragen. Der Elektronentransport durch den Cyt-b/c1-Komplex wird durch mehrere Antibiotika wie Antimycin A und Myxothiazol gehemmt.
Das reduzierte Cyt-c diffundiert als stark positiv geladenes kleines Protein entlang der Außenseite der Innenmembran der Mitochondrien zum Cyt-a/a3-Komplex (Abb. 5.15), der auch als Komplex IV oder Cytochrom-Oxidase bezeichnet wird. Der Cyt-a/a3-Komplex enthält dreizehn verschiedene Untereinheiten, von denen drei Untereinheiten in den Mitochondrien codiert sind. Die dreidimensionale Struktur des Cyt-a/a3 zeigt einen großen hydrophilen Bereich, der in den Intermembranraum hineinragt und die Bindungsstelle für Cyt-c trägt. Bei der Oxidation des Cyt-c werden Elektronen zunächst auf ein Kupfer-Schwefel-Zentrum, das aus zwei Cu-Atomen besteht (die als CuA bezeichnet werden), übertragen. Diese beiden Cu-Atome sind durch zwei S-Atome von Cysteinresten des Cyt-a/a3 miteinander verbunden (Abb. 5.17).

Dieses Kupfer-Schwefel-Zentrum nimmt wahrscheinlich ein Elektron auf und überträgt es über Cyt-a auf ein so genanntes binukleares Zentrum, das aus dem Cyt-a3 und einem durch Histidin koordiniertem Cu-Atom (CuB) besteht. Dieses binukleare Zentrum wirkt als eine Redoxeinheit, in der Cu zusammen mit dem Fe-Atom im Cyt-a3 insgesamt zwei Elektronen aufnimmt:

Beim Cyt-a3 ist im Gegensatz zu Cyt-a und den anderen Cytochromen der Atmungskette die sechste Koordinationsstelle des Fe3+ nicht durch Aminosäuren des Proteins koordiniert (Abb. 5.18). An diese freie Koordinationsstelle bindet das Sauerstoffmolekül, es liegt dann zwischen Cyt-a3 und CuB. So an das binukleare Zentrum gebunden wird das Sauerstoffmolekül durch Aufnahme von vier Elektronen zu Wasser reduziert:

Außerdem hat CuB wahrscheinlich eine wichtige Funktion bei dem im Folgenden Abschnitt besprochenen Protonentransport des Cyt-a/a3-Komplexes. Statt O2 können auch CO und CN- an die freie Koordinationsstelle des Cyta3 sehr fest binden, wodurch die Atmung gehemmt wird. Aus diesem Grund sind Kohlenmonoxid und Blausäure sehr starke Atmungsgifte.

In jüngster Zeit wurde durch elektronenmikroskopische und biochemische Untersuchungen gefunden, dass sich die Proteinkomplexe der Atmungskette zu sogenannten respiratorischen Superkomplexen zusammenlagern können. Es wurde ein Superkomplex bestehend aus den Komplexen III und IV beschrieben, ferner ein Superkomplex aus den Komplexen I und III. Ein noch größerer Superkomplex, der die Komplexe I, III und IV enthält, wird auch als „Respirasom" bezeichnet, da er in Gegenwart von Ubichinon und Cytochrom c die Gesamtreaktion der mitochondrialen Atmungskette, die Elektronenübertragung von NADH auf molekularen Sauerstoff, katalysieren kann.

5.6 Der Elektronentransport der Atmungskette ist über einen Protonentransport mit der ATP-Synthese gekoppelt
Der Elektronentransport der Atmungskette ist mit der Bildung von ATP gekoppelt. Dies wird durch ein Experiment in Abbildung 5.19 illustriert, bei dem die Atmungsgeschwindigkeit einer Mitochondriensuspension gemessen wird. Als Maß für die Atmung dient dabei die Abnahme der Sauerstoffkonzentration im Suspensionsmedium. Die Zugabe von Substrat (z.B. Malat) allein bewirkt nur eine geringe Erhöhung der Atmung. Die nachfolgende Zugabe einer begrenzten Menge von ADP führt zu einer hohen Steigerung der Atmungsgeschwindigkeit. Nach einiger Zeit sinkt die Atmungsgeschwindigkeit wieder auf den Wert vor der ADP-Zugabe; zu diesem Zeitpunkt ist das zugefügte ADP vollständig zu ATP umgesetzt worden. Die Atmung in Gegenwart von ADP wird als aktive Atmung bezeichnet, die nach Verbrauch von ADP als kontrollierte Atmung. Da die Mitochondrien das eingesetzte ADP quantitativ in ATP umwandeln, kann aus dem Quotienten von ADP-Einsatz zu Sauerstoffverbrauch (ADP/O) die Menge von ATP bestimmt werden, die bei der Oxidation eines bestimmten Substrats gebildet wird. Für Substrate, die unter Vermittlung von mitochondrialem NADH oxidiert werden (z.B. Malat), werden ADP/O von etwa 2,5 und für Succinat, dessen Reduktionsäquivalente direkt auf Ubichinon übertragen werden, von etwa 1,6 gemessen. Wir werden am Ende dieses Abschnitts auf das Problem der ATPStöchiometrie noch einmal zurückkommen.

Wie schon für den photosynthetischen Elektronentransport gezeigt, ist auch der Elektronentransport der Atmungskette mit der Bildung einer protonenrnotorischen Kraft (Abb. 5.15) verbunden, die ihrerseits die Synthese von ATP treibt (Abb. 5.20). Daher wirken Substanzen wie FCCP (Abb. 4.2) sowohl als Entkoppler des photosynthetischen als auch des mitochondrialen Elektronentransports. Wie in Abbildung 5.19 gezeigt ist, führt die Zugabe des Entkopplers FCCP zu einer hohen Steigerung der Atmung. Diese Entkopplerwirkung des FCCP beruht auf einem unkontrollierten Rückfluss von Protonen über eine Membran (Abschn. 4.2). Dadurch bricht der durch den Elektronentransport aufgebaute Protonengradient zusammen. Die Atmung ist dann von der ATP-Synthese entkoppelt, und die beim Elektronentransport freiwerdende Energie geht vollständig in Wärme über.

Nach neueren Erkenntnissen wird die Atmungskontrolle durch eine Überlagerung von zwei verschiedenen Mechanismen bewirkt. Der klassische Mechanismus beruht darauf, dass bei einem Anstieg des ATP/ADP-Quotienten die protonenmotorische Kraft ansteigt, und dadurch der Elektronentransport der Atmungskomplexe gedrosselt wird. Es wurde gefunden, dass ATP auch eine direkte Hemmwirkung auf den Elektronentransport ausübt, indem es an eine Untereinheit der Cytochromoxidase bindet und dadurch die Aktivität der Cytochromoxidase vermindert.

Der mitochondriale Protonentransport führt zur Bildung eines Membranpotenzials
Mitochondrien besitzen im Gegensatz zu den Chloroplasten keinen abgeschlossenen Thylakoidraum zur Bildung eines Protonengradienten. Stattdessen werden beim mitochondrialen Elektronentransport die Protonen von der Matrix in den Intermembranraum transportiert, wobei dieser über Poren (die durch Porine, siehe Abb. 1.30, gebildet werden) mit dem Cytosol in Verbindung steht. In den Chloroplasten sinkt bei der durch Licht verursachten Bildung eines Protonengradienten von etwa ΔpH = 3 der pH im Thylakoidraum von etwa pH 7,5 auf pH 4,5 ab. Wenn bei Mitochondrien eine derartige starke Ansäuerung im Cytosol aufträte, würde sich dies gravierend auf die Aktivität der sehr vielen im Cytosol vorhandenen Enzyme auswirken. In den Mitochondrien führt der Protonentransport statt dessen zur Ausbildung eines Membranpotenzials von ΔΨ ≈ 200 mV, der pH-Gradient über die innere Mitochondrienmembran im kontrollierten Zustand beträgt lediglich ΔpH ≈ 0,2. Mitochondrien können keinen größeren Protonengradienten bilden, da die innere Membran der Mitochondrien für Anionen wie Chlorid impermeabel ist. Wie in Abbildung 4.1 gezeigt, kann ein größerer Protonenkonzentrationsgradient nur dann gebildet werden, wenn die Ladung der transportierten Protonen durch die Diffusion eines Anions kompensiert wird.
Über den Mechanismus der Kopplung zwischen dem mitochondrialen Elektronentransport und dem Transport von Protonen sind inzwischen zahlreiche Informationen bekannt, allerdings sind einige Details noch unklar, insbesondere hinsichtlich der Protonentranslokation am Komplex I. Man nimmt an, dass durch den NADH-Dehydrogenase-Komplex pro zwei Elektronen insgesamt vier Protonen in den Intermembranraum transportiert werden. Zwei Protonen werden wahrscheinlich beim Elektronentransfer durch Ubichinon im NADH-Dehydrogenase-Komplex an der Matrixseite aufgenommen und im Cyt-b/c1-Komplex in den Intermembranraum freigesetzt (Abb. 5.15). Es ist allgemein akzeptiert, dass in den Mitochondrien der Cyt-b/c1-Komplex einen Q-Cyclus (Abb. 3.30) katalysiert und dadurch beim Transport von zwei Elektronen zwei zusätzliche Protonen aus dem Matrixraum in den Intermembranraum transportiert werden. Zudem werden durch den Cytochrom-a/a3-Komplex pro zwei Elektronen mindestens zwei Protonen transportiert. Aus der ermittelten dreidimensionalen Struktur des Cytochrom-a/a3-Komplexes kann man schließen, dass an diesem Protonentransport wahrscheinlich das binukleare Zentrum aus Cytochrom-a3 und CuB beteiligt ist. Falls diese Stöchiometrien stimmen, würden bei der Oxidation von NADH insgesamt zehn Protonen transportiert, bei der Oxidation von Succinat nur sechs.

Die mitochondriale ATP-Synthese dient der Versorgung des Cytosols
Die Nutzung der Energie des Protonengradienten für die Synthese von ATP erfolgt in den Mitochondrien prinzipiell in gleicher Weise wie in den Chloroplasten (siehe Abschn. 4.3) durch eine F-ATP-Synthase (Abb. 5.20). Die F-ATP-Synthase der Mitochondrien hat die gleiche Grundstruktur wie die F-ATP-Synthase der Chloroplasten. Sie unterscheiden sich jedoch bezüglich der Hemmung durch Oligomycin, einem Antibiotikum aus Streptomyces. Die mitochondriale F-ATP-Synthase wird durch Oligomycin sehr stark gehemmt, während das chloroplastidäre Enzym gegenüber diesem Hemmer unempfindlich ist. Die Hemmbarkeit der mitochondrialen F-ATP-Synthase ist auf das Vorhandensein eines oligomycinbindenden Proteins zurückzuführen. Der Mechanismus der ATP-Synthese ist bei beiden ATP-Synthasen aber sicherlich identisch. Auch bei der mitochondrialen ATP-Synthese ist die Protonen-Stöchiometrie noch nicht eindeutig aufgeklärt worden. Wenn es allgemein zutrifft, dass der Rotor der F-ATP-Synthase bei Mitochondrien 10 c-Untereinheiten besitzt, wären nach dem in Abschnitt 4.4 diskutierten Mechanismus der ATP-Synthese 3,3 Protonen für die Synthese von 1 Mol ATP erforderlich. Dieser Wert entspricht in etwa dem Ergebnis früherer unabhängiger Untersuchungen.
Im Gegensatz zu den Chloroplasten, die ATP hauptsächlich für den Eigenverbrauch synthetisieren, ist in den Mitochondrien das gebildete ATP vorwiegend für den Export in das Cytosol bestimmt. Dies erfordert eine Aufnahme von ADP und Phosphat aus dem Cytosol in die Mitochondrien und eine Abgabe des gebildeten ATP. Die Aufnahme von Phosphat erfolgt durch den Phosphat-Translokator im Gegentausch mit OH--Ionen, die Aufnahme von ADP und der Export von ATP durch den ATP/ADP-Translokator(Abb. 5.20). Der mitochondriale ATP/ADP-Translokator wird durch Carboxyatractylosid , einem Glucosid aus der Leimdistel Atractylis gumnifera, und durch Bongkreksäure, einem Antibiotikum aus dem auf Kokosnüssen wachsenden Bakterium Cocovenerans, gehemmt. Beide Substanzen sind sehr starke Gifte.
Der ATP/ADP-Translokator katalysiert einen strikten Gegentausch: Für jedes austransportierte ATP oder ADP wird ein ADP oder ATP eintransportiert. Da das transportierte ATP eine negative Ladung mehr als ADP enthält, ist der Transport von ATP gegen ADP elektrogen. Das durch den Protonentransport der Atmungskette gebildete Membranpotenzial bewirkt, dass ATP bevorzugt ex- und ADP bevorzugt importiert wird. Dieser asymmetrische Transport von ADP und ATP führt dazu, dass das Verhältnis ATP/ADP außerhalb der Mitochondrien höher ist als in der Matrix. Auf diese Weise kann durch die mitochondriale ATP-Synthese ein hoher cytosolischer ATP/ADP-Quotient aufrechterhalten werden. Mit dem Austausch von ADP gegen ATP wird eine negative Ladung nach außen abgegeben, der notwendige Ladungsausgleich erfordert den Transport von einem Proton aus den Mitochondrien. Daher werden nicht nur für die ATP-Synthese, sondern auch für den Export des gebildeten ATP aus den Mitochondrien Protonen des Protonengradienten verbraucht.
Kommen wir jetzt noch einmal auf die Stöchiometrie der transportierten Protonen und der ATP-Bildung bei der Atmung zurück: Die Komplexe I, III und IV werden häufig auch als Kopplungsstellen der Atmungskette bezeichnet. Man findet in einigen Lehrbüchern die Angabe, dass bei der Oxidation von NADH durch die mitochondriale Atmungskette pro Kopplungsstelle ein ATP gebildet wird, also der ADP/Sauerstoff-Quotient für die Veratmung von NADH drei und von Succinat zwei beträgt. Im Experiment werden jedoch wesentlich geringere Werte gemessen. Man versuchte dies damit zu erklären, dass in den isolierten Mitochondrien H+-Leckströme durch die Membran auftreten und daher der theoretische ADP/Sauerstoff-Wert nicht erreicht wird. Es spricht heute jedoch vieles dafür, dass auch theoretisch diese ganzzahligen ADP/Sauerstoff-Werte nicht zutreffen. Es wurde oben beschrieben, dass bei der Oxidation von NADH möglicherweise zehn Protonen transportiert werden. Falls 3,3 Protonen für die Synthese von ATP (siehe vorige Seite) und ein weiteres Proton für den Transport verbraucht werden, so würde dies einen ADP/Sauerstoff-Wert von 2,3 bedeuten. Dieser Wert ähnelt den experimentell ermittelten Werten.
Zu Beginn dieses Kapitels haben wir berechnet, dass die Änderung der freien Enthalpie bei der Oxidation von NADH -214 kJ/mol und für die Synthese von ATP etwa +50 kJ/mol beträgt. Ein ADP/Sauerstoff-Quotient von 2,3 bei der Veratmung NADH-abhängiger Substrate würde bedeuten, dass etwa 54% der bei der Oxidation abgegebenen freien Enthalpie für die ATP-Synthese genutzt wird. Jedoch sind diese Werte immer noch als unsicher zu betrachten.

5.7 Mitochondrien aus Pflanzen haben spezielle Stoffwechselfunktionen
Die bisher besprochene "Kraftwerkfunktion" der Mitochondrien trifft für alle Mitochondrien aus Einzellern, Tieren und Pflanzen zu. In Pflanzenzellen, die Photosynthese durchführen, beschränkt sich die Rolle der Mitochond1ien als Energielieferant nicht nur auf die Dunkelphase: Sie haben auch während der Photosynthese eine zentrale Bedeutung für die ATP-Versorgung des Cytosols.
Zusätzlich erfüllen Mitochondrien in Pflanzen aber auch noch spezielle Funktionen. So enthalten sie in der Matrix Enzyme für die Oxidation von Glycin zu Serin, einem wichtigen Schritt des Photorespirationsweges (Abschn. 7.1):

Das hierbei anfallende NADH bildet während der Photosynthese den "Hauptbrennstoff" für die mitochondriale ATP-Synthese. Außerdem findet in Mitochondrien die Umwandlung von Oxalacetat und Pyruvat in Citrat als Vorstufe für die Bildung von α-Ketoglutarat statt. Dieser Stoffwechselweg ist für die Bereitstellung von Kohlenstoffgerüsten für die Nitratassimilation wichtig (Abb. 10.11). Desweiteren sind die Mitochondrien bei der Mobilisierung von Reservestoffen indirekt beteiligt (Abschnitt 15.6, Abb. 15.6).

Mitochondrien können überschüssiges NADH auch ohne ATP-Bildung oxidieren
Beim mitochondrialen Elektronentransport werden als Nebenprodukte - u.a. unter Beteiligung von Flavinen und Ubisemichinon - Superoxid-Radikale, H2O2 und Hydroxylradikale (zusammengefasst als ROS, (Reactive Oxygen Species) gebildet. Diese verursachen Zellschädigungen. ROS werden gebildet, wenn die Komponenten der Atmungskette stark reduziert sind und dadurch das Membranpotential übermäßig ansteigt. Es besteht daher die Notwendigkeit, eine Überreduktion der Atmungskette zu vermeiden. Andererseits ist es für eine Pflanze erforderlich, dass die Oxidation des bei der Photorespiration (Abschn. 7.1) gebildeten Glycins und der Substratfluss durch den Citratcyclus auch dann ablaufen können, wenn kein ATP-Bedarf der Zelle besteht. Mitochondrien aus Pflanzen besitzen deshalb mehrere so genannte Überlaufschutzmechanismen, durch die überschüssiges NADH auch ohne Synthese von ATP oxidiert werden kann, um eine Überreduktion der Atmungskette zu vermeiden. Dazu gehören alternative NADH/NADPH-Dehydrogenasen, eine alternative Oxidase (Abb. 5.21) und Entkopplerproteine.
Eine alternative NADH-Dehydrogenase, lokalisiert an der Matrixseite der inneren Mitochondrienmembran, überträgt Elektronen von NADH auf Ubichinon, ohne dass daran ein Protonentransport gekoppelt ist. Dieser Weg ist durch Rotenon nicht hemmbar. Eine Oxidation des NADH über diesen rotenonunempfindlichen Weg erfolgt nur, wenn der NADH/NAD+-Quotient in der Matrix besonders hoch ist.Auch gibt es auf der Matrixseite eine alternative NADPH-Dehydrogenase, die in Abb. 5.21 nicht eingezeichnet ist.

Eine alternative Oxidase überträgt Elektronen von Ubihydrochinon direkt auf Sauerstoff ohne dass dabei Energie durch Protonentransport konserviert wird. Diese "alternative Oxidation" ist gegenüber Antimycin-A und KCN unempfindlich, wird hingegen von Salizylhydroxamat (SHAM) gehemmt. Die alternative Oxidase ist ein Membranprotein, bestehend aus zwei gleichen Untereinheiten je 36 kDa). Die Struktur dieses Proteins wurde kürzlich durch Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt. Aus der Aminosäuresequenz lässt sich voraussagen, dass jede der beiden Untereinheiten zwei transmembrane Helices ausbildet. Die beiden Untereinheiten bilden zusammen ein Di-Eisen-Oxo-Zentrum (wie auch bei der Fettsäure-Desaturase, Abb. 15.16), welches die Oxidation des Ubichinons durch Sauerstoff katalysiert. Der Elektronentransport über die alternative Oxidase ist als ein Kurzschluss zu verstehen. Er erfolgt nur bei einer übermäßigen Reduktion des mitochondrialen Ubichinons. Das Enzym wird durch eine Erhöhung der Pyruvatkonzentration in den Mitochondrien (als Signal für Metabolitüberschuss) aktiviert.
Mitochondriale Entkopplerproteine der inneren Mitochondrienmembran wurden zunächst in Tieren entdeckt. Die Proteine sind mit dem ATP/ADP-Translokator eng verwandt und bilden einen Kanal, welcher die mitochondriale Innenmembran für Protonen durchlässig macht, wodurch das Membranpotential abgebaut und der Elektronentransport von der ATP-Synthese entkoppelt wird. Entkopplerproteine sind in Eukaryoten weit verbreitet, und so auch in Pflanzen, wo sie als PUMP (plant uncoupling mitochondrial proteins) bezeichnet werden. Über ihre Regulation in Pflanzen bestehen noch viele Unklarheiten. Sie haben offenbar die Funktion, einen übermäßigen Anstieg des mitochondrialen Membranpotenzials zu verhindern, um damit die Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) zu minimieren.
Somit bilden die alternativen NADH/NADPH-Dehydrogenasen, die alternative Oxidase und die Entkopplerproteine ein sehr komplexes System, um bei einem hohen Substratangebot eine Oxidation durch die Mitochondrien auch dann zu ermöglichen, wenn kein Bedarf an ATP besteht, wobei die dabei freiwerdende Energie in Wärme übergeht. Die Kapazitäten der einzelnen Komponenten dieses Systems hängen sehr stark von den Spezies, deren Entwicklungszustand und den äußeren Bedingungen ab. So findet man z.B. eine hohe Expression von PUMP in Pflanzen, die einem Kältestress ausgesetzt wurden. Von der alternativen Oxidase befindet sich eine besonders hohe Aktivität in den Blütenkolben der Vodoo-Lilie Sauromatum guttatum, einem Aronstabgewächs. Diese Pflanze nutzt zur Bestäubung die alternative Oxidase, um Wärme zu erzeugen. Die Erwärmung der Blütenkolben dient zur Aussendung von aas- und kotähnlichen Gerüchen, die über weite Entfernungen hinweg Insekten anlocken. In diesen Blütenkolben ist die Bildung der alternativen Oxidase mit dem Blühbeginn synchronisiert.

In Pflanzen können durch die mitochondriale Atmungskette auch NADH und NADPH aus dem Cytosol oxidiert werden
Im Gegensatz zu Mitochondrien aus tierischen Zellen können Pflanzenmitochondrien auch externes, das heißt, vom Cytosol angeliefertes NADH und in manchen Fällen auch NADPH oxidieren. Allgemein gilt, dass die innere Mitochondrienmembran für Pyridinnukleotide praktisch undurchlässig ist. Die Oxidation von externem NADH und NADPH erfolgt über zwei spezifische alternative Dehydrogenasen, die an der zum Intermembranraum gerichteten Seite der Membran angeordnet sind. Ebenso wie bei der Succinat-Dehydrogenase werden bei den externen alternativen NADH- und NADPH-Dehydrogenasen die Elektronen auf der Stufe des Ubichinons in die Atmungskette eingespeist, daher wird diese Oxidation auch nicht durch Rotenon gehemmt. Da bei der Oxidation von externem NADH und NADPH (wie auch bei der Oxidation von Succinat) der Protonentransport durch Komplex I (Abb. 5.15) entfällt, ist bei der Oxidation der externen Pyridinnukleotide die ATP-Ausbeute geringer als bei der Oxidation des von der Matrix angelieferten NADH über Komplex I. Die Oxidation über die externe alternative NADH-Dehydrogenase läuft nur bei einer sehr hohen Konzentration von NADH ab, wie sie unter normalen Stoffwechselbedingungen im Cytosol nicht vorliegt. Wir können daher auch diesen Weg als "Überlaufschutzmechanismus" betrachten, der nur dann eingeschlagen wird, wenn das NAD-System im Cytosol zu stark reduziert ist. Wie bereits in Kapitel 3 besprochen, kann es bei der Photosynthese zu einem Überangebot an Reduktionskraft kommen, was sich auf die ganze Zelle übertragen kann und zu Zellschädigungen führt. Durch die externe alternative NADH-Dehydrogenase, die alternative Dehydrogenase für NADH in der Matrix sowie die alternative Oxidase kann die Pflanzenzelle überschüssige Reduktionskraft durch "Abfackeln" beseitigen.

5.8 Die Kompartimentierung des mitochondrialen Stoffwechsels erfordert spezifische Membran-Translokatoren
Da die mitochondriale Innenmembran für Metabolite impermeabel ist, enthält diese Membran spezifische Translokatoren für einen geregelten Stoffaustausch zwischen der mitochondrialen Matrix und dem Cytosol (Abb. 5.22). Alle diese Translokatoren katalysieren einen Gegentausch. Die Funktionen des ATP/ADP-und des Phosphat-Translokators (Abb. 5.20) wurden bereits in Abschnitt 5.6 beschrieben. Durch einen Dicarboxylat-Translokator werden Malat und auch Succinat im Gegentausch mit Phosphat in die Mitochondrien transportiert. Dieser Transport wird durch Butylmalonat gehemmt. Im Gegentausch mit Malat werden über jeweils verschiedene Translokatoren α-Ketoglutarat, Citrat und Oxalacetat transportiert. Die Bedeutung des Citrattransports für die Nitratassimilation wird in Kapitel 10 beschrieben. Glutamat wird im Gegentausch mit Aspartat und Pyruvat im Gegentausch mit OH--Ionen transportiert. Durch beide Translokatoren können Metabolite in den Citratcyclus (Abb. 5.3) eingespeist werden. Obwohl alle diese Translokatoren in Pflanzenmitochondrien vorkommen, beruhen unsere heutigen Kenntnisse darüber hauptsächlich auf Untersuchungen an Mitochondrien aus tierischen Geweben. Von den ATP/ADP-, Phosphat-, α-Ketoglutarat-, Citrat- und Glutamat-Translokatoren sind inzwischen die Aminosäuresequenzen bekannt. Der Vergleich der Sequenzen zeigt eine Homologie; die Proteine dieser Translokatoren bilden eine Familie, die auf einen gemeinsamen Ursprung zurückgeht. Sie sind aus 12 transmembranen Helices aufgebaut (siehe Abschn. 1.9).

Der Malat-Oxalacetat-Translokator ist eine Besonderheit pflanzlicher Mitochondrien und hat eine wichtige Funktion für den in Abschnitt 7.3 besprochenen Malat-Oxalacetat-Cyclus. Er ist ebenfalls bei der Bereitstellung der Kohlenstoffskelette für die Nitratassimilation beteiligt (Abb. 10.11). Der Oxalacetat-Translokator und in geringerem Maß auch der α-Ketoglutarat-Translokator werden durch das Dicarboxylat Phthalonat gehemmt. Über den Transport von Glycin und Serin - der für den Stoffwechselweg der Photorespiration (Abschn. 7.1) wichtig ist - ist bislang wenig bekannt. Auch wenn der endgültige Beweis noch aussteht, ist an der Existenz eines oder zweier Translokatoren für den Transport dieser Aminosäuren nicht zu zweifeln.nach oben zum Kapitelanfang

6 Der Calvin-Cyclus ist Reaktionsweg für die photosynthetische CO2-Assimilation
Wie in den Kapiteln 3 und Kapitel 4 besprochen, wird durch die in der Thylakoidmembran lokalisierte photosynthetische Elektronentransportkette zusammen mit der ATP-Synthase die Energie des Lichtes genutzt, um chemische Energie in Form von NADPH als reduzierende Äquivalente und ATP als energiereiche Phosphorverbindung bereitzustellen. In diesem Kapitel werden wir diskutieren, wie durch den Verbrauch des so gelieferten NADPH und ATP die Assimilation von CO2 erfolgt.

6.1 Die CO2 Assimilation erfolgt durch die Dunkelreaktion der Photosynthese
Mit einer relativ einfachen Methode lassen sich aus Blättern Chloroplasten mit intakten Hüllmembranen isolieren (siehe Abschn. 1.7). Gibt man solche Chloroplasten in ein isotonisches Medium, das neben einem Osmotikum und einem Puffer lediglich Bicarbonat und anorganisches Phosphat enthält, so beobachtet man bei Lichteinstrahlung die Entwicklung von Sauerstoff. Bei der in Kapitel 3 beschriebenen Lichtreaktion der Photosynthese wird Wasser gespalten und mit den dabei verfügbaren Elektronen CO2 assimiliert (Abb. 6.1).

In Abwesenheit von CO2 oder Phosphat findet keine Sauerstoffentwicklung statt. Man erkennt hieraus, dass in den intakten Chloroplasten die Lichtreaktion mit der CO2-Assimilation gekoppelt ist und dass das Produkt dieser Assimilation eine phosphathaltige Verbindung ist. Es handelt sich dabei um das phosphorylierte Kohlenhydrat Dihydroxyacetonphosphat, ein Triosephosphat. Wie die Nettoreaktion der CO2-Assimilation in (Abb. 6.2) zeigt, erfordert die Synthese von Triosephosphat aus CO2 Energie in Form von ATP und Reduktionsäquivalente in Form von NADPH, welche durch die bereits besprochene Lichtreaktion der Photosynthese geliefert werden.

Die Reaktionskette zur Bildung von Dihydroxyacetonphosphat aus CO2, ATP und NADPH wird, um sie von der genannten Lichtreaktion abzugrenzen, auch als Dunkelreaktion der Photosynthese bezeichnet, da sie kein Licht per se benötigt und daher theoretisch auch im Dunkeln ablaufen könnte. In Wirklichkeit läuft im Blatt diese Reaktion im Dunkeln nicht ab, da einige der Enzyme der Reaktionskette durch Regulationsvorgänge nur im Licht aktiv sind (siehe Abschn. 6.5).
Der Mechanismus der photosynthetischen CO2-Assimilation wurde zwischen 1946 und 1953 von Melvin Calvin zusammen mit seinen Mitarbeitern Andrew Benson und James Bassharn in Berkeley, Kalifornien, aufgeklärt. Für diese fundamentale Entdeckung erhielt Calvin 1961 den Nobelpreis für Chemie. Eine Voraussetzung für die Aufklärung der CO2-Fixierung war die Entdeckung des radioaktiven Kohlenstoffisotops 14C im Jahre 1940, das dann ab 1945 als Nebenprodukt von Nuklearreaktoren in den USA in größeren Mengen verfügbar wurde. Calvin wählte für seine Untersuchungen die Grünalge Chlorella. Er gab radioaktiv markiertes CO2 zu belichteten Algensuspensionen, tötete die Algen nach kurzen Zeiten durch Zugabe von heißem Ethanol ab und analysierte die radioaktiv markierten Einbauprodukte mittels Papiercbromatographie. Während bei langen Inkubationszeiten sehr viele radioaktiv markierte Produkte auftraten, konnte er durch sukzessive Verkürzung der Inkubationszeiten eindeutig nachweisen, dass 3-Phosphoglycerat als erstes stabiles Produkt der CO2-Fixierung gebildet wurde. Eingehende Untersuchungen ergaben, dass die CO2-Fixierung durch einen cyclischen Prozess erfolgt, der nach seinem Entdecker als Calvin-Cyclus bezeichnet wird. Ein anderer Name, der an manchen Stellen dieses Buches benutzt wird, ist der des reduktiven Pentosephosphatweg: In dem Cyclus tritt eine Reduktionsreaktion auf, und es werden Pentosen gebildet. Abbildung 6.3 gibt einen Überblick über den Cyclus. Dieser lässt sich in drei Phasen untergliedern: die Carboxylierung des C5-Zuckers Ribulose-1,5-bisphosphat unter Bildung von zwei Molekülen 3-Phosphoglycerat, die Reduktion des 3-Phosphoglycerats zu Triosephosphat und die Regeneration des CO2-Akzeptors Ribulose- 1,5-bisphosphat aus Triosephosphat. Fünf Moleküle Triosephosphat liefern drei Moleküle Ribulose-1,5-bisphosphat. Hinzu kommt der Transport des Triosephosphats aus den Chloroplasten. In den folgenden Abschnitten werden diese Teilreaktionen eingehend besprochen.

6.2 Ribulosebisphosphat-Carboxylase katalysiert die Fixierung von CO2
Schlüsselreaktion für die photosynthetische CO2-Assimilation ist die Bindung von CO2 aus der Atmosphäre an den Akzeptor Ribulose-1,5-bisphosphat (RuBP), eine zweifach phosphorylierte Ketopentose. Die Reaktion ist stark exergonisch (ΔGo' = - 35 kJ/mol) und daher irreversibel. Das Enzym, das diese Reaktion katalysiert, wird als Ribulosebisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (abgekürzt RubisCO) bezeichnet, da es auch eine Nebenreaktion katalysiert, bei der das RuBP mit O2 reagiert (Abb. 6.4).

Abbildung 6.5 zeigt den Ablauf der Carboxylasereaktion in den einzelnen Schritten. Durch Keto-Enol-Tautomerie der Carbonylgruppe des RuBP bildet sich ein Endiol, welches mit CO2 zu 2-Carboxy-3-ketoarabinitol-1,5-bisphosphat reagiert, durch dessen Spaltung dann zwei Moleküle 3-Phosphoglycerat gebildet werden.

Der Reaktionsablauf bei der Oxygenasereaktion, der bei den vorherrschenden O2 und CO2-Konzentrationen unvermeidlichen Nebenreaktion, ist in Abbildung 6.6 dargestellt. O2 reagiert in ähnlicher Weise wie CO2 mit dem Endiol unter Bildung eines Peroxids. In der nachfolgenden Spaltung des O2-Adduktes wird ein Atom des O2Moleküls an das Wasser abgegeben, das andere wird in die Carbonylgruppe des 2-Phosphoglycolats eingebaut. Als Produkte der Oxygenase-Reaktionen werden somit 2-Phosphoglycolat und 3-Phosphoglycerat gebildet.

RubisCO ist das einzige Enzym, das die irreversible Fixierung des atmosphärischen CO2 zum Aufbau von Biomasse ermöglicht; das Vorhandensein dieses Enzyms ist somit eine Grundvoraussetzung für das Bestehen des heutigen Lebens auf der Erde. Das Enzym ist in Pflanzen und Cyanobakterien aus acht identischen, so genannten großen Untereinheiten (Molekularmasse je nach Spezies 51000 bis 58000 Dalton) und acht identischen kleinen Untereinheiten (Molekularmasse 12 000 bis 18000 Dalton) zusammengesetzt. Mit den 16 Untereinheiten ist RubisCO eines der größten Enzyme in der Natur. In Pflanzen ist die genetische Information für die große Untereinheit im Genom der Plastiden codiert und für die kleine Untereinheit im Zellkern. Jede der großen Untereinheiten enthält ein katalytisches Zentrum. Die Funktion der kleinen Untereinheit ist noch nicht verstanden. Man diskutiert, dass die acht kleinen Untereinheiten den Verband der acht großen Untereinheiten stabilisieren oder als CO2-Reservoir dienen. Für den Prozess der CO2-Fixierung per se ist die kleine Untereinheit offenbar nicht essenziell. In einigen phototrophen Purpurbakterien kommt RubisCO als Dimer von nur großen Untereinheiten vor, ohne dass sich die katalytischen Eigenschaften der betreffenden bakteriellen Enzyme grundsätzlich von denen der pflanzlichen Enzyme unterscheiden. Allerdings ist bei den nur aus zwei großen Untereinheiten bestehenden bakteriellen Enzymen das Verhältnis zwischen Oxygenase- und Carboxylaseaktivität höher als bei der aus acht großen und acht kleinen Untereinheiten aufgebauten RubisCO.

Die Oxygenierung des Ribulosebisphosphats: Eine kostspielige Nebenreaktion
Die kinetischen Konstanten der RubisCO (Tabelle 6.1) machen deutlich, dass die durch die Oxygenaseaktivität ausgelöste Nebenreaktion sehr häufig ist. Zwar ist die für die 50 %ige Sättigung des Enzyms erforderliche CO2-Konzentration (KM [CO2]) viel niedriger als die von O2 (KM [O2]), da aber die Konzentration von O2 in der Luft 21 % und die von CO2 nur 0,04 % beträgt und die CO2-Konzentration im Gasraum der Blätter außerdem erheblich unter der Konzentration in der Außenluft liegen kann, beträgt während der Photosynthese in einem Blatt bei 25 °C das Verhältnis von Oxygenierung zu Carboxylierung etwa 1:4 bis 1:2. Dies bedeutet, dass jedes dritte bis fünfte Ribulose-1,5-bisphosphatmolekül für die Nebenreaktion verbraucht wird. Mit steigender Temperatur nimmt die Geschwindigkeit der Oxygenierung stärker zu als die der Carboxylierung. Außerdem nimmt bei steigender Temperatur die im Gleichgewicht mit der Luft stehende Konzentration des im Wasser, und damit auch im Zellwasser, gelösten CO2 stärker ab als die des O2. Durch diese beiden Effekte erhöht sich das Verhältnis Oxygenierung/Carboxylierung mit steigender Temperatur. Andererseits wird durch eine Erhöhung der CO2-Konzentration in der Atmosphäre, z. B. in einem Gewächshaus, die Oxygenierung erniedrigt, was in vielen Fällen ein erhöhtes Pflanzenwachstum zur Folge hat.

Wie in Kapitel 7 gezeigt wird, ist das „Recycling" des in so großen Mengen anfallenden Nebenproduktes 2-Phosphoglycolat für die Pflanze ein überaus kostspieliger Prozess, der einen sehr hohen „apparativen" Aufwand erfordert. Er benötigt eine Stoffwechselkette, die aus mehr als zehn enzymatischen Reaktionen besteht und über drei verschiedene Organellen (Chloroplasten, Peroxisomen, Mitochondrien) verteilt ist. Hinzu kommt ein hoher Energieverbrauch. Wie in Abschnitt 7.5 im Einzelnen dargelegt wird, werden bei der Photosynthese eines Blattes etwa ein Drittel der absorbierten Photonen dazu benötigt, um die Folgen der Oxygenierung rückgängig zu machen. Der Anstieg der Sauerstoffkonzentration von ca. 4% auf die heutigen ca. 21 % im Laufe der letzten ca. 600 Millionen Jahre der Erdgeschichte förderte die Rate der Photorespiration und diese Wirkung konnte anscheinend nicht durch eine molekulare Evolution der RubisCO zur Verringerung der Oxygenierung unterdrückt werden. Zwischen Cyanobakterien und höheren Pflanzen ist das Verhältnis der Aktivitäten von Carboxylase und Oxygenase der RubisCO um den Faktor von weniger als zwei angestiegen. Wir haben es hier mit einem Fall zu tun, bei dem der Grad der Perfektion eines Schlüsselprozesses des Lebens an eine von der Chemie gesetzte Grenze stößt. Ein Grund hierfür liegt wohl darin, dass die Evolution der RubisCO zu einer Zeit erfolgte, als es in der Atmosphäre noch keinen Sauerstoff gab und die CO2-Konzentration höher als heute war. Ein Vergleich von RubisCO-Proteinen verschiedener Organismen lässt darauf schließen, dass die RubisCO schon vor etwa 3,5 Milliarden Jahren bei der Entwicklung der ersten chemolithotrophen Bakterien entstanden ist. Als mehr als 1,5 Milliarden Jahre später der Sauerstoff in der Atmosphäre durch die Photosynthese in höheren Konzentrationen auftrat, war es wegen der Komplexität des vorhandenen Enzymproteins offenbar nicht mehr möglich, das katalytische Zentrum durch Mutationen so zu verändern, dass die Oxygenaseaktivität wirksam unterdrückt wurde. Experimentelle Ergebnisse unterstützen diese Aussage. Eine sehr große Anzahl von Versuchen, bei denen unter Einsatz molekularbiologischer Techniken gezielte Mutationen der Aminosäuresequenz im Bereich des aktiven Zentrums der RubisCO hervorgerufen wurden, erzielten keine Verbesserung des Verhältnisses der Aktivitäten von Carboxylierung zu Oxygenierung. Eine mögliche Chance, die Oxygenierung durch molekularbiologische Ingenieurskunst zu erniedrigen, mag darin bestehen, mehrere Aminosäuren im aktiven Zentrum der RubisCO gleichzeitig auszuwechseln, ein Prozess, der bei der Evolution ein äußerst unwahrscheinliches Ereignis wäre. Wie in Abschnitt 7.7 besprochen wird, macht die Pflanze aus der Not eine Tugend und nutzt die energieverbrauchende Oxygenierung, um überschüssiges NADPH und ATP, welches durch die Lichtreaktion bereitgestellt wird, zu beseitigen.

Ribulosebisphosphat-Carboxylase/Oxygenase: Besonderheiten
Die Katalyse der Carboxylierung von RuBP durch RubisCO erfolgt sehr langsam (Tab. 6.1): Die Wechselzahl pro Untereinheit beträgt 3,3/s. Es werden also bei der durch völlige Sättigung des Enzyms erzielten maximalen Geschwindigkeit pro Sekunde nur 3,3 Moleküle CO2 und RuBP in jedem katalytischen Zentrum umgesetzt. Im Vergleich dazu haben Dehydrogenasen Wechselzahlen in der Größenordnung von 103/s und die Carboanhydrase von 105/s. Wegen der extrem niedrigen Wechselzahl der RubisCO sind daher sehr hohe Mengen an Enzymprotein notwendig, um die bei der Photosynthese erforderlichen Flüsse zu katalysieren, ein Grund warum die RubisCO bis zu 50% des löslichen Proteins der Blätter ausmachen kann. Wegen der großen Verbreitung der Pflanzen ist RubisCO das bei weitem häufigste Protein auf der Erde. Bezogen auf die Zahl der katalytischen großen Untereinheiten findet man im Chloroplastenstroma die ungewöhnliche Enzymkonzentration von 4 bis 10 x 10-3 mol/L. Vergleicht man diesen Wert mit der Konzentration des im Gleichgewicht mit der Luft in wässriger Lösung vorhandenen CO2 (bei 25 °C ca. 11 x 10-6 mol/L), so zeigt sich hier eine abnorme Situation, in der die Konzentration eines Enzyms um bis zu lOOOmal höher ist als die des Substrats CO2 und ähnlich hoch wie die des Substrats RuBP.

Aktivierung der Ribulosebisphosphat-Carboxylase/ Oxygenase
RubisCO-Proteine verschiedener Herkunft enthalten in der großen Untereinheit in Position 201 ihrer etwa 470 Aminosäuren langen Sequenz ein Lysin. RubisCO ist nur dann aktiv, wenn die ε-Aminogruppe dieses Lysins mit CO2 ein Carbamat (Kohlensäureamid) gebildet hat und zudem ein Mg2+-Ion bindet (Abb. 6.7). Die Aktivierung beruht auf einer Konformationsänderung des Proteins der großen Untereinheit; durch die Komplexierung von Mg2+ wird die aktive Konformation stabilisiert. Für alle bekannten RubisCO-Proteine ist diese Carbamoylierung eine Voraussetzung für die Aktivität. Es sei betont, dass sich CO2, das als Carbamat gebunden wird, von dem CO2 unterscheidet, das Substrat der Carboxylierungsreaktion der RubisCO ist.

Die Aktivierung der RubisCO erfordert ATP und wird durch das Enzym RubisCO-Aktivase katalysiert. Die nicht carbamoylierte, inaktive Form der RubisCO bindet RuBP sehr fest und ist dadurch blockiert. Durch den ATP Verbrauch der Aktivase wird RuBP abgelöst und die Carbamoylierung des freien Enzyms ermöglicht. Die Regulation der RubisCO-Aktivase wird in Abschnitt 6.5 behandelt.
Die RubisCO wird durch eine Reihe von Hexosephosphaten und durch 3-Phosphoglycerat gehemmt. Ein sehr starker Inhibitor ist die Substanz 2-Carboxyarabinitol-1-phosphat (CAlP) (Abb. 6.8). Diese Substanz hat eine sehr ähnliche Struktur wie das als Zwischenprodukt der Carboxylierung entstehende 2-Carboxy-3-ketoarabinitol-1,5-bisphosphat (Abb. 6.5). CAlP hat eine tausendfach höhere Affinität zur RuBP-Bindungsstelle der RubisCO als RuBP. In einer Reihe von Spezies wird im Blatt während der Nacht CAlP akkumuliert, wodurch ein sehr großer Teil der Bindungsstellen der RubisCO blockiert wird und das Enzym dadurch inaktiv ist. Während des Tages wird dieses CAlP wieder abgebaut. Eine spezifische Phosphatase spaltet den Phosphatrest vom CAlP ab und inaktiviert damit diesen RubisCO-Inhibitor. Da CAlP nicht in allen Pflanzen gebildet wird, ist die allgemeine Bedeutung dieser Substanz für die Regulation der RubisCO derzeit noch umstritten.


6.3 Die Reduktion von 3-Phosphoglycerat führt zu Triosephosphat
Zur Umwandlung des bei der Carboxylierung gebildeten 3-Phosphoglycerats in Dihydroxyacetonphosphat wird 3-Phosphoglycerat zunächst durch das Enzym Phosphoglycerat-Kinase zu 1,3-Bisphosphoglycerat phosphoryliert. Dabei entsteht unter ATP-Verbrauch ein gemischtes Anhydrid zwischen dem neuen Phosphatrest und der Carboxygruppe (Abb. 6.9). Da die freie Enthalpie der Hydrolyse dieses Anhydrids ähnlich hoch ist wie die der anhydridischen Phosphatbindung im ATP, ist die Phosphoglycerat-Kinasereaktion reversibel. Ein Isoenzym der chloroplastidären Phosphoglycerat-Kinase ist ja auch an der im Cytosol ablaufenden Glycolyse beteiligt und bewirkt dort die Bildung von ATP aus ADP und 1,3-Bisphosphoglycerat Abschnitt 13.4

Die Reduktion des 1,3-Bisphosphoglycerats zu D-Glycerinaldehyd-3- phosphat wird durch das Enzym Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase katalysiert (Abb. 6.9). Bei dieser Reaktion wird intermediär durch Austausch des an die Carboxygruppe gebundenen Phosphats mit einer SH-Gruppe eines Cysteinrestes im aktiven Zentrum des Enzyms ein Thioester gebildet (Abb. 6.10).

Die freie Energie der Hydrolyse dieses Thioesters ist ähnlich hoch wie die des Anhydrids ("energiereiche Bindung"). Bei der Reduktion des Thioesters entsteht ein Thiohalbacetal; die SH-Gruppe ist nun „energiearm" verknüpft Auf diese Weise wird die Energie des ATP genutzt, um trotz der hohen Redoxpotenzialdifferenz zwischen Aldehyd und Carboxylat die Reduktion von 3-Phosphoglycerat zu Glycerinaldehydphosphat zu erzielen. Diese Reaktion ist im Prinzip reversibel. Eine Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase ist auch an der umgekehrten Reaktion beteiligt, die während der Glycolyse im Cytosol abläuft. Im Gegensatz zum cytosolischen Enzym, das mit dem Substratpaar NADH/NAD+ reagiert und in erster Linie die Oxidation des Glycerinaldehydphosphats katalysiert, reagiert das chloroplastidäre Enzym mit NADPH als Wasserstoffdonor.
Dies ist ein Beispiel für die unterschiedlichen Funktionen der NADH- und NADPH-Systeme im Stoffwechsel eukaryontischer Zellen. Während die Funktion des NADH-Systems in erster Linie im Einsammeln von Reduktionsäquivalenten für die Oxidation zur Energiegewinnung besteht, ist die Rolle des NADPH-Systems in der Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten für Synthesen zu sehen. Man hat in einem Bild das NADH-System mit einer Wasserstoff-Niederdruckleitung verglichen, durch die Reduktionsäquivalente für die Oxidation zur Energiegewinnung abgesaugt werden, und das NADPH-System mit einer Wasserstoff-Hochdruckleitung, durch welche Reduktionsäquivalente in Syntheseprozesse gedrückt werden. So ist in der Regel das Verhältnis reduziert/oxidiert beim NADPH-System etwa hundertmal höher als beim NADH-System. Der auch in den Chloroplasten relativ hohe Reduktionsgrad des NADPH-Systems (etwa 50 bis 60 % reduziert) bewirkt, dass die Reduktion von 1,3-Bisphosphoglycerat zu Glycerinaldehyd-3-phosphat mit hoher Effizienz abläuft.
Die Triosephosphat-Isomerase katalysiert die Isomerisierung des Glycerinaldehydphosphats zu Dihydroxyacetonphosphat. Diese Umwandlung einer Aldose in eine Ketose erfolgt über ein 1,2-Endiol als Intermediat in prinzipiell gleicher Weise wie bei der Ribosephosphat-Isomerase. Das Gleichgewicht der Reaktion liegt weit auf der Seite des Ketons, wobei das Gleichgewicht durch die Temperatur beeinflusst wird. Triosephosphat als Sammelbezeichnung besteht demnach zu etwa 96 % aus Dihydroxyacetonphosphat und nur zu 4 % aus Glycerinaldehydphosphat.

6.4 Aus Triosephosphat wird Ribulosebisphosphat regeneriert
Stellt man die Bilanz der bisher besprochenen Reaktionen der CO2-Fixierung auf, so ergibt sich, dass bei der Fixierung von drei Molekülen CO2 sechs Moleküle 3-Phosphoglycerat und daraus sechs Moleküle Triosephosphat entstehen (Abb. 6.11).

Von diesen ist nur ein Triosephosphat der eigentliche Gewinn und kann der Zelle anderenorts für Biosynthesezwecke bereitgestellt werden. Die restlichen fünf Triosephosphate sind erforderlich, um die drei Moleküle RuBP zurückzugewinnen, so dass der Calvin-Cyclus erneut fortgesetzt werden kann. Abbildung 6.12 zeigt den Reaktionsweg der fünf Triosen zu drei Pentosen.

Katalysiert durch das Enzym Aldolase werden in reversibler Reaktion die beiden Triosen Dihydroxyacetonphosphat und Glycerinaldehydphosphat zu Fructose-1 ,6-bisphosphat verknüpft (Abb. 6.13).

Abbildung 6.14 zeigt den Mechanismus dieser Reaktion. Dihydroxyacetonphosphat bildet mit einer endständigen Aminogruppe eines Lysinrestes des Enzymproteins eine Schiffsche Base. Die positive Ladung am Stickstoff begünstigt die Abspaltung eines Protons an C-3, es bildet sich so ein Carbanion. Es gibt eine Resonanzform des Glycerinaldehydphosphats, bei der das C-Atom der Aldehydgruppe positiv geladen ist. Dies ermöglicht eine Verknüpfung zwischen diesem C-Atom und dem negativ geladenen C-3 des Dihydroxyacetonphosphats. Nach der Kondensation wird die Schiffsche Base durch Hydrolyse wieder gespalten und so Fructose-1,6-bisphosphat freigesetzt. Durch das gleiche Enzym wird durch entsprechende Reaktion mit Erythrose-4-phosphat Sedoheptulose-1,7- bisphosphat gebildet. Die Gesamtreaktion ist reversibel.

Durch Fructose-1,6-bisphosphatase (Abb. 6.15) wird der Phosphatrest in Position 1 durch Hydrolyse abgespalten; dabei entsteht Fructose-6-phosphat. Diese Reaktion ist irreversibel.

Durch das Enzym Transketolase wird von Fructose-6-phosphat ein Kohlenhydratrest mit zwei C-Atomen auf Glycerinaldehyd-3-phosphat übertragen; es entsteht dabei in reversibler Reaktion neben der Pentose Xylulose-5-phosphat die Tetrose Erythrose-4-phosphat (Abb. 6.16).

An dieser Reaktion ist Thiaminpyrophosphat (Abb. 5.5), das auch Reaktionspartner der Pyruvatoxidation ist (Abschn. 5.3), als prosthetische Gruppe beteiligt. Abb. 6.17 zeigt den Mechanismus der Reaktion. In einer Resonanzstruktur ist das C-Atom der Ketogruppe des Fructose-6-phosphat (bzw. Sedoheptulose-7-phosphat) positiv geladen. Durch Reaktion dieses C-Atoms mit dem negativ geladenen C-Atom des Thiazoliumringes des Thiaminpyrophosphats wird ein Addukt gebildet. Der weitere Mechanismus entspricht dem der Aldolasereaktion Abbildung 6.14. Die positive Ladung des N-Atoms im Thiazoliumring führt dazu, dass wie bei der Aldolase das zweite C-Atom neben diesem N-Atom negativ geladen wird. Die dadurch verursachte Spaltung der C-C-Bindung führt zur Ablösung eines am Thiazoliumring gebundenen C2-Restes, die verbleibende Aldose (Erythrose-4-phosphat bzw. Ribose-5-phosphat) wird freigesetzt. Wie bei der Aldolasereaktion wird auch der C2-Rest mit seinem negativ geladenen C-Atom mit dem positiv geladenen C-Atom der Aldehydgruppe des Glycerinaldehydphosphats verknüpft und danach der Thiazoliumring wieder abgespalten. Die Gesamtreaktion ist reversibel.

Aldolase (Abb. 6.13) katalysiert auch eine Kondensation von Erythrose-4-phosphat mit Dihydroxyacetonphosphat zu Sedoheptulose-1,7-bisphosphat. Danach katalysiert Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase die irreversible Hydrolyse des Sedoheptulose-1,7-bisphosphats. Die Reaktion verläuft analog der Hydrolyse des Fructose-1,6-bisphosphats; beide Reaktionen werden aber durch unterschiedliche Enzyme katalysiert. Durch Transketolase wird dann wieder ein Kohlenhydratrest mit zwei C-Atomen von Sedoheptulose-7-phosphat auf Glycerinaldehyd-3-phosphat übertragen; es entstehen dabei die beiden Pentosen Ribose-5-phosphat und Xylulose-5-phosphat.
Die so insgesamt gewonnenen drei Pentosephosphate werden nun zu Ribulose-5-phosphat umgesetzt (Abb. 6.18). Die Umwandlung des Xylulose-5-phosphats wird durch Ribulosephosphat-Epimerase katalysiert; diese Reaktion verläuft über eine Keto-Enol-Tautomerie mit einem 2,3-Endiol als Zwischenprodukt. Die Reaktion der Aldose Ribose-5-phosphat zur Ketose Ribulose-5-phosphat benötigt Ribosephosphat-Isomerase und verläuft ebenfalls über ein Endiol als Zwischenprodukt, allerdings in 1,2-Position.

Die so insgesamt entstandenen drei Moleküle Ribulose-5-phosphat werden unter Verbrauch von ATP durch die Ribulosephospbat-Kinase (Abb. 6.19) in den CO2-Akzeptor Ribulose-1,5-bisphosphat umgewandelt. Da hierbei der Phosphatrest aus einer „energiereichen" Anhydridbindung im ATP zu einem „energiearmen" Phosphatester umgesetzt wird, ist diese Kinasereaktion irreversibel.

In Abbildung 6.20 ist der Calvin-Cyclus in allen Einzelheiten dargestellt. Der Cyclus weist vier irreversible Schritte auf: die Carboxylierung, die Hydrolyse von Fructose- und Sedoheptulosebisphosphat und die Phosphorylierung von Ribulose-5-phosphat. Die Fixierung von einem Molekül CO2 erfordert insgesamt zwei Moleküle NADPH und drei ATP.


6.5 Neben dem reduktiven Pentosephosphatweg gibt es auch einen oxidativen Pentosephosphatweg
Neben dem bislang besprochenen reduktiven Pentosephosphatweg gibt es in den Chloroplasten auch einen oxidativen Pentosephosphatweg. Durch letzteren Stoffwechselweg, der eine allgemeine Funktion in der Pflanzen- und Tierwelt hat, wird ein Hexosephosphat unter Freisetzung von einem Molekül CO2 zu einem Pentosephosphat oxidiert. Die Bedeutung dieses Reaktionsweges liegt in der Gewinnung von NADPH als "Hochdruckwasserstoff" für Biosyntheseprozesse. Abbildung 6.21 zeigt den Verlauf der Reaktionskette. Glucose-6-phosphat wird zunächst durch das Enzym Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zu 6-Phosphogluconolacton oxidiert Abbildung 6.22. Diese Reaktion ist stark exergonisch und daher nicht umkehrbar. 6-Phosphogluconolacton, ein innerer Ester, wird durch Lactonase hydrolytisch gespalten. Das so gebildete Gluconat-6-phosphat wird wiederum unter Bildung von NADPH, durch das Enzym Gluconat-6-phosphat-Dehydrogenase zu Ribulose-5-phosphat oxidiert. Dabei wird CO2 freigesetzt. Isoenzyme der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und der Gluconat-6-phosphat-Dehydrogenase gibt es übrigens auch im Cytosol.

In Umkehrung zum reduktiven Pentosephosphatweg entstehen beim oxidativen Weg aus Ribulose-5-phosphat durch Ribulosephosphat-Epimerase Xylulose-5-phosphat und durch die Ribosephosphat-Isomerase Ribose-5- phosphat; diese beiden Produkte werden durch Transketolase zu Sedoheptulose-7-phosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat umgesetzt. Auch diese Transketolase ist TPP-abhängig und überträgt C2-Einheiten (vergl. Abb. 6.17, 5.4 und 5.5A). Die Weiterreaktion der entstandenen Produkte ist eine Besonderheit des oxidativen Weges. Transaldolase überträgt einen nichtphosphorylierten C3 Rest von Sedoheptulose-7-phosphat auf Glycerinaldehyd-3-phosphat, wobei Fructose-6-phosphat und Erythrose-4-phosphat gebildet werden (Abb. 6.23). Der Reaktionsmechanismus ist prinzipiell der gleiche wie bei der Aldolase (Abb. 6.13) mit dem Unterschied, dass nach der C-C-Spaltung die Verknüpfung des C3 -Restes zunächst mit dem Enzym über die Schiffsche Base erhalten bleibt. Erythrose-4-phosphat reagiert mit einem weiteren Xylulose-5-phosphat durch eine Transketolase-Reaktion zu Glycerinaldehyd-3-phosphat und Fructose-6-phosphat. Es entstehen so aus drei Pentosephosphaten (C5-P ) zwei Hexosephosphate (C6-P) und ein Triosephosphat (C3-P):

Während im oxidativen Weg bei der Freisetzung von einem Mol CO2 aus einem Kohlenhydrat zwei Mol NADPH gewonnen werden, müssen im reduktiven Weg für die Fixienmg von einem Mol CO2 neben diesen zwei Mol NADPH auch noch drei Mol ATP aufgewendet werden (Abb. 6.24). Die so aufgewendete Energie macht es möglich, dass der reduktive Pentosephosphatweg mit hoher Flussrate in entgegengesetzter Richtung zum oxidativen Weg ablaufen kann.


Reduktiver und oxidativer Pentosephosphatweg werden reguliert
Im Stroma der Chloroplasten gibt es sowohl die Enzyme des reduktiven als auch die des oxidativen Pentosephosphatweges (Abb. 6.24). Ein gleichzeitiger Ablauf beider Stoffwechselwege, bei dem durch Einsatz von drei ATP und zwei NADPH ein Molekül CO2 zur Stufe des Kohlenhydrats reduziert würde, um dann anschließend durch Oxidation unter Gewinnung von zwei NADPH wieder zu CO2 zurück zu reagieren, wäre ein unnützer Cyclus (engl. futile cycle), der bei jedem Durchgang drei Mol ATP verbrauchen würde. Spezifische Regulationsprozesse vermeiden dieses, indem Schlüsselenzyme des reduktiven Pentosephosphatweges nur im Licht aktiv sind und im Dunkeln ausgeschaltet sind, während das Startenzym des oxidativen Weges nur im Dunkeln eingeschaltet ist.

Reduzierte Thioredoxine übertragen das Signal für "Belichtung" auf Enzymproteine
Ein wichtiges Signal für den Zustand "Belichtung" besteht in der Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten durch den photosynthetischen Elektronentransport in Form von reduziertem Ferredoxin (Abb. 6.25). Katalysiert durch die Ferredoxin-Thioredoxin-Reduktase, einem Eisen-Schwefel-Protein des 4Fe-4S-Typ, werden Teile dieser Reduktionsäquivalente vom Ferredoxin auf Thioredoxine übertragen.
Thioredoxine bilden eine Familie kleiner, aus etwa 100 Aminosäuren aufgebauter Proteine, welche als reaktive Gruppe die Sequenz -Cys-Gly-Pro-Cys- enthalten. Dieses Aminosäuremotiv liegt an der Außenseite des Proteins. Durch die sterisch benachbarten Cysteingruppen sind beim Thioredoxin zwei Redoxzustände möglich: Das reduzierte Thioredoxin mit zwei SH-Gruppen und das oxidierte Thioredoxin, bei dem die beiden Cysteine durch eine Disulfid-(S-S)-Brücke verknüpft sind.

Thioredoxine sind in der belebten Welt universal verbreitet: Man findet sie in allen Lebenwesen, von den Archaebakterien bis zu Pflanzen und Tieren. Sie wirken als Proteindisulfid-Oxidoreduktasen, indem sie einzelne Disulfidbrücken in Zielproteinen zur SH-Form reduzieren und reoxidieren können. Sie haben dabei trotz ihrer geringen Größe eine hohe Substratspezifität. Sie reagieren mit nur ganz bestimmten Proteinen und dort auch nur mit bestimmten Disulfidbrücken. Thioredoxine können auch als Redoxüberträger an der Reduktion niedermolekularer Substanzen beteiligt sein. So wurde Thioredoxin aufgrund seiner Funktion als Redoxüberträger bei der Reduktion von Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden entdeckt. Man kennt heute eine Reihe von Prozessen, von der Assemblierung der Bakteriophagen bis zur Hormonwirkung oder der Blutgerinnung in Tieren, an denen Thioredoxine beteiligt sind. Thioredoxine sind auch an der reduktiven Aktivierung von Samenproteinen bei der Keimung beteiligt. Die Beteiligung der Thioredoxine an der Lichtregulation von chloroplastidären Enzymen ist daher als eine spezielle Funktion zu sehen, welche die Thioredoxine während der Evolution zusätzlich zu ihren allgemeinen Funktionen übernommen haben.
Durch reduziertes Thioredoxin werden die in Chloroplasten vorhandenen Enzyme Ribulosephosphat-Kinase, NADP-Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase, Fructose-1,6-bisphosphatase und Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase aus dem inaktiven Zustand in den aktiven Zustand versetzt und so durch Licht eingeschaltet. Dies gilt auch für andere chloroplastidäre Enzyme. So werden über reduziertes Thioredoxin die RubisCO-Aktivase (Abschn. 6.2), die NADP-Malat-Dehydrogenase (Abschn. 7.3) und die F-ATP-Synthase (Abschn. 4.4) durch Licht eingeschaltet. Andererseits wird durch reduziertes Thioredoxin Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, das Startenzym des oxidativen Pentosephosphatweges, ausgeschaltet. Die ungerichtete Suche nach Reaktionspartnern von Thioredoxinen in der Proteomforschung hat hunderte Zielproteine identifiziert, die durch Dithiol-Disulfidübergänge reguliert werden könnten. Die Kandidatenproteine beteiligen sich an verschiedenen zellulären Prozessen wie Transkription, Translation und Signalverarbeitung. Diese experimentellen Daten zusammen mit der Erkenntnis, dass die Thioredoxine in höheren Pflanzen durch große Genfamilien kodiert werden, zeigen, dass Thioredoxin-abhängige Redoxregulationen in Pflanzen eine außerordentlich breite Bedeutung für die Pflanzenentwicklung und Umweltanpassung haben.

Die durch Thioredoxin modulierte Aktivierung chloroplastidärer Enzyme besteht in der Lösung einer eingebauten Sperre
Wichtige Erkenntnisse darüber, wie Thioredoxin auf die oben genannten chloroplastidären Enzyme wirkt, wurden durch den Strukturvergleich mit entsprechenden Isoenzymen aus anderen Zellkompartimenten gewonnen. So existieren von der Fructose-1,6-bisphosphatase, der NADP-Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase und der Malat-Dehydrogenase lsoenzyme im Cytosol, die nicht durch Thioredoxin reguliert werden. Dies gilt auch für die F-ATP-Synthase in den Mitochondrien. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen zeigt, dass zumindest in einigen Fällen die chloroplastidären Isoenzyme am Ende oder auch im Inneren ihrer Sequenz zusätzliche Abschnitte aufweisen (Abb. 6.26). In diesen befinden sich jeweils zwei Cysteinreste, die durch nur vier oder fünf Aminosäuren voneinander getrennt sind. Die SH-Gruppen dieser beiden benachbarten Cysteinreste können durch Oxidation zu einem Disulfid reagieren und bilden so das Substrat für die Protein-Disulfid-Oxidoreduktaseaktivität des Thioredoxins.

Durch den Austausch der an der Regulation beteiligten Cysteine mithilfe gentechnischer Methoden (Kapitel 22) wurden Enzyme erhalten, die auch ohne die Anwesenheit von reduziertem Thioredoxin voll aktiv sind. Den Enzymen, die durch Thioredoxin reguliert werden, wird unter oxidierenden Bedingungen durch die Bildung einer Disulfidbrücke eine Konformation aufgezwungen, bei der das katalytische Zentrum unzugänglich wird. Die Reduktion dieser Disulfidbrücke durch Thioredoxin löst diese Sperre; die Enzymproteine gehen in die entspannte Konformation über, bei welcher das katalytische Zentrum aktiv ist.
Die besprochene Lichtaktivierung ist kein Alles-oder-Nichts-Effekt. Der Aktivierungsgrad der Enzyme spiegelt stattdessen die Balance zwischen der Thioredoxin-vermittelten Reduktion und der Thioloxidation durch oxidierende Reaktionen beispielsweise mit reaktiven Sauerstoffspezies wider. Der Aktivierungsgrad des Enzyms ist eine Funktion der Reduktionsrate. Diese wird nicht nur durch den Redoxzustand des Thioredoxins (und letztlich durch den Redoxgrad des Ferredoxins) bestimmt, sondern auch durch Metabolite. So wird die reduktive Aktivierung der Fructose- und Sedoheptulose-Bisphosphatasen durch die Anwesenheit der betreffenden Zucker-Bisphosphate erhöht. Die Wirkung dieser Effektoren beruht auf einer Herabsetzung der Redoxpotenziale der SH-Gruppen in den betreffenden Enzymen, wodurch die Reduktion der Disulfidgruppen durch Thioredoxin erleichert wird. Auf diese Weise wird die Aktivität der genannten Enzyme erhöht, wenn die Konzentrationen ihrer Substrate ansteigen. Dagegen wird durch NADP+ die reduktive Aktivierung der NADP-Malat-Dehydrogenase vermindert. Dies führt dazu, dass das Enzym nur bei einem hohen NADPH/NADP+-Quotienten aktiv ist (siehe Abschn. 7.3). Andererseits wird die reduktive Inaktivierung der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase durch NADPH verstärkt und so bei ausreichender Versorgung mit NADPH die Aktivität des oxidativen Pentosephosphatweges (Abschn.6.5) im Licht gedrosselt.

Eine Reihe weiterer Regulationsvorgänge sorgt dafür, dass der Cyclus des reduktiven Pentosephosphatweges in den einzelnen Schritten abgestimmt ist
Die Aktivität des Calvinzyklus wird über weitere "feed forward"-Aktivierungsmechanismen mit den Lichtreaktionen koordiniert. Bei Belichtung sinkt im Stroma die Protonenkonzentration (Anstieg des pH-Wertes auf >8) durch H+-Eintransport in das Thylakoidlumen. Parallel werden zur Ladungskompensation Mg2+-Ionen aus dem Lumen ins Stroma exportiert. Man kann dort beim Dunkel-Licht-Wechsel eine Änderung des pH-Wertes von etwa 7,2 auf 8,0 beobachten. Die CO2-Fixierung isolierter Chloroplasten zeigt ein Optimum bei etwa pH 8,0 mit einem scharfen Abfall zum sauren Bereich. Eine fast identische pH-Abhängigkeit zeigen die lichtaktivierten Enzyme Fructose-1,6-bisphosphatase und Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase. Zudem wird durch den lichtabhängigen Anstieg der Mg2+-Konzentration im Stroma die katalytische Aktivität dieser beiden Enzyme erhöht. Die Lichtaktivierung dieser Enzyme durch das Thioredoxinsystem bildet zusammen mit der Aktivierung durch lichtinduzierte pH- und Mg2+-Änderungen, von denen bereits jede für sich allein zu einer weitgehenden Ausschaltung der oben genannten Enzyme im Dunkeln führt, ein effizientes System, um im Bedarfsfall Enzyme ein- oder auszuschalten.
Hinzu kommt noch eine Regulation der Aktivitäten stromaler Enzyme durch Metabolitspiegel. So werden die chloroplastidäre Fructose-1,6-bisphosphatase und Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase durch ihre jeweiligen Produkte Fructose-6-phosphat beziehungsweise Sedoheptulose-7-phosphat gehemmt (Feedback-Hemmung). Dadurch können diese Enzyme in ihrer Aktivität gedrosselt werden, wenn sich ihre Produkte anstauen. Ribulosephosphat-Kinase wird durch 3-Phosphoglycerat und auch durch ADP gehemmt. Letzteres scheint bei der Koordination der beiden Kinasereaktionen des reduktiven Pentosephosphatweges eine Rolle zu spielen. Während Ribulosephosphat-Kinase eine irreversible Reaktion katalysiert, ist die Phosphoglycerat-Kinasereaktion reversibel. Wenn beide Reaktionen ungehindert um das ATP konkurrierten, würde bei einem Mangel an ATP die irreversible Phosphorylierung des Ribulose-5-phosphats die Überhand gewinnen, mit dem Resultat, dass der Cyclus aus der Balance kommt. Eine Drosselung der Ribulosephosphat-Kinase durch ADP mag dies verhindern.
Schließlich beobachtet man eine starke Hemmung der Fructose-1,6-bisphosphatase und der Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase durch Glycerat. Wie in Abschnitt 7.1 gezeigt, ist Glycerat ein Zwischenprodukt für die Wiederverwertung des durch die Oxygenaseaktivität der RubisCO gebildeten Phosphoglycolats. Diese Hemmung ermöglicht es, dass bei einem Anstau des Glycerats über eine Verminderung der Bereitstellung von Ribulose-1,5-bisphosphat die Carboxylierung und die begleitende Oxygenierung durch die RubisCO gedrosselt werden.
Auch die RubisCO unterliegt einer Regulation. Es lässt sich am ganzen Blatt zeigen, dass das Ausmaß der Aktivierung der RubisCO mit der Beleuchtungsstärke und der Photosyntheserate korreliert. Der Aktivierungszustand der RubisCO wird über eine Regulation der RubisCO-Aktivase (Abschn. 6.2) eingestellt. Zum einen wird die RubisCO-Aktivase durch reduziertes Thioredoxin aktiviert. Außerdem ist die Aktivität der RubisCO-Aktivase vom ATP/ADP-Quotienten abhängig. Wenn der ATP/ADP-Quotient im Chloroplastenstroma steigt, erhöht sich auch die Aktivaseaktivität. Es wird diskutiert, dass auf diese Weise die Aktivität der RubisCO der Bereitstellung von ATP durch die Lichtreaktion der Photosynthese angepasst wird. Viele Beobachtungen sprechen aber dafür, dass dies nicht der einzige Mechanismus für eine Lichtregulation sein kann. So ist auch vorgeschlagen worden, dass der lichtabhängige H+-Gradient über die Thylakoidmembran die RubisCO-Aktivase reguliert. Außerdem wird die Aktivität der RubisCO durch ihr Produkt 3-Phosphoglycerat gehemmt. Auf diese Weise könnte die Aktivität der RubisCO bei einem Anstau ihres Produktes gedrosselt werden.
In Abbildung 6.27 sind die verschiedenen Faktoren, welche die Regulation von Enzymen des reduktiven und des oxidativen Pentosephosphatweges beeinflussen, in schematischer Form zusammengestellt. Eine Vielfalt von regulatorischen Prozessen sorgt dafür, dass die einzelnen Schritte der beiden Reaktionsketten aufeinander abgestimmt und dem Bedarf angepasst werden.

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7 Über den Photorespirationsweg wird das durch die Oxygenaseaktivität der RubisCO gebildete Phosphoglycolat recycelt
Wie in Abschnitt 6.2 besprochen, entsteht bei der CO2-Fixierung durch RubisCO als Folge der Oxygenierungsaktivität des Enzyms in großen Mengen das Nebenprodukt 2-Phosphoglycolat. In einem Recycling-Prozess wird aus diesem Nebenprodukt über den Calvin-Benson-Zyklus das Intermediat 3-Phosphoglycerat zurückgewonnen. Dieses Recycling erfolgt in einer Reaktionskette, die vor allem von dem amerikanischen Forscher Edward Tolbert 1972 aufgeklärt wurde und als Photorespirationsweg bezeichnet wird. Die Bezeichnung stammt daher, dass bei diesem Weg (der nur im Licht abläuft) unter Sauerstoffverbrauch eine Substratoxidation unter Bildung von CO2 stattfindet. Während jedoch bei der eigentlichen mitochondrialen Respiration, der Zellatmung, die Oxidation von Substraten zu CO2 zum Zweck der Gewinnung von Energie erfolgt, wird bei der Photorespiration Energie in erheblichem Maße verbraucht.

7.1 Durch das Recycling von 2-Phosphoglycolat wird Ribulose-1,5-bisphosphat zurückgewonnen
Abbildung 7.1 zeigt einen Überblick über die einzelnen Reaktionsschritte des Photorespirationsweges und deren Lokalisation. Die Oxigenierung von 2 Molekülen Ribulose-1,5-bisphosphat ergibt 2 Moleküle 2-Phosphoglycolat und 2 Moleküle 3-Phosphoglycerat. Bei dem im Nachfolgenden behandelten Recycling entstehen aus den 2 Molekülen 2-Phosphoglycolat ein weiteres 3-Phosphoglycerat. Dieser Prozess beginnt mit der hydrolytischen Abspaltung des Phosphatrestes durch das im Chloroplastenstroma vorhandene Enzym Glycolatphosphat-Phosphatase (Abb. 7.2). Über einen spezifischen Translokator in der inneren Hüllmembran wird das entstandene Glycolat aus den Chloroplasten ausgeschleust. Der Eintritt in die Peroxisomen erfolgt durch Poren in der peroxisomalen Hüllmembran, die wahrscheinlich durch ein Porin (Abschn. 1.11) gebildet werden.

In den Peroxisomen wird durch Glycolat-Oxidase in irreversibler Reaktion die Hydroxygruppe des Glycolats zu einer Carbonylgruppe oxidiert, dabei entsteht Glyoxylat. Die Reduktionsäquivalente werden unter Bildung von H2O2 auf molekularen Sauerstoff übertragen (Abb. 7.2). Wie andere H2O2-bildende Oxidasen enthält die Glycolat-Oxidase ein Flavinmononukleotid (FMN, Abb. 5.16) als Redoxüberträger zwischen Glycolat und Sauerstoff. Das gebildete H2O2 wird durch die ebenfalls in den Peroxisomen vorhandene Katalase zu Wasser und Sauerstoff disproportioniert. In der Bilanz werden so für die Oxidation von 1 mol Glycolat zu Glyoxylat 0,5 mol O2 verbraucht. Für den gesamten Prozess wird 1 mol H2O2 benötigt, da die RubisCO auch noch Sauerstoff verbraucht.

Das Glyoxylat wird noch in den Peroxisomen durch Aminotransferasen zu der Aminosäure Glycin umgesetzt. Dies ist über zwei verschiedene Reaktionen möglich, die nebeneinander im Verhältnis 1:1 ablaufen. Durch die Glutamat-Glyoxylat-Aminotransferase wird auf Glyoxylat der Aminorest von dem Donor Glutamat übertragen. Dieses Enzym akzeptiert auch Alanin als Aminodonor. Bei der Serin-Glyoxylat-Aminotransferase dient Serin als Aminodonor. Diese beiden Enzyme, wie auch andere Aminotransferasen (z. B. Glutamat-Oxalacetat-Aminotransferase, (siehe Abschn. 10.4) enthalten gebundenes Pyridoxalphosphat mit einer Aldehydgruppe als reaktiver Gruppe (Abb. 7.3).

Abbildung 7.4 zeigt den Reaktionsverlauf. Die Aldehydgruppe bildet mit der α-Aminogruppe der Aminosäure (in diesem Beispiel Glutamat oder Serin) eine Schiffsehe Base (A), die durch basenkatalysierte Protonenverschiebung in eine isomere Form übergeht (B). Die Hydrolyse der isomeren Schiffsehen Base führt zur Bildung einer α-Ketosäure (α-Ketoglutarat oder Hydroxypyruvat), und freiem Pyridoxamin (C). Die Aminogruppe dieses Pyridoxamins bildet jetzt eine Schiffsche Base mit einer α-Ketosäure (in diesem Fall Glyoxylat), und durch Umkehrung der Schritte C, B und A entsteht Glycin, dabei wird das Pyridoxal zurückgewonnen und steht für den nächsten Reaktionscyclus zur Verfügung.

Das Glycin verlässt die Peroxisomen durch Poren und wird in die Mitochondrien transportiert. Auch wenn dieser Eintritt noch nicht im Detail charakterisiert ist, so kann man davon ausgehen, dass er über einen spezifischen Translokator erfolgt. In den Mitochondrien erfolgt die Oxidation von zwei Molekülen Glycin zu einem Molekül Serin unter Freisetzung von CO2 und NH4+ (Abbildung 7.5).

Die dabei anfallenden Reduktionsäquivalente werden auf NAD+ übertragen. Die Oxidation des Glycins erfolgt durch den Glycin-Decarboxylase-Komplex. Dies ist ein Multienzymkomplex aus verschiedenen Untereinheiten, der eine große Ähnlichkeit mit dem bereits besprochenen Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (Abb. 5.4) aufweist. Im Zentrum befindet sich das so genannte H-Protein mit der prosthetischen Gruppe Liponsäureamid (Abb. 5.5). Um dieses Zentrum herum gruppieren sich das Pyridoxalphosphat-haltige P-Protein, das T-Protein mit einem Tetrahydrofolat (siehe Abb. 7.6) sowie ein L-Protein, welches auch Dihydrolipoat-Dehydrogeoase genannt wird und mit dem L-Protein des Pyruvat- und α-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes identisch ist. Da die Disulfidgruppe des Liponsäureamids im H-Protein am Ende eines flexiblen Polypeptidarms liegt (vgl. Abb 5.4), kann sie mit den anderen drei Untereinheiten reagieren. Eng benachbart zu dem Glycin-Decarboxylase-Komplex ist das Enzym Serin-Hydroxymethyl-Transferase lokalisiert.

Abbildung 7.7 zeigt den Reaktionsweg. Die Aminogruppe des Glycins reagiert zunächst mit der Aldehydgruppe des Pyridoxals im P-Protein zu einer Schiffsehen Base (A). Der Glycylrest wird decarboxyliert und von dem P-Protein auf den Liponsäurerest des H-Proteins übertragen (B). Dies ist zugleich der eigentliche Oxidationsschritt: Der C1-Rest wird zur Stufe eines Methylenrestes oxidiert und der Liponsäurerest zur Dihydroliponsäure reduziert. Das Dihydroliponsäureaddukt reagiert nun mit dem T-Protein, dabei wird der C1-Rest unter Freisetzung des Dihydroliponsäurerestes auf Tetrahydrofolat übertragen (C). Über das L-Protein (Dihydrolipoat-Dehydrogenase) wird die Dihydroliponsäure wieder zur Liponsäure oxidiert und dabei NAD zu NADH reduziert (D). Es kann nun ein neuer Reaktionscyclus beginnen. Der an das Tetrahydrofolat gebundene Methylenrest wird durch Serin-Hydroxymethyl-Transferase auf ein zweites Molekül Glycin unter Bildung von Serin übertragen (E).

Die in der mitochondrialen Matrix in Form von NADH anfallenden Reduktionsäquivalente können durch die mitochondriale Atmungskette unter Gewinnung von ATP oxidiert werden. Sie können aber auch, wie in Abschnitt 7.3 besprochen, für die Versorgung anderer Zellkompartimente exportiert werden. Die Kapazität der Glycinoxidation in den Mitochondrien grüner Pflanzenzellen ist sehr hoch. In diesen Mitochondrien können die Proteine des Glycin-Decarboxylase-Komplexes 30 bis 50% des Gehaltes an löslichen Proteinen ausmachen. In Mitochondrien nicht-grüner Pflanzenzellen findet man die Proteine der Glycinoxidation dagegen nur in sehr geringem Umfang.
Das gebildete Serin verlässt die Mitochondrien - wahrscheinlich über einen spezifischen Translokator. Es könnte sich um den gleichen Translokator handeln, der Glycin importiert. Nach Eintritt in die Peroxisomen durch die bereits besprochenen Poren wird über die schon erwähnte Serin-Glyoxylat-Aminotransferase das Serin zu Hydroxypyruvat umgesetzt (Abb. 7.8). Letzteres wird unter Verbrauch von NADH zu D-Glycerat reduziert, dies wird durch Hydroxypyruvat-Reduktase katalysiert. Das gebildete Glycerat wird aus den Peroxisomen in die Chloroplasten importiert.

Die Aufnahme von Glycerat in die Chloroplasten erfolgt über den gleichen Translokator, über den Glycolat ausgeschleust wird (Glycolat-Glycerat-Translokator). Dieser bewirkt sowohl einen Glycola-Glycerat-Gegentausch als auch einen Co-Transport von Glycolat allein mit einem Proton. So ermöglicht dieser Translokator einen Export von zwei Molekülen Glycolat aus den Chloroplasten gegen den Import von einem Molekül Glycerat. Durch die in den Chloroplasten vorhandene Glycerat-Kinase wird das Glycerat unter ATP-Verbrauch zu 3-Phosphoglycerat umgesetzt. Schließlich reagiert 3-Phosphoglycerat unter Verbrauch von ATP und NADPH im Reaktionsweg des reduktiven Pentosephosphatweges (Abschn. 6.3, 6.4) wieder zu Ribulose-1,5-bisphosphat. Damit ist das Recycling des 2-Phosphoglycolats abgeschlossen. Das bei der Glycinoxidation freigesetzte Ammonium-Ion muss aber noch energieaufwendig rückgewonnen werden.

7.2 Das im Photorespirationsweg freigesetzte Ammonium-Ion wird mit hoher Effizienz refixiert
Stickstoff ist für eine Pflanze ein sehr wertvoller Baustein. Das Wachstum wird häufig durch die Stickstoffversorgung begrenzt. Für die Ökonomie des Pflanzenstoffwechsels ist es daher entscheidend, dass das im Photorespirationsweg mit sehr hoher Rate freigesetzte Ammonium wieder vollständig refixiert wird. Diese Refixierung findet in den Chloroplasten statt. Sie wird durch den gleichen Enzymapparat katalysiert, der auch an der Nitratassimilation beteiligt ist (siehe Kapitel 10), wobei die Rate der NH4+-Refixierung in der Photorespiration fünf- bis zehnmal mal höher ist als die Rate der NH4+-Fixierung bei der Nitratassimilation.
In einer Pflanzenzelle liegen Chloroplasten und Mitochondrien meist in sehr enger Nachbarschaft. Das bei der Glycinoxidation gebildete NH4+ passiert die inneren Membranen der Mitochondrien und der Chloroplasten. Ob dies durch eine einfache Diffusion von NH3 über die Membranen oder zum Beispiel durch einen spezifischen NH4+-Kanal erfolgt, ist bislang nicht eindeutig geklärt. Durch die in den Chloroplasten vorhandene Glutamin-Synthetase wird das Ammonium-Ion unter ATP-Verbrauch auf die δ-Carboxygruppe des Glutamats übertragen (Abb. 7.9), dabei entsteht das Säureamid Glutamin. Die δ-Carboxylgruppe wird zunächst durch ATP in ein Phosphatanhydrid als aktiviertes Zwischenprodukt umgewandelt. Die Glutamin-Synthetase hat eine hohe Affinität für NH4+ und katalysiert einen praktisch irreversiblen Prozess. Das Enzym hat eine Schlüsselfunktion für die Fixierung des NH4+ nicht nur in Pflanzen, sondern auch in Bakterien und Tieren.

Der in Form von Glutamin fixierte Aminostickstoff wird durch die Glutamat-Synthase, auch als Glutamin-2-0xoglutarat-Aminotransferase GOGAT bekannt, über eine reduktive Aminierung auf α-Ketoglutarat übertragen (Abb. 7.9); bei dieser Reaktion entstehen zwei Moleküle Glutamat. Die dazu erforderlichen Reduktionsäquivalente werden durch reduziertes Ferredoxin, einem Produkt des photosynthetischen Elektronentransports, angeliefert. Diese Reaktion ist in grünen Pflanzenzellen ausschließlich in den Chloroplasten lokalisiert. Ein Isoenzym der Glutamat-Synthase ist auch in Plastiden von nicht-grünen Geweben, wie z. B. Wurzeln, enthalten, dort allerdings mit NADH als Redoxpartner.
Für Arabidopsis wurde gezeigt, dass die Glutamin-Synthetase auch in Mitochondrien vorkommt, demnach findet eine Fixierung des NH4+ auch dort statt. Da die Glutamat-Synthase exklusiv in den Chloroplasten lokalisiert ist, muss das in den Mitochondrien als Glutamin fixierte Ammonium in die Chloroplasten transferiert werden. Wie dies geschieht ist noch unbekannt. Eine Möglichkeit für den Transfer wäre ein Glutamin-Glutamat-Shuttle.
Eines der so in den Chloroplasten gebildeten Glutamatmoleküle wird über einen spezifischen Translokator im Gegentausch mit Malat (Glutamat-Malat-Translokator) exportiert und steht nach Eintritt in die Peroxisomen als Reaktionspartner für die Transaminierung von Glyoxylat bereit (Abb. 7.1). Das dabei gebildete α-Ketoglutarat wird, ebenfalls im Gegentausch mit Malat, über einen Malat-α-Ketoglutarat-Translokator in die Chloroplasten reimportiert.

7.3 Für die Reduktion des Hydroxypyruvats müssen Peroxisomen von außen mit Reduktionsäquivalenten versorgt werden
Wie in Abschnitt 7.1 besprochen, ist bei der in den Peroxisomen erfolgenden Reduktion des Hydroxypyruvats zu Glycerat NADH das Reduktionsmittel. Da die Blattperoxisomen keine Stoffwechselketten besitzen, die das NADH in den erforderlichen hohen Raten bereitstellen können, sind sie von einer Versorgung mit Reduktionsäquivalenten von außen abhängig.

Die Aufnahme von Reduktionsäquivalenten in die Peroxisomen erfolgt über den Malat-Oxalacetat-Shuttle
Im Experiment mit isolierten Peroxisomen ist bei Angebot höherer NADH-Konzentrationen im Außenmedium eine Versorgung der Hydroxypyruvatreduktion zwar möglich. Im Cytosol einer Blattzelle ist jedoch das NADH-System so stark oxidiert (NADH/NAD+ = 10-3), dass die Konzentration des NADH dort im Bereich von nur 1x10-6 mol/L liegt. Diese geringe Konzentration reicht offenbar für den erforderlichen hohen Diffusionsfluss in die Peroxisomen nicht aus. Die Reduktionsäquivalente werden wohl deshalb indirekt über die Aufnahme von Malat und die Freisetzung von Oxalacetat (man bezeichnet dies als Malat-Oxalacetat-Shuttle) in die Peroxisomen importiert (Abb. 7.10).

Eine Schlüsselfunktion hat dabei die Malat-Dehydrogenase (Abb. 5.9), die reversibler Reaktion die Oxidation von Malat zu Oxalacetat katalysiert. Man findet hohe Malat-Dehydrogenase-Aktivitäten sowohl im Cytosol als auch in Chloroplasten, Mitochondrien und Peroxisomen. Die Malat-Dehydrogenasen in den verschiedenen Kompartimenten weisen zwar Unterschiede in ihren Strukturen auf und werden auch durch verschiedene Gene codiert (man spricht von Isoenzymen), sie sind aber homolog, das heißt, sie sind verwandte Proteine, die im Verlauf der Evolution aus einem gemeinsamen Vorläufer entstanden sind. Während bei den Malat-Dehydrogenasen im Cytosol, den Mitochondrien und den Peroxisomen das NADH-System Redoxpartner ist, reagiert das chloroplastidäre Isoenzym mit dem NADPH-System.

Mitochondrien exportieren Reduktionsäquivalente ebenfalls über einen Malat-Oxalacetat-Shuttle
Im Gegensatz zu Mitochondrien aus tierischen Geweben, deren innere Membran für Oxalacetat impermeabel ist, besitzen pflanzliche Mitochondrien einen spezifischen Malat-Oxalacetat-Translokator, der Oxalacetat und Malat im Gegentausch transportiert. Da in der mitochondrialen Matrix Malat-Dehydrogenase in hoher Aktivität vorhanden ist, kann das in den Mitochondrien bei der Glycinoxidation gebildete NADH für die Reduktion von Oxalacetat abgefangen und durch den Malat-Oxalacetat-Shuttle exportiert werden. Die Kapazität des Shuttles ist sehr hoch. Wie aus Abbildung 7.1 ersichtlich ist, ist die Menge des in den Mitochondrien bei der Glycinoxidation anfallenden NADH gleich der Menge an NADH, das in den Peroxisomen für die Reduktion von Hydroxypyruvat verbraucht wird. Wenn jedes in den Peroxisomen gebildete Oxalacetat-Molekül in die Mitochondrien transportiert werden würde, dann würde das bei der Glycinoxidation anfallende NADH vollständig für die Bildung von Malat verbraucht werden und stände somit für den mit der ATP-Synthese gekoppelten Elektronentransport der Atmungskette nicht mehr zur Verfügung. Die mitochondriale ATP-Synthese ist auch während der Photosynthese für die Energieversorgung des Cytosols der grünen Blattzellen wichtig. Tatsächlich wird normalerweise nur etwa die Hälfte des Bedarfs der Peroxisomen an Reduktionsäquivalenten aus den Mitochondrien abgezogen und der andere Teil von den Chloroplasten gedeckt (Abb. 7.10). So bleibt in den Mitochondrien nach der Oxidation des Glycins noch genügend NADH für die ATP-Synthese durch die Atmungskette.

Der Export von Reduktionsäquivalenten aus den Chloroplasten wird durch das „Malatventil" geregelt
Über einen Malat-Oxalacetat-Shuttle können auch die Chloroplasten Reduktionsäquivalente exportieren. Malat und Oxalacetat werden durch einen spezifischen Translokator im Gegentausch über die innere Hüllmembran der Chloroplasten transportiert. Trotz der sehr hohen Kapazität des chloroplastidären Malat-Oxalacetat-Shuttles besteht zwischen dem chloroplastidären und dem cytosolischen Redoxsystem des Cyclus ein hoher Gradient: Das Verhältnis NADPH/NADP+ in den Chloroplasten ist über 100 mal höher als das entsprechende NADH/NAD+-Verhältnis im Cytosol. Hierfür ist die chloroplastidäre Malat-Dehydrogenase verantwortlich. Während Malat-Dehydrogenasen normalerweise ein reversibles Gleichgewicht katalysieren, ist die durch die chloroplastidäre Malat-Dehydrogenase katalysierte Reduktion des Oxalacetats weit vom Gleichgewicht entfernt und damit praktisch irreversibel. Dies beruht auf der Regulation der chloroplastidären Malat-Dehydrogenase.
Es wurde bereits in Abschnitt 6.6 beschrieben, dass die chloroplastidäre Malat-Dehydrogenase durch Thioredoxin aktiviert wird und so nur im Licht aktiv ist. Außerdem wird die reduktive Aktivierung des Enzyms durch Thioredoxin durch steigenden NADP+ -Spiegel gehemmt. NADP+ erhöht das Redoxpotenzial der SH-Gruppen in dem regulativen Abschnitt der MalatDehydrogenase, dadurch wird die reduktive Aktivierung des Enzyms durch Thioredoxin gehemmt. Entgegengesetzte Metaboliteffekte für die Aktivierung von Enzymen des reduktiven Pentosephosphatweges wurden bereits in Abschnitt 6.6 diskutiert. Die chloroplastidäre Malat-Dehydrogenase wird so bei einer Erniedrigung des NADP+-Spiegels (gleichbedeutend mit einer Erhöhung des Reduktionsgrades des NADPH/NADP+-Systems) „angeworfen". Dieses Enzym hat dadurch die Funktion eines Überdruckventils, durch das überschüssige Reduktionsäquivalente aus den Chloroplasten „abgeblasen" werden können. So kann eine schädliche Überreduktion der Redoxüberträger der Photosynthesekette vermieden werden. Gleichzeitig können auf diese Weise die peroxisomale Hydroxypyruvatreduktion sowie die Prozesse im Cytosol (z.B. Nitratreduktion) mit Reduktionsäquivalenten versorgt werden.
Chloroplasten können reduzierende Äquivalente auch durch einen Triosephosphat-3-Phosphoglycerat-Shuttle in das Cytosol liefern (Abb. 7.11). Durch diesen Shuttle wird dem cytosolischen Kompartiment mit NADH gleichzeitig auch ATP bereitgestellt.


7.4 Die peroxisomale Matrix ist ein spezielles Kompartiment für die Entsorgung toxischer Produkte
Warum sind an dem Recyclingprozess von 2-Phosphoglycolat neben den Chloroplasten zwei weitere Organellen beteiligt? Die Lokalisation der Umwandlung von Glycin zu Serin in den Mitochondrien erscheint sinnvoll, da so ein Teil des entstehenden NADH über die Atmungskette für die Synthese von ATP genutzt werden kann.
Bei der Umwandlung von Glycolat zu Glycin werden zwei für die Zelle toxische Zwischenprodukte gebildet: Glyoxylat und H2O2 In isolierten Chloroplasten wird durch die Anwesenheit geringer Konzentrationen von H2O2 oder Glyoxylat die Photosynthese vollständig gehemmt. Die toxische Wirkung von H2O2 liegt in der Oxidation der SH-Gruppen in den Thioredoxin-aktivierten Enzymen des reduktiven Pentosephosphatweges. Glyoxylat, eine agressive Carbonylverbindung, die unter anderem mit SH-Gruppen reagiert, hat ebenfalls eine starke Hemmwirkung auf durch Thioredoxin aktivierte Enzyme. Es hemmt aber auch RubisCO. Die Kompartimentierung der Umwandlung des Glycolats in Glycin in den Peroxisomen führt dazu, dass die Zwischenprodukte Glyoxylat und H2O2 bereits am Ort ihrer Entstehung mit so hoher Effizienz umgesetzt werden, dass sie nicht in andere Räume der Zelle entweichen können.
Wie ist eine derartige Kompartimentierung möglich?
Die Kompartimentierung von Stoffwechselprozessen in anderen Zellkompartimenten, wie dem Chloroplastenstroma oder der mitochondrialen Matrix, beruht auf der Funktion von trennenden Membranen, die spezifische Translokatoren für den Transport bestimmter Metabolite besitzen und für Intermediate der dort lokalisierten Stoffwechselketten nicht passierbar sind. Dieses Prinzip lässt sich jedoch auf eine Kompartimentierung der Glycolatoxidation nicht anwenden, da Membranen sowohl für H2O2 als auch für Glyoxylat so permeabel sind, dass ein Entweichen dieser beiden Substanzen aus den Peroxisomen durch eine umgebende Membran nicht verhindert werden könnte.
Die sehr wirksame Kompartimentierung der Reaktion von Glycolat zu Glycin und von Serin zu Glycerat in den Peroxisomen ist auf besondere Eigenschaften der peroxisomalen Matrix zurückzuführen: Während bei Chloroplasten oder Mitochondrien nach einem Aufbrechen der Grenzmembranen (z.B. durch kurzzeitige Suspendierung in Wasser, einem so genannten osmotischen Schock) die Proteine des Stroma oder der Matrix in Lösung gehen, bleibt nach einem Aufbrechen der peroxisomalen Membran der Verbund der peroxisomalen Matrixproteine in Form von Partikeln in der Größe von Peroxisomen erhalten. Die Kompartimentierung der genannten Reaktionen wird nicht beeinflusst. Dass Glyoxylat, H2O2 und Hydroxypyruvat als Intermediate des peroxisomalen Stoffwechsels nicht freigesetzt werden, beruht offenbar auf einem engen Verband der Enzyme in Form eines vernetzten Multienzymkomplexes, wodurch das Produkt einer enzymatischen Reaktion als Substrat für die folgende Reaktion unmittelbar an das nächste Enzym weitergereicht wird.
Dieser mit dem englischen Begriff metabolite channelling bezeichnete Vorgang ist sicher nicht allein auf die peroxisomale Matrix beschränkt. Es wird seit langem diskutiert, dass Stoffwechselabläufe auch in anderen Kompartimenten, wie zum Beispiel der Calvin-Cyclus in den Chloroplasten (Kapitel 6) , ähnlich geordnet ablaufen. Eine Besonderheit bei den Peroxisomen ist jedoch, dass diese spezielle Organisation der Enzyme auch nach dem Aufbrechen der Membran erhalten bleibt. Dies kann eine Schutzfunktion sein, die verhindert, dass nach einer Verletzung der Peroxisomenmembran Glycolat-Oxidase austritt. Als Folge hiervon würde das Glycolat außerhalb der Peroxisomen oxidiert und die Zelle durch eine Anhäufung der Produkte Glyoxylat und H2O2 im Cytosol vergiftet.
Für den Anteil des Glyoxylat und Hydroxypyruvat, der trotz des metabolite channelling aus den Peroxisomen entweicht, gibt es im Cytosol spezielle Entgiftungsenzyme, die unter Verbrauch von NADPH Glyoxylat in Glycolat (NADP-Glyoxylat-Reduktase) und Hydroxypyruvat in Glycerat (NADP-Hydroxypyruvat-Reduktase) umwandeln.

7.5 Wie hoch sind die Kosten der Ribulosebisphosphat-Oxygenase-Reaktion für die Pflanze?
Auf der Grundlage der Stoffwechsel-Schemata in Abbildung 6.20 und Abbildung 7.1 sind in Tabelle 7.1 der Aufwand an ATP und NADPH (bzw. dazu äquivalent zwei reduzierte Ferredoxinmoleküle) für Oxygenierung und Carboxylierung von RuBP durch RubisCO zusammengestellt worden. Die Daten illustrieren, dass der Verbrauch an ATP und NADPH, der erforderlich ist, um die Folgen der Oxygenierung rückgängig zu machen, sehr viel höher ist als der entsprechende Aufwand für die Carboxylierung. Während bei der CO2-Fixierung die Umsetzung von CO2 zu Triosephosphat drei ATP und zwei NADPH erfordert, kostet die Oxygenierung von RuBP pro Molekül O2 insgesamt fünf Moleküle ATP und drei Moleküle NADPH. Berücksichtigt man die in Abschn. 7.2 erwähnte NH3-Refixierung, würde der Energieverbrauch noch erheblich höher sein. Tabelle 7.2 zeigt den Mehraufwand an ATP und NADPH bei verschiedenen Verhältnissen Carboxylierung/Oxygenierung. Da im Blatt die Quotienten Carboxylierung/Oxygenierung zwischen zwei und vier liegen, führt die Oxygenierung gegenüber dem entsprechenden Aufwand der CO2-Fixierung zu einem Mehraufwand an ATP tmd NADPH zwischen 40 und 80 % . Die Nebenreaktion der RubisCO kostet die Pflanze demnach insgesamt mehr als ein Drittel der eingestrahlten Photonen.


7.6 Am Kompensationspunkt findet keine Netto-CO-2-Fixierung statt
Bei einem Verhältnis Carboxylierung/Oxygenierung von 0,5 findet keine Netto-CO2-Fixierung statt, da dann die Menge des durch die Carboxylierung fixierten CO2 der Menge des nach Oxygenierung im Photorespirationsweg freigesetzten CO2 entspricht. Dieser Zustand lässt sich experimentell erzeugen, indem eine Pflanze in einer abgeschlossenen Kammer belichtet wird. Dabei sinkt durch die Photosynthese die CO2-Konzentration ab, bis eine Konzentration erreicht wird, bei der sich CO2-Fixierung und Freisetzung die Waage halten. Man bezeichnet diesen Zustand als Kompensationspunkt. Auch wenn die CO2-Freisetzung nicht nur durch den Photorespirationsweg, sondern auch durch andere Reaktionen, wie den Citratcyclus in den Mitochondrien erfolgen kann, so sind letztere Quellen der CO2-Freisetzung gegenüber dem Photorespirationsweg in belichteten grünen Pflanzenteilen doch vernachlässigbar. Bei den Pflanzen, mit denen wir uns bisher beschäftigt haben, den so genannten C3-Pflanzen (sie heißen so, da das erste Carboxylierungsprodukt die C3-Verbindung 3-Phosphoglycerat ist), beträgt die CO2-Konzentration am Kompensationspunkt je nach Spezies und Temperatur zwischen 35 bis 70 ppm, das sind 10 bis 20 % der Konzentration in der Atmosphäre. In der wässrigen Phase, in der RubisCO vorliegt, bedeutet dies bei 25 °C eine CO2-Konzentration von 1 bis 2 x 10-6 mol/L. Bei den in Abschnitt 8.4 behandelten C4-Pflanzen beträgt die CO2-Konzentration am Kompensationspunkt nur etwa 5 ppm. Der Grund für diesen im Vergleich zu C3-Pflanzen so niedrigen Wert wird in Abschnitt 8.4 eingehend besprochen.
Entzieht man in dem erwähnten geschlossenen System das CO2 durch Bindung an KOH und unterschreitet so den Kompensationspunkt, dann erfolgt im Licht durch die Oxygenierung und den nachfolgenden Photorespirationsweg eine Nettofreisetzung von CO2 auf Kosten der vorhandenen Biomasse, die für die Nachlieferung von Kohlenhydraten zur Regenerierung des Ribulose-1,5-bisphosphats abgebaut wird. Die Pflanze wird so im Licht „ausgezehrt".

7.7 Der energieverbrauchende Photorespirationsweg kann für die Pflanze auch nützlich sein
Wegen des hohen Energiebedarfs der Photorespiration läuft am Kompensationspunkt der Photosynthesestoffwechsel auf hohen Touren, allerdings in bezug auf die CO2-Fixierung im Leerlauf. Eine derartige Situation liegt vor, wenn die Spaltöffnungen Abschnitt 8.1 bei Blättern unter vollem Licht wegen Wassermangel geschlossen sind und dadurch kein CO2 aufgenommen werden kann. In diesem Fall wird der energieverbrauchende Photorespirationsweg von der Pflanze genutzt, um das durch die Lichtreaktion bereitgestellte NADPH und ATP, das durch die CO2Fixierungs- und Regenerierungs-Reaktionen nicht verbraucht werden kann, zu eliminieren und mit NADP und ADP Akzeptoren für den linearen Elektronentransport zu regenerieren. Es wurde bereits besprochen, dass eine Überreduktion und Überenergetisierung des Photosyntheseapparates in der Zelle schwere Schäden verursacht. Wie auch in Abschnitt 13.4 für den Fall von Sauerstoffmangel in Wurzeln beschrieben, ist es daher für die Pflanzenzelle essentiell, überschüssige Reduktionsäquivalente zu eliminieren. Die Photorespiration als zunächst unvermeidliche Nebenreaktion hat so nachträglich eine Schutzfunktion für die Pflanzen erlangt. Es ist daher durchaus denkbar, dass eine Verminderung der Oxygenasereaktion der RubisCO durch gentechnische Methoden (siehe Kapitel 22), wie sie von vielen Wissenschaftlern, wenn auch bislang vergeblich, versucht wird, nicht nur zu einer gewünschten höheren Lichtausnutzung durch die Pflanze führt, sondern zugleich auch deren Empfindlichkeit gegenüber übermäßiger Belichtung oder Wassermangel (siehe folgendes Kapitel) steigert, da somit eine Schutzfunktion aufgehoben wird.nach oben zum Kapitelanfang

8 Photosynthese ist mit Wasserverbrauch verbunden
In diesem Kapitel wird auf gezeigt, dass bei der Photosynthese sehr viel Wasser verbraucht wird und daher das der Pflanze zur Verfügung stehende Wasser häufig begrenzt ist. Es werden außerdem biochemische Mechanismen behandelt, durch die bestimmte Pflanzen an trockenen und heißen Standorten ihren Wasserverbrauch reduzieren können.

8.1 Bei der Aufnahme von CO2 in das Blatt geht Wasser aus dem Blatt in Form von Wasserdampf verloren

Pflanzen benötigen für ihr Wachstum viel Wasser, da die Photosynthese mit einem hohen Wasserbedarf gekoppelt ist. Eine C3-Pflanze (siehe unten) benötigt für die Fixierung von 1 mol CO2 700 bis 1300 mol Wasser. Hierbei spielt der Wasserverbrauch für die photosynthetische Wasserspaltung mengenmäßig keine nennenswerte Rolle, der Wasserbedarf beruht vielmehr darauf, dass Wasser aus den Blättern in Form von Wasserdampf entweicht. Dieser Wasserverlust durch Verdunstung wird durch die Wasseraufnahme der Wurzeln ausgeglichen. Es f1ndet so während der Photosynthese ein ständiger Strom von Wasser aus den Wurzeln durch die Röhren des Xylems in die Blätter statt, den man als Transpirationsstrom bezeichnet.
Um den Wasserverlust durch Verdampfung gering zu halten, ist die Oberfläche der Blätter mit einer gasundurchlässigen Cuticula aus Cutin (Abschn. 18.3) überzogen. Dennoch ist ein Wasserverlust der Blätter während der Photosynthese unvermeidlich, da für die Aufnahme des CO2 in der Blattoberfläche Öffnungen erforderlich sind, die Spaltöffnungen (Stomata), durch die das C02 aus der Atmosphäre in den Gasraum im Inneren des Blattes und von dort weiter in die Mesophyllzellen diffundieren kann (Abb. 8.1). Durch die Stomata entweicht zwangsweise aber auch Wasser aus dem Blatt in Form von Wasserdampf. Da die Wasserdampfkonzentration im Gasraum des Blattes im Gleichgewicht mit dem Zellwasser (31000 ppm, 25 °C) um zwei Größenordnungen höher ist als die Konzentration des CO2 in der Luft (350 ppm), ist bei der Diffusion von CO2 in die Blätter ein Entweichen einer sehr großen Wassermenge unvermeidlich. Um den Wasserverlust des Blattes zu minimieren, ist die Öffnung der Stomata reguliert. Daher haben Pflanzen bei einer Erhöhung der CO2-Konzentration in der Atmosphäre einen geringeren Wasserverlust und damit auch einen geringeren Wasserbedarf.

Die biochemischen Reaktionen, auf denen der Öffnungs- und Schließvorgang der Stomata beruhen, werden im nächsten Abschnitt ausführlich besprochen. Selbst bei genügender Bewässerung der Pflanze sind die Stomata nur so weit geöffnet, wie es für die CO2-Versorgung des Blattes erforderlich ist. Bei Wassermangel werden zum Schutz vor dem Austrocknen die Stomata teilweise oder vollständig geschlossen und so die Photosynthese gedrosselt oder vollständig ausgeschaltet. Dadurch ist Wassermangel sehr oft ein entscheidender Faktor für das Pflanzenwachstum, insbesondere in den wärmeren und trockneren Regionen der Erde. Begrenzte Wasserverfügbarkeit und höhere Temperaturen haben während der Evolution zur Entwicklung von Pflanzen geführt, die einen geringeren Wasserverlust haben. Wie in Abschnitt 6.2 bereits besprochen, entsteht bei der CO2-Fixierung als erstes Produkt 3-Phosphoglycerat, eine Verbindung aus drei Kohlenstoffatomen. Man spricht daher von C3Pflanzen. Wie in Abschnitt 8.4 ausführlich diskutiert wird, gibt es Pflanzen, die das CO2 zunächst in der C4-Verbindung Oxalacetat fixieren (um auf diese alternative Weise Wasser zu sparen). Diese Pflanzen werden als C4Pflanzen bezeichnet.

Stomata regulieren den Gasaustausch in einem Blatt
Die Stomata werden durch zwei Schließzellen, die oft von Nebenzellen umgeben werden, gebildet. Abbildung 8.2 zeigt in einer rasterelektronenmikroskopischen Aufnahme den Spaltöffnungsapparat in geschlossenem (a) und geöffnetem (b) Zustand sowie einen medianen Schnitt durch ein Schließzellenpaar (c). Die Öffnung erfolgt durch eine Erhöhung des osmotischen Drucks in den Schließzellen, worauf Wasser einströmt und sich das Zellvolumen erhöht. Die solchermaßen „aufgeblähten" Zellen führen zur Öffnung des Spaltes (Abb. 8.3).
Der Stoffwechsel der Schließzellen unterscheidet sich sehr stark vom Stoffwechsel der Mesophyllzellen. Für Untersuchungen des Mechanismus des Öffnungsvorganges ist daher eine Isolierung der Schließzellen erforderlich. Da im Verhältnis zu den Mesophyllzellen die Schließzellen sehr klein sind und ihre Isolierung nur zu geringen Ausbeuten führt, sind biochemische und physiologische Untersuchungen an diesem Objekt überaus schwierig. Trotzdem zählen die Schließzellen zu den bestuntersuchten Pflanzenzellen. Die Kenntnisse über den Schließvorgang sind aber in vielen Einzelaspekten noch fragmentarisch, wie im nächsten Abschpitt erläutert wird.

Im Stoffwechsel der Schließzellen spielt Malat eine wichtige Rolle
Der Anstieg des osmotischen Drucks bei der Öffnung der Stomata ist vorrangig auf eine Akkumulation von Kaliumsalzen in den Schließzellen zurückzuführen, entsprechende Anionen sind dabei je nach Spezies vor allem Malat, aber auch Chlorid. Abbildung 8.4 zeigt in schematischer Darstellung die Abläufe beim Öffnungsvorgang mit Malat als hauptsächliches Anion. Durch eine H+-P-ATPase werden Protonen über die Plasmamembran in den extrazellulären Raum gepumpt. Die H+-P-ATPase entspricht dem gleichen Typ wie die Na+/K+-ATPase in tierischen Zellen. Das Transportprotein wird intermediär an einem Aspartylrest durch ATP phosphoryliert. Sie ist dadurch grundverschieden von der F-ATPase und V-ATPase (Abschn. 4.4). Man bezeichnet sie daher als P-Typ-ATPase oder kurz P-ATPase. Die durch die H+-P-ATPase gebildete elektrische Potenzialdifferenz treibt den Einstrom von K+-Ionen über einen Kaliumkanal in die Schließzellen. Dieser Kanal ist nur bei negativen Spannungen geöffnet (siehe Abschn. 1.10) und erlaubt daher nur den Einstrom von K+-Ionen. Man bezeichnet ihn daher auch als K+-Einwärtskanal. Die in die Zelle aufgenommenen K+-Ionen werden größtenteils in die Vakuole transportiert. Nach bisherigen Kenntnissen ist an diesem Vorgang eine vakuoläre H+-ATPase (V-ATPase) beteiligt, durch die Protonen in das Innere der Vakuolen gepumpt werden, die dann gegen K+-Ionen, unter Beteiligung eines Kaliumkanals, ausgetauscht werden. Die V-ATPasen sind entfernt verwandt mit den F-ATPasen (Abschn. 4.4).
Die Akkumulation der Kationen in der Vakuole führt zur Bildung einer Potenzialdifferenz über die Vakuolenmembran, diese treibt den Einstrom von Malat über einen für organische Anionen spezifischen Kanal.

Das erforderliche Malat wird durch den glycolytischen Abbau von Stärke, die in den Chloroplasten gelagert ist, bereitgestellt. Dieser Abbau liefert auf einem hier nicht im Detail behandelten Weg Triosephosphat (Abschn 9.1). Letzteres wird über einen Triosephosphat-Phosphat-Translokator im Gegentausch mit anorganischem Phosphat in das Cytosol freigesetzt und dort in Phosphoenolpyruvat umgewandelt (siehe Abb. 10.11). Durch das Enzym Phospboenolpyruvat-Carboxylase (Abb. 8.5) reagiert Phosphoenolpyruvat mit HC03 zu Oxalacetat. Da bei dieser Reaktion ein sehr energiereicher Enolester gespalten wird, ist die Reaktion irreversibel. Das gebildete Oxalacetat wird über einen spezifischen Translokator in die Chloroplasten transportiert, über die dort anwesende NADP-Malat-Dehydrogenase zu Malat umgesetzt und letzteres in das Cytosol ausgeschleust (Abb. 8.4). Möglicherweise werden Malat und Oxalacetat über den gleichen Translokator befördert.
Beim Schließen der Stomata wird das Malat zum größten Teil aus den Schließzellen freigesetzt. Da Schließzellen sehr geringe Aktivitäten von RubisCO besitzen, tragen sie insgesamt nur gering zur CO2Fixierung bei. Daher wird die Rückbildung der Stärke vor allem durch die Aufnahme von Glucose in die Schließzellen gespeist. Im Gegensatz zu den Chloroplasten aus Mesophyllzellen besitzen Schließzellenchloroplasten einen GlucosephosphatPhosphat-Translokator, der neben Glucose-6-phosphat und Phosphat auchTriosephosphat und 3-Phosphoglycerat transportiert. Diesen Translokator findet man auch in Plastiden nicht-grüner Gewebe, wie zum Beispiel in Wurzeln (siehe Abschn. 13.3).

Die Stomaöffnung unterliegt einer komplexen Regulation
Man kennt eine Reihe von Faktoren, welche die Öffnung der Stomata beeinf1ussen. So wird die Stomaöffnung unter anderem durch die CO2Konzentration im Gasraum und durch Licht über den Blaulicht-Rezeptor Phototropin (Abschn.19.9) reguliert. Abscisinsäure (engl. abscisic acid, ABA) (Abschn.19.6) bewirkt in mikromolaren Konzentrationen ein Schließen der Stomata. Sinkt infolge Wassermangels das Wasserpotenzial unter einen kritischen Punkt, setzt eine verstärkte ABA-Synthese ein. Dabei ist die Wirkung von ABA auf die Stomaöffnung von der interzellulären CO2-Konzentration und der Anwesenheit der Signalsubstanz Stickstoffmonooxid (NO) (Abschn.19.9) abhängig. Die Bindung von ABA an einen Membranrezeptor löst Signalkaskaden aus, an deren Ende die Steuerung von Ionenkanälen liegt. An diesen Signalkaskaden sind cyclische ADP-Ribose (Abb.19.13), Inositoltrisphosphat (Abb.19.4) und Ca++ -Ionen als Botenstoffe beteiligt. Vermittelt durch diese Signalkaskaden bewirkt ABA, dass in den Schließzellen Anionenkanäle aktiviert werden, wodurch es zu einem Ausstrom von Anionen kommt.

Dies führt zu einer Depolarisierung des Plasmalemma und dadurch zur Öffnung der K+-Auswärtskanäle (siehe Abschn. 1.10). NO reguliert diese Ca2+ -sensitiven Ionenkanäle durch eine Erhöhung der cytosolischen Ca2+ -Konzentration über eine Stimulierung der Ca2+ -Freisetzung aus den intrazellulären Speichern. Die dadurch bewirkte Freisetzung der K+-, Malat2- - und Cl+-Ionen aus den Schließzellen führt zu einem Abfall des osmotischen Druckes, damit zu einer Verkleinerung der Schließzellen und so zu einem Schließen des Spaltes. Der Einsatz der Patch-Clamp-Technik (siehe Abschn. 1.10) hat zu revolutionären Erkenntnissen über die Rolle spezifischer Ionenkanäle beim Schließvorgang geführt.
NO kann durch Stickstoffmonooxid-Synthase (Abschn.19.9) oder als Nebenprodukt der Reduktion von Nitrat über die Nitratreduktase (Abschn. 10.1) gebildet werden. In Schließzellen wird die Aktivität der Nitratreduktase durch ABA stimuliert. Offenbar ist das Zusammenspiel von NO und ABA bei der Kontrolle der Stomaöffnung sehr komplex.

8.2 Diffusion von CO2 in eine Pflanzenzelle
Der Weg des CO2 aus der Atmosphäre bis zum katalytischen Zentrum der RubisCO - durch die Stomata, den interzellulären Gasraum, das Plasmalemma, die Chloroplastenhülle und das Stroma - wird durch Diffusion zurückgelegt. Nach einer einfachen Ableitung des Ficksehen Gesetzes gilt für einen Diffusionsfluss I über eine bestimmte Strecke:
I ist als die pro Zeit- und Flächeneinheit diffundierende Substanzmenge definiert. ΔC, der Diffusionsgradient, ist die Differenz der Konzentrationen zwischen Anfangs- und Endpunkt und R der Diffusionswiderstand. Der Diffusionswiderstand R von C02 ist in Wasser 104 mal größer als in Luft. Abbildung 8.6A illustriert an einem Modellbeispiel die Diffusion von C02 in das Blatt einer C3 Pflanze bei limitierender Wasserversorgung. Über die Kontrolle der Stomaöffnung wird ein stomatärer Diffusionswiderstand erzeugt, durch den ein Diffusionsgradient von 100 ppm aufrechterhalten wird. Die daraus resultierende C02-Konzentration von 250 ppm im interzellulären Gasraum steht bei 25°C im Lösungsgleichgewicht mit einer CO2-Konzentration in wässriger Lösung von 8μM. In mit Luft (350 ppm) bei 25°C gesättigtem Wasser beträgt die Konzentration des gelösten C02 11,5 μM.

Da die Chloroplasten unter der Oberfläche der Mesophyllzellen angeordnet sind (siehe Abb. 1.1), ist die Hauptdiffusionsstrecke für das C02 innerhalb der Mesophyllzelle die Durchquerung des chloroplastidären Stroma bis zum Reaktionsort der RubisCO. Das Chloroplastenstroma enthält zur Erleichterung dieser Diffusion hohe Aktivitäten des Enzyms Carboanhydrase. Durch diese wird nach Eintritt des C02 in das Stroma ein Gleichgewicht mit HC03 hergestellt (Abb 8.7). Bei pH 8, und 25°C steht 8 μM C02 im Gleichgewicht mit 400 μM HC03. In Gegenwart von Carboanhydrase besteht demnach für HCO3 ein 50fach höherer Diffusionsgradient als für C02. Auch wenn man berücksichtigt, dass wegen der höheren molaren Masse der Diffusionswiderstand für HC03 um etwa 20 % höher ist als für C02, so ist im Carboanhydrase- Gleichgewicht der Diffusionsfluss für HC03 etwa 40fach höher als für C02.
Durch die Anwesenheit der Carboanhydrase wird so der Konzentrationsabfall bei der für die CO2-Fixierung erforderlichen Diffusion des anorganischen Kohlenstoffs durch das Stroma klein gehalten. Die Diffusion von C02 aus dem interzellulären Gasraum bis zur RubisCO im Stroma führt insgesamt zu einem Konzentrationsabfall von etwa 2 μM. Am Ort der Carboxylierung wurde eine CO2-Konzentration von etwa 6 μM ermittelt. In der wässrigen Phase, die im Gleichgewicht mit Luft steht, liegt eine 02-Konzentration von 250 μM vor. Dies führt zu einem Verhältnis Carboxylierung/Oxygenierung von etwa 2,5.

Kehren wir noch einmal zu Abbildung 8.6 zurück: Da C02 und 02 um die durch RubisCO katalysierte Reaktion mit Ribulose-1,5-bisphosphat konkurrieren, und die CO2-Konzentration in der Atmosphäre im Verhältnis zur O2-Konzentration sehr niedrig ist, führt der Konzentrationsabfall des C0 2 bei der Diffusion von der Atmosphäre zum Ort der CO2-Fixierung zu einer erheblichen Begrenzung der Effizienz der Carboxylierung durch RubisCO. Dies ist auch ein Grund dafür, dass dieses Enzym so hoch konzentriert sein muss, wie in Abschnitt 6.2 besprochen wurde. Natürlich könnte durch eine größere Öffnung der Stomata der stomatäre Diffusionswiderstand beispielsweise halbiert werden, damit bei gleichem Diffusionsfluss auch der Diffusionsgradient halbiert und so die interzelluläre CO2-Konzentration von 250 auf 300 ppm erhöht werden. Damit würde letztlich auch das Verhältnis Carboxylierung/Oxygenierung durch RubisCO erhöht. Der Preis für die Halbierung des stomatären Diffusionswiderstandes wäre jedoch eine Verdopplung des Wasserverlustes. Da der Diffusionsfluss des Wasserdampfes aus den Blättern zum Diffusionsgradienten proportional ist, bildet die Luftfeuchtigkeit für den Wasserverlust einen entscheidenden Faktor. Diese Betrachtungen illustrieren die überaus wichtige Funktion der Stomata für den Gasaustausch der Blätter. Die Regulation der Stomaöffnung bestimmt letztlich, wie hoch die Rate der CO2-Fixierung sein darf, ohne dass die Pflanze dabei zuviel von dem lebenswichtigen Wasser verliert.

8.3 C4-Pflanzen benötigen bei der CO2-Assimilierung weniger Wasser als C4-Pflanzen
Da im Gleichgewicht mit flüssigem Wasser die Dichte des Wasserdampfes mit der Temperatur exponentiell ansteigt - bei einem Übergang von 20°C auf 30°C erfolgt fast eine Verdopplung der Dichte von Wasserdampf - ist das Problem des Wasserverlustes während der Photosynthese bei hohen Temperaturen besonders prekär. C4-Pflanzen haben einen Weg gefunden, den Wasserverbrauch bei der Photosynthese wesentlich zu verringern. Sie benötigen nur 400 bis 600 mol Wasser für die Fixierung von einem mol C02, dies entspricht etwa der Hälfte des entsprechenden Wasserverbrauches von C4-Pflanzen, und dieser Unterschied ist noch größer bei höheren Temperaturen. C4-Pflanzen sind in der Regel in warmen und trockenen Gebieten beheimatet; zu ihnen gehören die wichtigen Kulturpflanzen Mais, Zuckerrohr und Hirse.
Das für einen verminderten Wasserverbrauch verantwortliche Prinzip lässt sich durch einen Vergleich der Modelle einer C3Pflanze und einer C4-Pflanze demonstrieren Abbildung 8.6: Eine Erhöhung des stomatären Diffusionswiderstandes in der C4-Pflanze gegenüber der C3-Pflanze um den Faktor zwei vermindert den Diffusionsfluss des Wasserdampfes aus der C4-Pflanze auf die Hälfte des Flusses aus der C3 Pflanze.
Um bei der Erhöhung des stomatären Diffusionswiderstandes in der C4-Pflanze für C02 den gleichen Diffusionsfluss wie in der C3Pflanze zu erreichen, muss nach dem abgewandelten Ficksehen Gesetz (Abschn. 8.2) im Gegenzug der Diffusionsgradient um den Faktor zwei erhöht sein. Dies bedeutet bei einer CO2Außenkonzentration von 350 ppm eine Innenkonzentration von nur 150 ppm und damit eine CO2-Konzentration in der wässrigen Phase von 5 μM. Bei dieser geringen CO2-Konzentration sind C2-Pflanzen nahe am Kompensationspunkt (Abschn. 7.6), so dass die CO2-Fixierung durch die RubisCO nur sehr gering wäre.
Der entscheidende Punkt für den Ablauf der C4-Photosynthese ist das Vorhandensein einer Pumpe, durch die das C02 von der sehr niedrigen Konzentration von etwa 5 μM durch Überführnng in ein benachbartes Kompartiment auf eine Konzentration von etwa 70 μM angehoben wird. Der Pumpvorgang benötigt natürlich Energie. Dieser Energieaufwand wird allerdings dadurch wieder ausgeglichen, da bei der sehr hohen CO2-Konzentration in der Umgebung der RubisCO die Oxygenasereaktion fast völlig unterdrückt ist. Die bei C3-Pflanzen auftretenden sehr hohen Energieverluste durch den Photorespirationsweg (Abschn. 7.5) werden so in C4-Pflanzen vermieden. Der C4-Stoffwechsel verbraucht also in der Regel nicht mehr Energie als der C3-Stoffwechsel, insbesondere bei höheren Temperaturen ist der C4-Stoffwechsel sogar energetisch günstiger. Ein Grund hierfür ist, dass bei einem Anstieg der Temperatur die Oxygenase-Aktivität der RubisCO relativ stärker ansteigt als die Carboxylase-Aktivität. Somit besteht bei warmen Klima-Bedingungen der Vorteil der C4-Pflanzen gegenüber den C3-Pflanzen sowohl in einem verminderten Wasserbedarf wie auch in einer durch Unterdrückung der Photorespiration bedingten günstigeren Energiebilanz der Photosynthese.
Ein Auslöser für die Entdeckung des CO2-Konzentrierungsmechanismus war ein unverstandener experimenteller Befund. Nachdem Calvin und Benson gezeigt hatten, dass bei der photosynthetischen CO2-Fixierung als erstes Produkt 3-Phosphoglycerat erscheint, untersuchte Hugo Kortschak an einem Zuckerrohr-Forschungsinstitut in Hawaii um 1950 den Einbau von radioaktivem C02 bei der Photosynthese in Zuckerrohr. Das Ergebnis war überraschend: Als erstes COrFixierungsprodukt wurden nicht - wie erwartet - 3-Phosphoglycerat, sondern die C4-Verbindungen Malat und Aspartat identifiziert. Dieses Ergebnis weckte Zweifel an der allgemeinen Gültigkeit des zu dieser Zeit bereits akzeptierten Calvin-Cyclus. Offenbar wagte Kortschak damals nicht, diese Zweifel zu äußern; die Ergebnisse blieben fast zehn Jahre unveröffentlicht. Ohne von diesen Untersuchungen zu wissen, kam Yuri Karpilov in der Sowjetunion, der zu dieser Zeit mit Mais experimentierte, zu sehr ähnlichen Ergebnissen.
Die beiden Forscher Hal Hatch und Rodger Slack in Australien erfuhren von den unverstandenen Ergebnissen und versuchten diese durch systematische Untersuchungen zu erklären. Sie fanden, dass es sich bei dem Einbau von radioaktivem C02 in Malat um einen Prozess handelte, der dem CalvinCyclus vorgeschaltet ist. Sie konnten zeigen, dass diese erste Carboxylierungsreaktion der Bestandteil eines Mechanismus zur CO2-Konzentrierung ist. Dessen Funktion und Bedeutung wurde von den beiden Wissenschaftlern um 1970 aufgeklärt. Der C4-Stoffwechsel (C4-Weg) wird daher auch als Hatch-Slack-Weg bezeichnet.

Die CO2 Pumpe in C4-Pflanzen
Für das Pumpen von C02 von einer niedrigen zu einer hohen Konzentration müssen zwei verschiedene Kompartimente vorhanden sein. Dies wird durch die Blattanatomie der C4-Pflanzen bestätigt. C4-Pflanzen zeigen eine so genannte Kranzanatomie (Abb. 8.8). Die Leitbündel, in denen sich die Siebröhren und die Xylemgefäße befinden, sind kranzartig von einer Scheide von Zellen, den Bündelscheidenzellen umgeben. Diese werden durch Mesophyllzellen umschlossen, die ihrerseits Kontakt mit dem interzellulären Gasraum der Blätter haben. Gustaf Haberlandt hat bereits 1884 in seinem Buch Physiologische Pflanzenanatomie beschrieben, dass unter anderem in Zuckerrohr und Hirse die Assimilationszellen kranzartig angeordnet sind und diskutiert, ob eine noch unbekannte Arbeitsteilung zwischen den Chloroplasten der Bündelscheiden- und jenen der Mesophyllzellen eine Rolle spielt.
Mesophyll- und Bündelscheidenzellen sind durch eine Zellwand getrennt, die oft, aber nicht immer, eine undurchlässige Suberinschicht enthält. Suberin ist ein Polymer phenolischer Substanzen (Abschn. 18.3), in das Wachs eingelagert ist. Die Grenze zwischen Mesophyll- und Bündelscheidenzellen wird durch eine sehr große Anzahl von Plasmodesmen (Abschn. 1.1) unterbrochen.Diese Plasmodesmen ermöglichen einen Diffusionsstrom von Metaboliten zwischen den Mesophyll- und Bündelscheidenzellen.
Der Pumpvorgang beruht nicht auf der spezifischen Funktion eines Membran- Transporters, sondern darauf, dass das C02 nach Umwandlung in HC03 im Cytosol der Mesophyllzellen durch die Reaktion mit Phosphoenolpyruvat zu Oxalacetat vorläufig fixiert wird. Nach Umwandlung des Oxalacetat in Malat diffundiert das Malat in die Bündelscheidenzellen, in denen das C02 wieder freigesetzt wird, um als Substrat der RubisCO zu fungieren. Alternativ kann auch Aspartat als Transportmetabolit dienen (Abb. 8.14). Malat und Aspartat sind stabilere C4-Säuren als Oxalacetat und somit bessere Transportmoleküle.

Abbildung 8.9 zeigt ein Schema dieses Vorgangs. Ursache für die Bildung des CO2-Gradienten bei diesem Pumpvorgang ist letztlich, dass die vorläufige Fixierung von C02 (A) und die Wiederfreisetzung von C02 (B) in den unterschiedlichen Kompartimenten durch unterschiedliche Reaktionen erfolgen, die jeweils irreversibel ablaufen. Ein entscheidendes Kennzeichen von C4-Pflanzen ist die ausschließliche Lokalisation der RubisCO in den Chloroplasten der Bündelscheidenzellen. Die Reaktion von HC03 mit Phosphoenolpyruvat wird durch das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxylase katalysiert. Dieses Enzym wurde bereits beim Stoffwechsel der Schließzellen Abb 8.4 und 8.5 beschrieben. Die Reaktion ist stark exergonisch und damit irreversibel. Durch die hohe Affinität des Enzyms für HC03 werden mikromolekulare Konzentrationen von Hydrogencarbonat mit hoher Effizienz umgesetzt. Die Bildung des Bicarbonats aus C02 wird durch eine im Cytosol der Mesophyllzellen lokalisierte Carboanhydrase katalysiert.

Für die Freisetzung von C02 in den Bündelscheidenzellen werden in verschiedenen C4-Pflanzen unterschiedliche Wege eingeschlagen (Abb. 8.10): Durch das Malat-Enzym wird eine Decarboxylierung des Malats unter gleichzeitiger Oxidation zu Pyruvat katalysiert.
Bei dem NADP-Malat-Enzymtyp erfolgt diese CO2-Freisetzung unter Reduktion von NADP+ in den Bündelscheidenchloroplasten. Bei dem NAD-Malat-Enzymtyp findet die Decarboxylierung des Malats unter Reduktion von NAD in den Mitochondrien statt. Bei dem Phosphoenolpyruvat-Carboxykinasetyp wird im Cytosol der Bündelscheidenzellen Oxalacetat unter ATP-Verbrauch decarboxyliert, dabei entsteht Phosphoenolpyruvat.
Im folgenden sollen Ablauf und Kompartimentierung des Stoffwechsels dieser drei C4-Typen kurz besprochen werden.

C4-Stoffwechsel des NADP-Malat-Enzymtyps
Der C4-Stoffwechsel in Mais, Zuckerrohr und der Mohrenhirse verläuft nach dem NADP-Malat-Enzymtyp. Abbildung 8.11 zeigt den Ablauf und die Lokalisation der einzelnen Schritte. Das bei der Carboxylierung des Phosphoenolpyruvats im Cytosol der Mesophyllzellen gebildete Oxalacetat wird über einen spezifischen Translokator in die Chloroplasten transportiert, dort durch die NADP-Malat-Dehydrogenase zu Malat reduziert und das Malat aus den Chloroplasten wieder exportiert. Eine derartige Reduktion von Oxalacetat in den Chloroplasten wurde bereits bei der Photorespiration (Abschn. 7.3) beschrieben.

Das Malat diffundiert über Plasmodesmen (Abschn. 1.1) in die Bündelscheidenzellen und gelangt durch spezifischen Transport in die Bündelscheidenchloroplasten. Der Diffusionsfluss des Malats zwischen den beiden Zellen erfordert einen Diffusionsgradienten von etwa 2 mM. In den Chloroplasten der Bündelscheidenzellen erfolgt die Freisetzung des CO2 über das NADP-Malat-Enzym. Dieses CO2 wird durch die benachbarte RubisCO zur Carboxylierung von Ribulose-1,5-bisphosphat genutzt.

Pyruvat wird über einen spezifischen Translokator aus den Chloroplasten exportiert, diffundiert über Plasmodesmen in die Mesophyllzellen und wird - wiederum über einen spezifischen Translokator - in die Chloroplasten transportiert. Dort wird durch das Enzym Pyruvat-Phosphat-Dikinase (Abb. 8.12) in einer sehr ungewöhnlichen Reaktion Pyruvat wieder zu Phosphoenolpyruvat umgesetzt. Die Phosphatdikinase katalysiert eine zweifache Phosphorylierung. Das an dieser Reaktion beteiligte ATP überträgt in reversibler Reaktion einen Phosphatrest auf Pyruvat und einen zweiten auf Phosphat, dabei entsteht anorganisches Pyrophosphat. Durch eine im Chloroplastenstroma vorhandene Pyrophosphatase wird das Pyrophosphat gespalten und aus dem Gleichgewicht entfernt, damit wird die Reaktion irreversibel. Dadurch reagiert Pyruvat unter Verbrauch von zwei energiereichen Phosphaten aus dem ATP, das dabei zu AMP umgesetzt wird, irreversibel zu Phosphoenolpyruvat. Das Phosphoenolpyruvat wird durch einen spezifischen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator im Gegentausch mit anorganischem Phosphat aus dem Chloroplasten exportiert.
Warum diffundiert bei dem hohen CO2-Gradienten zwischen den Bündelscheiden- und Mesophyllzellen das CO2 nicht wieder zurück? Da im Chloroplastenstroma der Bündelscheidenzellen, im Gegensatz zum Stroma der Mesophyllzellen, Carboanhydrase (zur Funktion siehe (Abschn. 8.3) nicht vorhanden ist, ist die Diffusion des CO2 durch die Chloroplasten der Bündelscheidenzellen viel langsamer als durch die Chloroplasten der Mesophyllzellen. Zudem beschränkt eine Suberinschicht zwischen den beiden Zelltypen, wenn vorhanden, die CO2-Diffusion auf die Plasmodesmen. Man schätzt, dass je nach Spezies zwischen 10 bis 30% des in die Bündelscheidenchloroplasten beförderten CO2 durch Rückdiffusion verloren gehen.
In Maisblättern unterscheiden sich die Chloroplasten aus Mesophyll- und Bündelscheidenzellen in ihrer Struktur. Während die Chloroplasten aus Mesophyllzellen ausgeprägte Granabezirke aufweisen, enthalten die Bündelscheidenchloroplasten in erster Linie Stromalamellen, es finden sich dort nur wenige Granabezirke. In Abschnitt 3.10 wurde besprochen, dass das Photosystem II in Stromalamellen oft nur wenig aktiv ist. Tatsächlich besitzen Bündelscheidenchloroplasten eine sehr niedrige Photosystem-II-Aktivität. Ihre Funktion besteht in erster Linie in der Bereitstellung von ATP durch cyclische Photophosphorylierung über das Photosystem I. Das für den reduktiven Pentosephosphatweg erforderliche NADPH muss daher durch linearen photosynthetischen Elektronentransport von den Mesophyllchloroplasten bereitgestellt werden. Dies geschieht zum einen durch das bei der oxidativen Decarboxylierung des Malats gebildete NADPH, das ursprünglich in den Mesophyllzellen für die Reduktion des Oxalacetats aufgewandt wurde. Zum anderen wird NADPH zusammen mit ATP durch einen Triosephosphat-3-Phosphoglycerat-Shuttle über Phosphat-Translokatoren in den inneren Hüllmembranen beider Chloroplasten von den Mesophyllchloroplasten in die Bündelscheidenchloroplasten transferiert (Abb. 8.13).


C4-Stoffwechsel des NAD-Malat-Enzymtyps
Den NAD-Malat-Enzymtyp, der in dem Stoffwechselschema von Abbildung 8.14 dargestellt ist, findet man unter anderem in der Rispenhirse. Hier wird das durch Phosphoenolpyruvat-Carboxylase gebildete Oxalacetat im Cytosol über Transaminierung durch Glutamat-Aspartat-Aminotransferase zu Aspartat umgesetzt. Da die Oxalacetatkonzentrationen in der Zelle im Bereich unterhalb von 0,1 mM liegen, kann Oxalacetat keinen Diffusionsgradienten für einen ausreichend hohen Diffusionsfluss in die Bündelscheidenzellen bilden. Wegen der hohen Konzentrationen des Glutamats in der Zelle können durch die Transaminierung hingegen Aspartatkonzentrationen im Bereich von 5 bis 10 mM aufgebaut werden. Dadurch eignet sich Aspartat sehr gut für einen Diffusionsfluss zwischen den Mesophyll- und Bündelscheidenzellen.
Nach Diffusion in die Bündelscheidenzellen gelangt Aspartat über einen Translokator in die Mitochondrien. Katalysiert durch ein dort vorhandenes Isoenzym der Glutamat-Aspartat-Aminotransferase reagiert das Aspartat wieder zu Oxalacetat, das dann von NAD-Malat-Dehydrogenase zu Malat umgesetzt wird. Dieses Malat wird dann durch das NAD-Malat-Enzym der Mitochondrien oxidativ zu Pyruvat decarboxyliert; das bei der Malat-Dehydrogenasereaktion gebildete NAD+ wird so wieder zu NADH reduziert. Das in den Mitochondrien freigesetzte CO2 diffundiert in die sich in sehr enger Nachbarschaft befindlichen Chloroplasten und steht so als Substrat für die RubisCO zur Verfügung. Das Pyruvat verlässt über den Pyruvattranslokator die Mitochondrien und wird in Cytosol durch eine Alanin-Glutamat-Aminotransferase zu Alanin umgesetzt. Da im Gleichgewicht dieser Reaktion die Konzentration von Alanin viel höher ist als die von Pyruvat, erfolgt ein hoher Diffusionsfluss des Alanin in die Mesophyllzellen. Dort wird Alanin durch ein Isoenzym der oben genannten Aminotransferase zu Pyruvat umgesetzt, um nach Eintritt in die Chloroplasten wie beim NADP-Malat-Enzym-Typ durch die Pyruvat-Phosphat-Dikinase zu Phosphoenolpyruvat zu reagieren.
Wie in Abbildung 8.14 gezeigt, wird das NADH, welches bei der Oxidation des Malats durch das NAD-Malat-Enzym in den Mitochondrien anfällt, vollständig verbraucht, um das Oxalacetat zu Malat zu reduzieren. Für den Elektronentransport der Atmungskette und die damit verbundene ATP-Synthese stehen bei diesem Weg keine Reduktionsäquivalente zur Verfügung. Um dennoch eine mitochondriale ATP-Synthese zu ermöglichen, werden bei dem NAD-Malat-Enzymtyp etwa 10 % des durch Phosphoenolpyruvat-Carboxylase gebildeten Oxalacetats wie bei dem NADP-Malat-Enzymtyp Abbildung 8.11 in den Chloroplasten zu Malat reduziert, das dann zu den Mitochondrien in den Bündelscheidenzellen transportiert wird. Das dort durch das Malat-Enzym gebildete NADH kann von der Atmungskette zur Gewinnung von ATP genutzt werden. In gleicher Weise wird auch bei dem im Folgenden behandelten Phosphoenolpyruvat-Carboxykinasetyp die Malatoxidation durch die Mitochondrien zur ATP-Gewinnung eingesetzt, wie im unteren Teil des Stoffwechselschemas von Abbildung 8.15 skizziert ist.


C4-Stoffwechsel des Phosphoenolpyruvat-Carboxykinasetyps
Man findet diesen Typ in einigen schnellwachsenden tropischen Gräsern, die als Futterpflanzen von Bedeutung sind. Abbildung 8.15 zeigt ein Schema des Stoffwechselablaufes. Wie bei dem NAD-Malat-Enzymtyp wird in den Mesophyllzellen zunächst aus Oxalacetat Aspartat gebildet und diffundiert in die Bündelscheidenzellen. Die Rückgewinnung des Oxalacetats erfolgt hier durch eine Aminotransferase im Cytosol. Dort findet auch die Freisetzung des CO2 durch Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase statt. CO2 diffundiert in die Chloroplasten. Das verbleibende Phosphoenolpyruvat diffundiert zurück in die Mesophyllzellen.

Bei diesem C4-Typ liegt der ATP-Verbrauch für die CO2-Pumpe vor allem bei der Carboxykinasereaktion (Abb. 8.10). Auch hier besitzen die Mitochondrien eine hohe Aktivität an NAD-Malat-Enzym. Die Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten für die Atmungskette zur ATP-Synthese erfolgt, wie oben schon für den NAD-Malat-Enzymtyp beschrieben, durch eine Bereitstellung von Malat durch die Mesophyllzellen (Abb. 8.15, unterer Teil). So wird bei dem Phosphoenolpyruvat-Carboxykinasetyp ein Teil des CO2 auch in den Mitochondrien freigesetzt.
Es sei erwähnt, dass für den C4-Stoffwechsel die besprochene Kranzanatomie mit Mesophyll- und Bündelscheidenzellen keine zwingende Voraussetzung ist. In Einzelfällen kann die räumliche Trennung der Vorfixierung des CO2 durch PEP-Carboxylase und der endgültigen Fixierung durch RubisCO auch in anderer Weise erfolgen. Man hat kürzlich in einer Spezies der Chenopodiacae nachgewiesen, dass dort ein C4-Stoffwechsel in einheitlichen, sehr langgestreckten Zellen abläuft, bei denen sich eine Zellschicht mit PEP-Carboxylase am peripheren Ende im Cytoplasma und am proximalen Ende RubisCO-haltige Chloroplasten befinden. Wenngleich dies ein Sonderfall ist, zeigt es doch, wie variabel das C4-System ist.

Enzyme des C4-Stoffwechsels werden durch Licht reguliert
Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (PEP-Carboxylase), das Schlüsselenzym des C4-Stoffwechsels, unterliegt einer strikten Regulation. Im verdunkelten Blatt liegt das Enzym in einer nur wenig aktiven Form vor. Die Affinität dieser Enzymfonn zum Substrat PEP ist sehr gering, und es wirken schon geringe Konzentrationen von Malat hemmend. Dadurch ist das Enzym im Blatt während der Dunkelphase praktisch inaktiv. Bei Belichten des Blattes wird eine Protein-Serin-Kinase aktiviert, durch welche die OH-Gruppe eines Serinrestes in der PEP-Carboxylase mit einem Phosphat verestert wird; die PEP-Carboxylase wird dadurch aktiviert. Durch eine Protein-Serin-Phosphatase wird das Serinphosphat wieder gespalten und damit inaktiviert (vgl. Abb. 9.18A, Abb. 10.9). Das durch Phosphorylierung aktivierte Enzym wird ebenfalls durch Malat gehemmt, allerdings erst durch weit höhere Konzentrationen als das nicht phosphorylierte inaktive Enzym. Durch diese Rückkopplungshemmung durch Malat kann die Geschwindigkeit der irreversiblen Carboxylierung des PEP so justiert werden, dass sich ein bestimmter Malatspiegel in der Mesophyllzelle einstellt. Es ist noch nicht bekannt, durch welches Signal bei Belichten die Aktivität der Protein-Kinase ausgelöst wird.
NADP-Malat-Debydrogenase wird durch Vermittlung von reduziertem Thioredoxin durch Licht reguliert, wie in Abschnitt 6.6 beschrieben.
Pyruvat-Phosphat-Dikinase wird ebenfalls im Licht aktiviert. Dieses Enzym wird durch Phosphorylierung eines Threoninrestes reguliert. Die Phosphorylierung wird durch ein spezielles Regulatorprotein katalysiert, dabei wirkt ADP in ungewöhnlicher Weise als Phosphatdonor. Bei der Pyruvat-Phosphat-Dikinase ist die dephosphorylierte Form aktiv. Es handelt sich also um einen völlig anderen Regulationsmechanismus als bei der Regulation der PEP-Carboxylase. Die Signalkette von der Belichtung zur Dephosphorylierung des Enzyms ist noch nicht bekannt.

Produkte des C4-Stoffwechsels können durch Massenspektrometrie identifiziert werden
Über eine Messung der Verteilung des 12C- und des 13C-Isotops in einem Photosyntheseprodukt lässt sich ermitteln, ob dieses durch C3 oder C4 -Stoffwechsel gebildet wurde. 12C und 13C kommen als natürliche Isotope des Kohlenstoffs in der Atmosphäre zu 98,89 % beziehungsweise 1,11 % vor. Wegen eines Isotopeneffekts reagiert RubisCO mit 12CO2 rascher als mit 13CO2. Bei den Produkten der C3-Photosynthese ist daher das Verhältnis 13C/12C niedriger als in der Atmosphäre. Das 13C/12-Verhältnis kann massenspektrometrisch bestimmt werden und wird als δ-13C-Wert ausgedrückt:
Als Standard benutzt man die Verteilung in einem definierten Kalkstein. Man findet in Produkten der C3 -Photosynthese (δ-13C-Werte um - 28‰. Bei der PEP-Carboxylase ist die Präferenz für 12C gegenüber 13C weniger ausgeprägt. Da in C4-Pflanzen praktisch das gesamte CO2 das einmal durch die PEP-Carboxylase vorfixiert wurde, in den Bündelscheidenchloroplasten mit der RubisCO weiter reagiert, haben Photosyntheseprodukte von C4-Pflanzen einen δ-13C-Werte um - 14‰. Man kann so durch massenspektrometrische Analyse des 13C/12C-Verhältnisses feststellen, ob beispielsweise Saccharose von Zuckerrüben (C3 ) oder Zuckerrohr (C4) gebildet wurde.

Zu den C4-Pflanzen gehören wichtige Agrarpflanzen, aber auch hartnäckige Unkräuter
Beim C4-Stoffwechsel wird zwar ATP verbraucht, um CO2 in den Bündelscheidenzellen zu konzentrieren, dafür werden aber auch die Energieverluste, die bei den C3-Pflanzen durch Photorespiration entstehen, vermieden. Wie bereits in Abschnitt 6.2 besprochen, steigt bei der RubisCO das Verhältnis Oxygenierung zu Carboxylierung mit der Temperatur an. Bei niedrigen Temperaturen und entsprechend niedriger Photorespirationsrate sind C3 -Pflanzen im Vorteil. Daher gibt es in gemäßigten Klimaten fast keine C4-Pflanzen als Wildpflanzen. Der Vorteil der C4-Pflanzen macht sich erst bei Temperaturen oberhalb von 25 °C bemerkbar, bei denen der Energieverbrauch der Photosynthese (gemessen als Quantenbedarf der CO2-Fixierung) bei C4-Pflanzen geringer ist als bei C3-Pflanzen. Grund hierfür ist, dass bei steigender Temperatur das Verhältnis Oxygenierung/Carboxylierung zunimmt und damit auch der Energieverbrauch für die Photorespiration. C4-Pflanzen haben den weiteren Vorteil, dass sie wegen der hohen CO2-Konzentration in den Bündelscheidenchloroplasten mit weniger RubisCO auskommen. Da RubisCO das Hauptprotein der Blätter ist, brauchen C4-Pflanzen weniger Stickstoff zur Bildung des Photosyntheseapparates als C3 -Pflanzen. Daher erreichen viele C4-Pflanzen bei vergleichsweise niedrigerem Stickstoffgehalt in den Blättern höhere Wachstumsraten als C3-Pflanzen. Schließlich benötigen C4-Pflanzen weniger Wasser. Wegen dieser Vorteile eignen sich C4-Pflanzen in wärmeren Klimazonen als Agrarpflanzen - für die Produktion von Erntefrüchten oder als Futterpflanzen. Elf von zwölf der am schnellsten wachsenden Agrarpflanzen sind C4-Pflanzen. Man hat abgeschätzt, dass etwa 20% der terrestrischen Photosynthese durch C4-Pflanzen erfolgt. Ein Nachteil ist jedoch, dass viele C4 -Agrarpflanzen - darunter Mais, Hirse und Zuckerrohr - kälteempfindlich sind und daher in weiten Teilen der Erde nicht angebaut werden können. Man findet aber unter den C4-Pflanzen auch besonders hartnäckige Unkräuter. Von den zehn weltweit am schlimmsten eingestuften Unkräutern sind acht C4-Pflanzen (z.B. Bermudagras (Cynodon dactylon), Barnyardgrass (Echinochloa crus-galli).

8.4 Durch den Crassulaceensäure-Stoffwechsel können viele Pflanzen auch noch bei sehr großem Wassermangel überleben
Viele Pflanzen, die an sehr trockenen und oft heißen Standorten beheimatet sind, haben eine Strategie entwickelt, um bei sehr großem Wassermangel nicht nur zu überdauern, sondern auch Photosynthese zu betreiben. Zu diesen Pflanzen gehören beispielsweise die dickblättrigen Crassulaceen, wie die Zimmerpflanze Kalanchoe oder die in den Alpen beheimatete Hauswurz, alle Kakteen, aber auch Pflanzen, die als Epiphyten in tropischen Regenwäldern wachsen, darunter die Hälfte der Orchideen. Diese Pflanzen lösen das Problem des Wasserverlustes bei der Photosynthese dadurch, dass sie ihre Stomata nur nachts öffnen, wenn es kühl und die Luftfeuchtigkeit hoch ist. Das zu nächtlicher Zeit aufgenommene CO2 wird vorfixiert und das Fixierungsprodukt in Form einer Säure bis zum folgenden Tag deponiert. Durch Wiederfreisetzung des CO2 kann dann tagsüber der Calvin-Cyclus bei geschlossenen Stomata mit CO2 gespeist werden. Abbildung 8.16 zeigt ein grobes Schema dieses Prozesses. Man beachte die sehr große Ähnlichkeit dieses Reaktionsschemas mit dem Grundschema des C4 -Stoffwechsels in Abbildung 8.9.
Da der genannte Stoffwechsel im Detail zuerst in Crassu1aceen (Dickblattgewächsen) aufgeklärt wurde und mit der Speicherung einer Säure verbunden ist, hat man ihn als Crassulaceensäure-Stoffwechsel (engl. crassulace an acid metabolism, abgekürzt CAM) benannt. Häufig spricht man auch von CAM-Pflanzen. Vom Menschen genutzte CAM-Pflanzen sind Ananasund die Sisalagave zur Gewinnung von Fasern (Sisal-Teppiche).

Erste Beobachtungen von Phänomenen des CAM-Stoffwechsels liegen sehr weit zurück. Im Jahre 1804 beobachtete der französische Naturforscher de Saussure, dass Zweige der Kaktee Opuntia auch in Abwesenheit von CO2 beim Belichten Sauerstoff produzierten. Er schloss daraus, dass die Pflanze durch Verbrauch eigener Substanzen CO2 entwickeln kann, das dann in der CO2-Assimilation genutzt wird. Der Engländer Benjamin Heyne bemerkte in seinem Garten in Indien, dass die Blätter der dort beliebten Zierpflanze Bryophyllum calycinum nachmittags einen Kräutergeschmack hatten, zu Beginn des Tages jedoch scheußlich sauer schmeckten. Er fand diese Beobachtung so bemerkenswert, dass er sie nach seiner Rückkehr nach England 1813 der Linnean Society mitteilte.

Das während der Nacht fixierte CO2 wird als Äpfelsäure gespeichert
Die nächtliche Vorfixierung des CO2 an PEP erfolgt durch Phosphoenolpyruvat- Carboxylase in prinzipiell gleicher Weise wie beim C4-Stoffwechsel und auch beim Stoffwechsel der Schließzellen. In vielen CAM-Pflanzen ist die Ausgangssubstanz für die Bereitstellung des Phosphoenolpyruvats Stärke, die in den Chloroplasten vorhanden ist. Aber auch lösliche Zucker, wie Saccharose (Abschn. 9.2) und Fructane (Abschn. 9.5), können in manchen CAMPflanzen als Kohlenstoffspeicher für die Bildung von PEP dienen. Abbildung 8.17 zeigt ein Schema des CAM-Stoffwechsels mit Stärke als Kohlenstoffreserve. Die Stärke wird in den Chloroplasten bis zu Triosephosphat abgebaut (siehe Abschn. 9.1). Letzteres wird aus den Chloroplasten über den Triosephosphat-Phosphat-Translokator (siehe Abschn. 1.8) exportiert und im Cytosol zu Phosphoenolpyruvat umgesetzt.

Das bei der Fixierung des CO2 gebildete Oxalacetat wird durch eine cytosolische NAD-Malat-Dehydrogenase zu Malat reduziert. Das hierfür erforderliche NADH fällt bei der Oxidation des Triosephosphats an. Das Malat wird unter Verbrauch von Energie in die Vakuolen gepumpt. Wie schon für den Stoffwechsel der Schließzellen besprochen (Abschn. 8.2), besteht der energieverbrauchende Schritt im Transport von Protonen durch die H+-V-ATPase der Vakuolenmembran. Im Gegensatz zu den Schließzellen erfolgt jedoch kein Austausch der importierten Protonen gegen Kalium-Ionen; das durch das Protonenpotenzial über einen Malatkanal aufgenommene Malat wird in den Vakuolen als Äpfelsäure, der protonierten Form von Malat, gespeichert. Dadurch wird der Vakuoleninhalt nachts sehr azide (etwa pH 3,0). Bei der Äpfelsäure hat die Carboxygruppe in Position 1 einen pK-Wert von 3,4 und die in Position 4 einen pK-Wert von 5,1. Bei pH 3 ist daher die Apfelsäure weitgehend undissoziiert. Bei einer Speicherung von Äpfelsäure wird nur etwa ein Drittel des osmotischen Druckes erzeugt, der bei der Speicherung von Kaliummalat (2 K+ + Malat2-) in den Schließzellen entsteht. In anderen Worten: Bei einem bestimmten osmotischen Druck kann in Form von Äpfelsäure fast dreimal soviel Malat gespeichert werden als in Form von Kaliummalat. Um eine hohe Speicherkapazität zu erzielen, sind in den meisten CAM-Pflanzen die Vakuolen ungewöhnlich groß, dies führt zur Succulenz, der Ausbildung dicker, fleischiger Blätter und Stängel, wie sie beispielsweise bei Kakteen zu beobachten ist. Das für den Stoffwechsel erforderliche ATP wird durch die Veratmung von Malat durch die Mitochondrien bereitgestellt.

Die Photosynthese erfolgt bei geschlossenen Stomata
Das in der Nacht gespeicherte Malat wird während des Tages aus der Vakuole durch einen regulierten Ausfluss über den Malatkanal wieder entlassen. Ebenso wie bei den Schließzellenvakuolen, so ist auch hier der Mechanismus des regulierten Ausflusses noch nicht verstanden. Analog zum CC4-Stoffwechse1 erfolgt auch beim CAM-Stoffwechsel die Freisetzung des CO2 in verschiedenen Pflanzen auf unterschiedliche Weise, entweder über NADP-Malat-Enzym, NAD-Malat-Enzym, oder auch über die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase.
In Abbildung 8.18 wird dieser Stoffwechselablauf für den NADP-Malat-Enzymtyp beschrieben. Das Malat wird durch einen spezifischen Translokator in die Chloroplasten aufgenommen und dort unter Bildung von NADPH decarboxyliert; das CO2 dient als Substrat der RubisCO. Das verbleibende Pyruvat wird durch Pyruvat-Phosphatdikinase zu Phosphoenolpyruvat umgesetzt (siehe Abbildungen 8.11, 8.12, 8.14, 8.15). Da in der Regel Plastiden Phosphoenolpyruvat nicht zu 3-Phosphoglycerat umsetzen können (bei CAM-Chloroplasten ist dies bislang nicht untersucht), ist in dem Schema von Abbildung 8.18 ein Export von Phosphoenolpyruvat und ein Import von 3-Phosphoglycerat eingezeichnet. CAM-Chloroplasten enthalten einen Phosphoenolpyruvat- Phosphat-Translokator, der Phosphoenolpyruvat im Gegentausch mit anorganischem Phosphat transportiert. Das ebenfalls im Gegentausch mit Phosphat importierte 3-Phosphoglycerat wird in den Calvin- Cyclus eingespeist. Das gebildete Triosephosphat dient vorrangig der Auffüllung der in der Nacht verbrauchten Stärke, es entsteht nur ein geringer Überschuss, der den eigentlichen Gewinn der CAM-Photosynthese darstellt.
Da die Photosynthese bei geschlossenen Stomata stattfindet, ist der Wasserverlust beim CAM-Stoffwechsel sehr gering. Der Wasserbedarf der CO2-Assimilation (vgl. Abb. 8.6) beträgt bei der CAM-Photosynthese nur 5 bis 10 % des entsprechenden Betrages bei der Photosynthese von C3 -Pflanzen. Dafür ist nicht zuletzt wegen der eingeschränkten Speichermöglichkeit für Malat der tägliche Zuwachs an Biomasse bei den CAM-Pflanzen sehr niedrig. Daher wachsen bei CAM-Stoff wechsel Pflanzen nur sehr langsam.
Nicht selten dient der CAM-Stoffwechsel jedoch als Strategie, um ausgedehnte Trockenperioden zu überleben. Es gibt Pflanzen - dazu gehört die „Mittagsblume" Mesembryanthemum -, die bei Verfügbarkeit von Wasser normale C3-Photosynthese durchführen und erst bei Einsetzen von Trockenheit oder Salzstress durch Enzyminduktion auf den CAM-Stoffwechsel umschalten. Es lässt sich durch massenspektrometrische Analyse des 13/12C-Verhältnisses (Abschn. 8.4) nachweisen, ob eine fakultative CAM-Pflanze einen C3 oder CAM-Stoffwechsel betreibt. Kakteen in Wüstenregionen können für lange Zeit überleben, ohne die Stomata selbst in der Nacht zu öffnen, indem das durch Atmung freigesetzte CO2 durch CAM-Stoffwechsel wieder der Photosynthese zugeführt wird.

C4- wie auch CAM-Pflanzen findet man in vielen verwandtschaftlich weit voneinander entfernten Familien mono- und dikotyler Pflanzen. Daraus geht hervor, dass sowohl der C4 - als auch der CAM-Stoffwechsel sich im Verlaufe der Evolution oftmals unabhängig voneinander aus C3 -Vorläufern entwickelt haben, in denen die Strukturelemente und die Enzyme von C4- und CAM-Pflanzen vorhanden sind (zum Beispiel, wie wir gesehen haben, in den Schließzellen der Stomata).nach oben zum Kapitelanfang

9 Polysaccharide sind Speicher- und Transportform der bei der Photosynthese gebildeten Kohlenhydrate
In höheren Pflanzen werden über die Photosynthese in den Blättern auch die anderen verschiedenartigen heterotrophen Pflanzengewebe versorgt, beispielsweise die Wurzeln. Die von den Blättern angelieferten Substrate werden in den Wurzelzellen durch die vielen dort vorhandenen Mitochondrien unter Gewinnung von ATP oxidiert. Dieses ATP ist unter anderem erforderlich, um die Ionenpumpen der Wurzeln zu betreiben, durch die Mineralien von der Umgebung aufgenommen werden. Daher ist der durch die Blätter versorgte Atmungsstoffwechsel der Wurzeln für die Pflanze von ausschlaggebender Bedeutung. Eine Pflanze stirbt, wenn - beispielsweise durch übermäßige Nässe des Bodens - die Wurzeln nicht mehr ausreichend belüftet werden, und sie so nicht mehr genug Sauerstoff für die Wurzelatmung zur Verfügung haben.
Für die Versorgung der verschiedenen Pflanzenteile durch die Siebröhren dienen zumeist das Disaccharid Saccharose, in manchen Pflanzen aber auch höhermolekulare lösliche Oligosaccharide (z.B. Tri- und Tetrasaccharide) als Transportform für Substrate. Da Kohlenhydrate bei der Photosynthese nur im Licht gebildet werden, müssen sie gespeichert werden, damit die Energieversorgung auch in der Nacht oder bei schlechten Witterungsbedingungen gewährleistet ist. Zudem muss eine Pflanze Kohlenhydratspeicher für die Überbrückung von Winter- oder Trockenperioden oder als Depot in Samen für das Wachstum der folgenden Generation anlegen. Zu diesem Zweck werden Kohlenhydratesowohl als niedermolekulare Oligosaccharide als auch in Form von hochmolekularen Polysacchariden, insbesondere als Stärke und Fructane gespeichert.

In vielen Pflanzen sind Stärke und Saccharose die Hauptprodukte der CO2-Assimilation
In den meisten Kulturpflanzen, zum Beispiel den verschiedenen Getreiden, der Kartoffel, Zuckerrübe und Raps, erfolgt die Speicherung der Kohlenhydrate im Blatt als Stärke und der Export in andere Pflanzenteile, beispielsweise die Wurzel, in Form von Saccharose. Das in den Chloroplasten als Produkt der CO2-Assimilation gebildete Triosephosphat wird über den in Abschnitt 9.1 besprochenen Triosephosphat-Phosphat-Translokator im Gegentausch mit Phosphat in das Cytosol transportiert und dort zu Saccharose umgesetzt (Abb. 9.1). Dabei wird anorganisches Phosphat frei, das wieder in die Chloroplasten über den Triose-P-P-Translokator zurücktransportiert wird. Dieser Rücktransport ist essentiell, bei einem Phosphatmangel würde die Photosynthese zum Stillstand kommen.

Ein Teil des durch die Photosynthese gebildeten Triosephosphats wird in den Chloroplasten als Stärke deponiert, diese dient hauptsächlich als Reserve für die folgende Nachtperiode.

9.1 In Form von Stärke können in der Zelle sehr große Kohlenhydratmengen gespeichert werden
Glucose ist eine relativ unbeständige Verbindung, da ihre Aldehydgruppe spontan zu einer Carboxygruppe oxidiert werden kann. Daher ist Glucose als Speicherform der Kohlenhydrate wenig geeignet. Dazu kommt, dass in einer Zelle die Speicherung von Monosacchariden aus osmotischen Gründen stark begrenzt wäre. Durch Polymerisation zu der osmotisch unwirksamen Stärke können in einer Zelle hingegen sehr große Mengen von Glucosemolekülen gelagert werden, ohne dass sich dabei der osmotische Druck des Zellsaftes ändert. Dies soll durch ein Beispiel illustriert werden: In Kartoffelblättern kann man am Ende des Tages einen Stärkegehalt von 10-4 mol Glucoseeinheiten pro mg Chlorophyll beobachten. Wenn diese Glucosemenge sich als freie Glucose über die Mesophyllzelle verteilen würde, ergäbe dies eine Glucosekonzentration von 0,25 M. Dies würde einen mehr als 50 %igen Anstieg des osmotischen Druckes des Zellsaftes bewirken.
In der Stärke sind die Glucosemoleküle in erster Linie durch (α1➨4)-glycosidische Bindungen verknüpft (Abb. 9.2). Durch diese Verknüpfungen sind die Aldehydgruppen der Glucosemoleküle gegen Oxidation geschützt, lediglich die erste, in Abbildung 9.2 rot markierte Glucose ist ungeschützt. Es wer-

den lange Glucoseketten gebildet, die durch (α1➨6)-glycosidische Bindungen verzweigt sein können. Durch die Verzweigungen erhält ein Stärkemolekül viele endständige Gruppen, an denen das Stärkemolekül durch Bindung weiterer Glucosereste vergrößert werden kann.
Die Bildung von Stärke ist in der Pflanze im Wesentlichen auf Plastiden (Abschn. 1.3) beschränkt: Chloroplasten in Blättern und grünen Früchten und Leukoplasten in heterotrophen Geweben. Die Stärke wird in den Plastiden in Form von Stärkekörnern (Stärkegranula) gelagert (Abb. 9.3). In den Chloroplasten eines Blattes sind die Stärkegranula am Ende eines Tages sehr groß und werden im Laufe der Nacht dann weitgehend abgebaut. Man spricht hier

von transitorischer Stärke. Hingegen wird die Stärke in Speicherorganen, wie Samen oder Knollen, auf längere Dauer angelegt, man bezeichnet diese Stärke als Depotstärke. Die Granula der Depotstärke sind größer als die der transitorischen Stärke. In Getreidekörnern bildet Depotstärke oft 65 bis 75 % und in Kartoffelknollen sogar 80 % des Trockengewichts. Es gibt aber auch kleinere α-Glucane im Cytosol. Wie in einem weiteren Abschnitt dieses Kapitels behandelt, haben die cytosolischen α-Glucane eine Funktion bei der Verstoffwechselungder beim Stärkeabbau entstehenden Maltose.
Stärkegranula bestehen hauptsächlich aus Amylopectin und Amylose. (Tab. 9.1). Zudem enthalten Stärkegranula Enzyme für die Synthese und den Abbau der Stärke. Diese Enzyme liegen in mehreren Isoformen vor, von denen manche an die Stärkegranula gebunden und andere löslich sind. Die Amylose besteht weitgehend aus unverzweigten Ketten von etwa 1000 Glucosemolekülen. Amylopectin ist mit 104 bis 105 Glucosemolekülen wesentlich größer als Amylose, es besitzt alle 20 bis 25 Glucosereste eine Verzweigung Abb. 9.4 und 9.5. Neuere Ergebnisse der Röntgenstrukturanalyse (Abschn. 3.3) zeigen, dass ein Stärkegranulum aus konzentrischen Schichten aufgebaut ist. Die Amylopektinmoleküle sind radial angeordnet (Abb. 9.5). Die reduzierende Glucose (in Abbildungen 9.2 und Abb. 9.4 rot markiert) ist nach innen gerichtet und die Enden der Verzweigungen (schwarz markiert) nach außen. Die Einführung der Amylose in diese Strukturen ist weitgehend unbekannt.
Ein Stärkegranulum enthält normalerweise 20 bis 30 % Amylose und 70 bis 80 % Amylopectin. Einen Amyloseanteil von bis zu 80 % haben runzlige Erbsen, die Gregor Mendel bei seinen klassischen Züchtungsversuchen verwendete. Es gibt Mutanten von Mais (so genannte waxy-Mutanten), bei denen die Stärkegranula fast nur aus Amylopectin bestehen. Andererseits hat man Amylomais gezüchtet, dessen Stärke zu 50 % aus Amylose besteht. Es ist gelungen, durch gentechnische Methoden transgene Kartoffelpflanzen zu erzeugen, die in ihren Knollen nur noch Amylopectin enthalten. Ein einheitlicher Stärkegehalt ist für die Verwendung der Stärke als vielseitiger Rohstoff in der chemischen Industrie von Bedeutung.
Amylose und Amylopectin bilden mit Jod-Molekülen blau bis violett gefärbte Einschlussverbindungen (Tabelle 9.1). Dadurch lässt sich in einem Blatt Stärke durch einen einfachen Jodtest sehr leicht nachweisen.


Die Synthese von Stärke verläuft über ADP-Glucose
Ausgangsprodukt für die Stärkesynthese in Chloroplasten ist Fructose-6- phosphat, ein Intermediat des Calvin-Cyclus (Abb. 9.6). Durch die Hexosephosphat-Isomerase wird Fructose-6-phosphat zu Glucose-6-phosphat isomerisiert, bei dieser Reaktion entsteht als Zwischenprodukt am Enzym ein cis-Endiol. Phosphoglucomutase überträgt den Phosphatrest der Glucose von der 6-Position in die 1-Position. Ein entscheidender Schritt für die Stärkesynthese ist die Aktivierung des Glucose-1-phosphats durch die Reaktion mit ATP zu ADP-Glucose unter Freisetzung von Pyrophosphat. Diese durch das Enzym ADP-Glucose-Pyrophosphorylase katalysierte Reaktion Abb. 9.7 ist


reversibel. Eine hohe Aktivität der Pyrophosphatase im Chloroplastenstroma sorgt jedoch dafür, dass das gebildete Pyrophosphat sofort zu Phosphat hydrolysiert wird. Es wird so dem Gleichgewicht entzogen, dadurch wird die Bildung von ADP-Glucose zu einem irreversiblen Schritt und ist damit für eine Regulation besonders geeignet. Der amerikanische Biochemiker Jack Preiss, der sich eingehend mit der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase befasst hat, entdeckte, dass diese durch 3-Phosphoglycerat allosterisch aktiviert und durch Phosphat gehemmt wird. Die Bedeutung dieser Regulation soll uns am Schluss dieses Abschnittes beschäftigen. Von der ADP-Glucose wird der Glucoserest durch Stärke-Synthasen auf die OH-Gruppe in 4-Position des endständigen Glucosemoleküls der wachsenden Polysaccharidkette übertragen Abb. 9.7. Die Ablage von Glucoseresten in einem Stärkekom erfolgt durch ein Zusammenspiel mehrerer Stärke-Synthase-Isoenzyme. So sind an der Synthese von Amylopectin mindestens 3 Isoenzyme beteiligt, und ein weiteres an der Synthese von Amylose.
Verzweigungen werden durch ein Verzweigungsenzym (engl. branching enzyme) hergestellt. Bei bestimmten Kettenlängen wird die Polysaccharidkette durch Bruch der (α1➨4)-Verknüpfung gespalten (Abb. 9.8) und der abgespaltene Kettenrest mit einer benachbarten Kette über eine (α1➨6)-Verknüpfung verbunden. Durch Stärke-Synthase findet eine weitere Verlängerung der Ketten statt, bis eine neue Verzweigung gebildet wird. Es werden aber auch während der Stärkesynthese durch das im nachfolgenden Abschnitt besprochene Entzweigungsenzym Verzweigungen wieder gelöst. Man nimmt an, dass der Verzweigungsgrad der Stärke auch durch die Aktivitäten von Verzweigungs- und Entzweigungsenzym bestimmt wird. Die bereits erwähnten runzligen Erbsen mit einem hohen Amyloseanteil sind auf eine verminderte Aktivität des Verzweigungsenzyms in diesen Pflanzen (und damit einen insgesamt verminderten Stärkegehalt) zurückzuführen.


Der Abbau von Stärke erfolgt auf zwei verschiedenen Wegen
Der Abbau der Stärke erfolgt in zwei grundsätzlich verschiedenen Reaktionen (Abb. 9.9). Amylasen katalysieren eine hydrolytische Spaltung (α1➨4)-glycosidischer Bindungen. Es gibt verschiedene Amylasen, die jeweils an unterschiedlichen Stellen der Stärkemoleküle angreifen (Abb. 9.10). Die Exoamylasen

spalten vom Ende her. Eine wichtige Exoamylase ist die ß-Amylase, die sukzessive jeweils zwei Glucosereste in Form des Dissaccharids ß-Maltose (Abb. 9.11) abspaltet (die OH-Gruppe in 1-Position befindet sich in der ß-Konfiguration). Amylasen, die im Innern der Stärkeketten spalten (Endoamylasen), führen zu Spaltprodukten, bei denen die OH-Gruppe in 1-Position in a-Stellung vorhanden ist, sie werden entsprechend als α-Amylasen bezeichnet. Durch Entzweigungsenzyme (engl. debranching enzymes) werden die (α1➨6)-Verknüpfungen der Verzweigungsstellen hydrolytisch gespalten.
Phosphorylasen (Abb. 9.9) sind Enzyme, die vom Ende her (α1➨4)-Verknüpfungen unter Bildung von Glucose-1-phosphat phosphorolytisch spalten. Da hierbei die Energie der glycosidischen Bindung genutzt wird, um einen Phosphatester zu bilden, wird so für die Speicherung eines Glucoserestes als Stärke nur 1 Molekül ATP verbraucht, während bei der Stärkehydrolyse durch Amylasen der ATP-Bedarf verdoppelt ist. Neuere Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass der Abbau der transitorischen Stärke in erster Linie durch ß-Amylasen erfolgt.
Plastiden enthalten eine α-Glucan-Wasser-Dikinase durch welche Glucosereste der Stärke selektiv in der 6-Position durch ATP phosphoryliert werden. Die Phosphorylierung erfolgt nach dem Typ einer Dikinase-Reaktion (siehe auch Abb. 8.12) in welcher drei Substrate, ein α-Polyglucan, ATP und H2O in drei Produkte α-Polyglucan-P, AMP und Phosphat überführt werden.

Durch eine α-Glucanphosphat-Wasser-Dikinase wird die an C6 posphorylierte Stärke weiter in der 3-Position phosphoryliert. Diese Phosphorylierung der Stärke erfolgt schon bei der Synthese der Stärke und ist aber für den Abbau der Stärke essentiell. Arabidopsis-Mutanten bei denen die α-Glucan-Wasser-Dikinase ausgeschaltet war, zeigten eine starke Störung des Stärkeabbaues.


Durch die Stärkesynthese können in den Chloroplasten überschüssige Photosyntheseprodukte zwischengelagert werden
Abbildung 9.12 gibt einen Überblick über den Aufbau und den Abbau der transitorischen Stärke in Chloroplasten. Die bereits erwähnte Regulation der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase durch 3-Phosphoglycerat (3-PGA) und Phosphat (P) ermöglicht eine Steuerung des Kohlenhydratflusses in die Stärke. Bestimmend für die Aktivität des Enzyms ist der Konzentrationsquotient 3-PGA/P.3-PGA ist ein Hauptmetabolit im Chloroplastenstroma, seine Konzentration ist aufgrund der Gleichgewichtslage der Phosphoglycerat-Kinase und der Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenasereaktion (Abschn. 6.3) viel höher als die des Triosephosphats. Da die Gesamtmenge an Phosphat und den phosphorylierten Intermediaten des Calvin-Cyclus im Chloroplastenstroma durch den Phosphat-Translokator (Abschn. 9.1) annähernd konstant gehalten wird, führt ein Abfall des Phosphats zu einem Anstieg der 3-PGA. Der PGNP-Quotient ist daher ein sehr empfindlicher Indikator für den Metabolitenstatus im Chloroplastenstroma. Wenn durch eine verminderte Saccharosesynthese Phosphat nicht schnell genug wieder freigesetzt wird und durch Phosphatmangel die Photosynthese limitiert wird, bewirkt der erhöhte PGA/P-Quotient einen Anstieg der Stärkebildung, damit so vermehrt Phosphat freigesetzt wird, um die Photosynthese in Gang zu halten. In dieser Hinsicht übernimmt die Stärke eine Pufferfunktion: Die nicht für die Synthese von Saccharose oder anderer Substanzen abgenommenen Assimilate werden in Form von transitorischer Stärke in den Chloroplasten zwischengelagert.
Zu Beginn der Dunkelheit wird auf bislang nicht geklärte Weise die vorhandene Menge an transitorischer Stärke gemessen. Die circadiane Uhr beeinflusst, wie schnell die Stärke abgebaut wird, so dass die Vorräte bis zur nächsten Morgendämmerung ausreichen. Wahrscheinlich wird der Abbau durch einen Anstieg der Phosphatkonzentration im Stroma stimuliert, der Mechanismus hierfür ist jedoch noch unklar. Ein Anstieg der stromalen Phosphatkonzentration ist ein Zeichen für Substratmangel. Der hydrolytische Abbau der Stärke führt zur Freisetzung von Maltose und Glucose, die durch spezifische Translokatoren Abbildung 9.12 in das Cytosol transportiert werden. Die Maltose, oft Hauptprodukt des Stärkeabbaus, wird im Cytosol über eine Transglucosidase abgebaut. Diese überträgt ein Glucose-Molekül der Maltose auf ein im Cytosol befindliches α-Glucan, unter Freisetzung des anderen Glucose-Moleküls. Das cytosolische α-Glucan wird dann durch eine cytosolische Phosphorylase abgebaut. Die Glucose wird im Cytosol über eine Hexokinase durch ATP in Glucose-6-phosphat überführt. Das beim phosphorolytischen Abbau in Chloroplasten entstehende Glucose-1-phosphat wird in Umkehr des Stärkesyntheseweges zu Fructose-6-phosphat umgesetzt, und letzteres reagiert mittels einer Fructose-6-phosphat-Kinase zu Fructose-1 ,6-bisphosphat. Das durch die Aldolase gebildete Triosephosphat wird durch den Triosephosphat-Phosphat-Translokator exportiert. Ein Teil des Triosephosphats wird zu 3-Phosphoglycerat oxidiert und in dieser Form ebenfalls über den Triose-P-p-Translokator abtransportiert. Dadruch sind sowohl der Triosephosphat-Phosphat-Translokator als auch der Glucose-Translokator für den Abbau der transitorischen Stärke in den Chloroplasten von Bedeutung.

9.2 Die Saccharose wird im Cytosol synthetisiert
Die Synthese von Saccharose, einem Disaccharid aus Glucose und Fructose (Abb. 9.13), findet im Cytosol der Mesophyllzellen statt. Für diese Synthese wird der Glucoserest in analoger Weise wie bei der Stärkesynthese als Nukleosiddiphosphatglucose aktiviert, jedoch im Cytosol über eine UDP-Glucose-Pyrophosphorylase:

Das bei der Reaktion frei werdende Pyrophosphat wird durch die H+-Pyrophosphatase in der Vakuolenmembran rasch abgebaut. Die im Pyrophosphat enthaltene Energie wird somit zur Ansäuerung der Vakuole verwendet. Die Entfernung des Pyrophosphats verschiebt das Gleichgewicht der UDP-Glucose-Pyrophosphorylase-Reaktion stark in Richtung der Synthese von UDP-Glucose. Die Saccharosephosphat-Synthase (abgekürzt SPS, Abb. 9.13) katalysiert die Übertragung des Glucoserestes aus UDP-Glucose auf Fructose-6-phosphat, es entsteht Saccharose-6-phosphat. Durch die Saccharosephosphat-Phosphatase, die zusammen mit der SPS als Enzymkomplex vorliegt, wird Saccharose-6-phosphat hydrolysiert und durch diesen irreversiblen Schritt dem Gleichgewicht der Saccharosephosphat-Synthasereaktion entzogen. Die Bildung der Saccharose ist dadurch ein irreversibler Prozess.

Neben der Saccharosephosphat-Synthase gibt es in Pflanzen auch eine Saccharose-Synthase: Diese Reaktion ist reversibel und wird aber im Stoffwechsel nicht zur Saccharosesynthese eingesetzt, sondern zur Verwertung von Saccharose, wobei aus UDP und Saccharose UDP-Glucose und Fructose gebildet werden. Daher findet man dieses Enzym vornehmlich in nicht-photosynthetischen Geweben. Wir werden die Funktion dieses Enzyms bei der Stärkesynthese in den Amyloplasten von Speichergeweben (Abschn. 13.3) oder bei der Cellulosesynthese in Baumwolle-produzierenden Zellen (Abschn. 9.6) kennen lernen. Dort ist das sonst lösliche Enzym membrangebunden.

9.3 Die Verwertung des bei der Photosynthesegebildeten Triosephosphats muss strikt reguliert werden
Wie bereits in Abbildung 6.11 gezeigt, sind 5/6 des bei der Photosynthese im Calvin-Cyclus gebildeten Triosephosphats für die Regenerierung des CO2-Akzeptors Ribulosebisphosphat erforderlich. Demnach bliebe höchstens 1/6 des gebildeten Triosephosphats für den Export aus den Chloroplasten. Wegen der Photorespiration (Kapitel 7) beträgt der Anteil des verfügbaren Triosephosphats tatsächlich nur etwa 1/8 des in den Chloroplasten gebildeten Triosephosphats. Würde die Entnahme des Triosephosphats aus dem Calvin-Cyclus diesen verfügbaren Betrag überschreiten, könnte der CO2-Akzeptor Ribulosebisphosphat nicht mehr regeneriert werden, und der Cyclus würde zusammenbrechen. Daher ist es für die Funktion des Calvin-Cyclus entscheidend, dass die Entnahme der Triosephosphate das erlaubte Maß nicht überschreitet. Andererseits kann die Photosynthese in den Chloroplasten nur dann ablaufen, wenn ihr Produkt Triosephosphat auch abgenommen wird und daraus das Phosphat wieder freigesetzt wird. Bei Phosphatmangel würde die Photosynthese gedrosselt werden oder sogar zum Erliegen kommen. Es ist daher wichtig für die Pflanze, dass bei einer Erhöhung der Photosynthese - beispielsweise durch intensive Sonneneinstrahlung - die vermehrt gebildeten Assimilationsprodukte auch entsprechend verwertet werden können.
Die Verwertung des bei der Photosynthese gebildeten Triosephosphats sollte demnach so geregelt sein, dass nicht mehr entnommen wird als erlaubt, aber so viel wie möglich.

Fructose-1,6-bisphosphatase funktioniert als Eingangsventil für die Synthesekette der Saccharose
In den Mesophyllzellen ist normalerweise die Saccharosesynthese der Hauptabnehmer für das bei der COCO2 Fixierung gebildete Triosephosphat. Die Entnahme des Triosephosphats aus den Chloroplasten für die Saccharosesynthese wird nicht auf der Stufe des Exports in das Cytosol reguliert. Die Gesamtreaktion der Saccharosesynthese ist in Abbildung 9.14 gezeigt. Sie ist durch die Hydrolyse des Fructose-1 ,6-bisphosphats und des Saccharosephosphats ein irreversibler Prozess, der außerdem wegen der vorhandenen hohen Enzymaktivitäten eine sehr hohe Kapazität aufweist. Damit nicht mehr Triosephosphat als erlaubt aus dem Calvin-Cyclus entnommen wird, muss die Saccharosesynthese streng reguliert sein.
Der erste, irreversible Schritt der Saccharosesynthese wird durch die cytosolische Fructose-1,6-bisphosphatase katalysiert. Diese Reaktion ist ein wichtiger Kontrollpunkt; sie stellt gewissermaßen das Eingangsventil für die Entnahme von Triosephosphat zur Saccharosesynthese dar. Abbildung 9.15 zeigt, wie dieses Ventil funktioniert. Eine wichtige Rolle spielt dabei Fructose-2,6-bisphosphat (Fru2,6BP), eine Regulatorsubstanz, die sich nur in der Stellung einer Phosphatgruppe von dem Metaboliten Fructose-1,6-bisphosphat unterscheidet (Abb. 9.16).
Fru2,6BP wurde als potenter Aktivator der ATP-abhängigen Fructose-6-phosphat-Kinase und als Inhibitor der Fructose-1,6-bispbosphatase in der Leber entdeckt. Es stellte sich dann heraus, dass Fru2,6BP ubiquitär (Allgegenwärtig) ist und für die Kontrolle von Glycolyse und Gluconeogenese in Tieren, Pilzen und Pflanzen generell von Bedeutung ist.
Fru2,6BP ist ein sehr starker Regulator der cytosolischen Fructose-1,6-bisphosphatase in Mesophyllzellen. Bereits mikromolare Konzentrationen von Fru2,6BP, wie sie tatsächlich auch im Cytosol von Mesophyllzellen vorkommen, führen zu einer sehr stark verringerten Affinität des Enzyms zu seinem Substrat Fructose-1,6-bisphosphat. Andererseits aktiviert Fru2,6BP eine im

Cytosol der Pflanzenzellen vorhandene Pyrophosphat-abhängige Fructose-6-phosphat-Kinase. Ohne Fru2,6BP ist dieses Enzym inaktiv. Die PP-Fructose-6-phosphat-K.inase kann das bei der UDP-Glucose-Pyrophosphorylasereaktion entstandene Pyrophosphat verwerten.
Fru2,6BP wird durch eine spezielle Kinase, die Fructose-6-phosphat-2-Kinase, aus Fructose-6-phosphat gebildet und durch eine spezielle Phosphatase (Fructose-2,6-bisphosphatase) wieder zu der Ausgangssubstanz hydrolysiert. Die Konzentration der Regulatorsubstanz wird durch eine Regulation der Geschwindigkeit von Synthese und Abbau eingestellt. Triosephosphat und 3-Phosphoglycerat hemmen die Synthese von Fru2,6BP, während Fructose-6-phosphat und Phosphat die Synthese stimulieren und die Hydrolyse drosseln. Auf diese Weise führt ein Anstieg der Triosephosphatkonzentration zu einer Erniedrigung des Fru2,6BP-Spiegels und damit zu einer gesteigerten

Affinität der cytosolischen Fructose-1,6-bisphosphatase für ihr Substrat Fructose-1,6-bisphosphat. Zugleich erhöht sich bei einem Anstieg der Triosephosphatkonzentration die Konzentration des über die Aldolasereaktion im Gleichgewicht stehenden Fructose-1,6-bisphosphats. Aus der Erhöhung der Substratkonzentration bei gleichzeitiger Erhöhung der Affinität lässt sich ableiten, dass die Rate der Saccharosesynthese erst bei einer Überschreitung eines Schwellenwertes ansteigt (Abb. 9.17) . Hierdurch wird eine effiziente Anpassung der Saccharosesynthese an das Triosephosphatangebot erreicht.
Das Prinzip der Regulation lässt sich mit einem Überfließventil vergleichen. Eine bestimmte Schwellenkonzentration des Triosephosphats muss überschritten werden, damit ein nennenswerter Substratfluss durch die Fructose-1,6-bisphosphatase erfolgt. Dadurch wird gewährleistet, dass ein für den Ablauf des Calvin-Cyclus erforderlicher minimaler Triosephosphatspiegel nicht unterschritten wird. Bei einem Überschreiten der Schwelle führt ein weiterer Anstieg des Triosephosphats zu einer hohen Verstärkung der Enzymaktivität,

wodurch der in den Chloroplasten anfallende Überschuss an Triosephosphat in sehr effizienter Weise der Saccharosesynthese zugeleitet werden kann.
Die cytosolische Fructose-1,6-bisphosphatase passt sich in ihrer Aktivität nicht nur, wie hier gezeigt, dem Substratangebot an, sondern auch der Produktnachfrage. Bei einem Anstieg von Fructose-6-phosphat, dem Produkt der Reaktion, wird über eine Stimulierung der Fructose-6-phosphat-2-Kinase und eine Hemmung der Fructose-2,6-bisphosphatase der Spiegel der Regulatorsubstanz Fru2,6BP erhöht und dadurch die Aktivität der cytosolischen Fructose-1,6-bisphosphatase gedrosselt Abb. 9.15.

Die Saccharosephosphat-Synthase wird sowohl durch Metabolite als auch durch kovalente Modifikation reguliert
Auch die Saccharosephosphat-Synthase (vgl. Abb. 9.14) unterliegt einer strikten metabolischen Kontrolle. Dieses Enzym wird durch Glucose-6-phosphat aktiviert und durch Phosphat gehemmt. Der Aktivator Glucose-6-phosphat steht mit Fructose-6-phosphat, dem Substrat der Reaktion, im Gleichgewicht, wobei Glucose-6-phosphat überwiegt. Im Gleichgewicht bewirkt daher eine Konzentrationsänderung des Substrats eine viel größere Änderung der Aktivatorkonzentration. Die Aktivität des Enzyms wird so in wirksamer Weise dem Substratangebot angepasst.
Die Aktivität der Saccharosephosphat-Synthase wird außerdem durch kovalente Modifikation des Enzyms verändert. Das Enzym besitzt in Pos. 158 einen Serinrest, dessen OH-Gruppe durch eine spezielle Protein-Kinase, die Saccharosephosphat-Synthase-Kinase (SPS-Kinase), phosphoryliert und durch eine entsprechende SPS-Phosphatase dephosphoryliert wird (Abb. 9.18A). Die SPS-Phosphatase wird durch Ocadainsäure, einen Inhibitor von Protein-Phosphatasen des so genannten 2A-Typs (auf den wir hier nicht näher eingehen können), gehemmt. Die Aktivität der SPS-Kinase wird wahrscheinlich durch Metabolite wie Glucose-6-phosphat reguliert.
Die so phosphorylierte Form der Saccharosephosphat-Synthase ist weniger aktiv als die dephosphorylierte Form. Durch die relativen Geschwindigkeiten

von Phosphorylierung und Dephosphorylierung stellt sich eine bestimmte Aktivität des Enzyms ein. Bei Belichtung eines Blattes wird die SPS-Phosphatase in ihrer Aktivität erhöht und dadurch die Saccharosephosphat-Synthase in die aktivere Form umgewandelt. Der Mechanismus hierfür ist nicht bekannt. Es wird diskutiert, dass die Verminderung der SPS-Phosphataseaktivität im Dunkeln auf einer verminderten Syntheserate des Enzyms beruht. Die Saccharosephosphat-Synthase enthält in Pos. 424 einen weiteren Serinrest, der durch eine andere Proteinkinase - diese wird bei osmotischem Stress aktiviert - phosphoryliert wird. Bei der Phosphorylierung dieses Serinrestes wird die Saccharosephosphat-Synthase aktiviert. Man erkennt hieraus die Komplexität der Regulation der SPS. Die Phosphorylierung eines bestimmten Serinrestes durch eine entsprechende Proteinkinase führt zu einer Hemmung, während die Phosphorylierung eines anderen Serinrestes durch eine andere Proteinkinase zu einer Aktivierung führt. Die SPS besitzt sogar noch eine dritte Phosphorylierungsstelle, an die ein 14-3-3 Protein gebunden wird (ähnlich wie bei der Nitratreduktase, Abschn. 10.3). Die physiologische Bedeutung dieser Bindung ist derzeit noch ungeklärt.

Die Verteilung der Assimilate zwischen Saccharose und Stärke beruht auf dem Zusammenspiel mehrerer Regulationsmechanismen
Wir haben gesehen, dass an der Steuerung der Saccharosesynthese verschiedene Regulationsvorgänge beteiligt sind. Durch die Wirkung von Metaboliten, als Hemmer oder Aktivatoren von Enzymen, kann die Geschwindigkeit der Saccharosesynthese unmittelbar den aktuellen Stoffwechselbedingungen angepasst werden. Man spricht hier auch von einer Feinkontrolle. Durch die kovalente Modifikation von Enzymen, ausgelöst durch diurnale (tagaktiv) Faktoren und wahrscheinlich auch durch Phytohormone (Kapitel 19), erfolgt eine übergeordnete Regulation gemäß den Stoffwechselbedürfnissen der Pflanze. Dazu gehört die Verteilung der Assimilate (engl. partitioning) zwischen Saccharose-, Stärke- und Aminosäuresynthese (siehe Kapitel 10). So kann durch eine Drosselung der Saccharosesynthese über einen Anstau von Triosephosphat, und damit auch von 3-Phosphoglycerat, die Synthese der Stärke erhöht werden Abb. 9.12. Wie bereits besprochen, wird in den Blättern während des Tages ein großer Teil des Photoassimilats in den Chloroplasten als transitorische Stärke zwischengelagert und erst in der folgenden Nacht zu Saccharose umgesetzt, um die Verbrauchsorgane auch während der Nacht mit Saccharose versorgen zu können. In manchen Pflanzen - beispielsweise in Gerste - werden tagsüber in den Blättern große Mengen des Assimilats als Saccharose zwischengelagert. Daher läuft in Blättern verschiedener Pflanzen die Synthese der Saccharose während der Nacht mit sehr unterschiedlicher Geschwindigkeit ab.

Trehalose ist eine wichtige Signalsubstanz
Trehalose (Abb. 9.18B), welches in nur sehr geringen Konzentrationen in Pflanzenzellen vorkommt, wurde lange Zeit für unbedeutend gehalten. In jüngster Zeit gibt es jedoch viele experimentelle Befunde, die zeigen, dass Trehalose bzw. Trehalosephosphat sehr wichtige Signalmetabolite für die Regulation des Pflanzenstoffwechsels sind. Ausgangssubstrate für die Synthese sind Glucose-6-phosphat und UDP-Glucose:

Die Bedeutung der Trehalose lässt sich allein schon dadurch erkennen, dass es in Arabidopsis mehr Gene für dessen Synthese gibt als für die Synthese von Saccharose.

9.4 In manchen Pflanzen erfolgt der Export der Assimilate aus den Blättern in Form von Zuckeralkoholen oder von Oligosacchariden der Raffinosefamilie
Saccharose ist nicht in allen Pflanzen die Transportform für die Translokation der Assimilate in die Verbrauchsorgane. In manchen Pflanzen dienen dazu auch Zuckeralkohole (als Polyole bezeichnet), zu deren wichtige Vertreter Sorbit und Mannit (Abb. 9.19) gehören.

So erfolgt unter anderem in Rosaceaen (dazu gehören unsere heimischen Obstbäume) der Assimilattransport in die Verbrauchsorgane zu einem großen Teil in Form von Sorbit (Abb. 9.19). Andere Pflanzen - wie Kürbisgewächse, heimische Laubbäume (Linde, Haselnuss, Ulme) und Olivenbäume - befördern in ihren Siebröhren Oligosaccharide, bei denen Saccharose mit einem oder mehreren Galactoseresten glycosidisch verknüpft ist (Abb. 9.20). Zu diesen Oligosacchariden der so genannten Raffinosefamilie zählen Raffinose mit einem, Stachyose mit zwei und Verbascose mit drei Galactoseresten. Die Oligosaccharide der Raffinosefamilie haben dazu auch eine Funktion als Speicherverbindungen. Sie machen beispielsweise in den Samen von Erbsen und Bohnen 5 bis 15 % der Trockensubstanz aus. Da die α-Galactosidbindung von den menschlichen Verdauungsenzymen nicht gespalten werden kann, sind Zucker der Raffinosefamilie für den Menschen unverdaulich. Sie werden im letzten Abschnitt des Darms durch anaerobe Bakterien unter der Bildung von Verdauungsgasen zersetzt.

Die für die Raffinosesynthese erforderliche Galactose entsteht durch Epimerisierung der durch UDP aktivierten Glucose (Abb. 9.21). Durch die UDP-Glucose-Epimerase wird die in Position 4 vorhandene OH-Gruppe vorübergehend oxidiert. Als Oxidationsmittel dient dabei fest an das Enzym gebundenes NAD+. Bei der sich anschließenden Reduktion entstehen dann sowohl Glucose als auch Galactose. Es stellt sich so ein Epimerasegleichgewicht ein. Durch eine Transferase wird der Galactoserest auf den cyclischen Alkohol myo-Inositol übertragen, dabei entsteht Galactinol.

Durch myo-Inositol-Galactosyl-Transferasen werden durch eine Übertragung des Galactoserestes von Galactinol auf Saccharose Raffinose gebildet und in entsprechender Weise ebenfalls Stachyose und Verbascose.


9.5 Fructane werden als Speichersubstanz in der Vakuole gelagert
Neben der Stärke haben in vielen Pflanzen auch Fructane eine wichtige Bedeutung als Kohlenhydratspeicher. Während die Stärke als unlösliche Polyglucose in den Plastiden gebildet wird, sind Fructane lösliche Polyfructosen, die in der Vakuole synthetisiert und gelagert werden. Man hat sie zuerst in Knollen von Zierblumen, zum Beispiel Dahlien, gefunden. Zu den Fructanspeichernden Pflanzen gehören viele Gräser aus gemäßigten Klimaten, darunter auch Weizen und Gerste. Die Fructane finden sich dort oft in den Blättern und den Stängeln. Die Kohlenhydrate in der Zwiebel bestehen hauptsächlich aus Fructanen. Sie werden, wie die bereits besprochenen Raffinosezucker,vom Menschen nicht verdaut. Fructane wurden daher wegen ihres süßen Geschmacks insbesondere in Japan als natürliche, kalorienfreie Süßstoffe benutzt.
Ausgangssubstanz für die Polysaccharidketten der Fructane ist ein Saccharosemolekül, an das weitere Fructosemoleküle geknüpft sind. Die Grundform der Fructane, bei der Saccharose mit nur einem weiteren Fructosemolekül glycosidisch zu einem Trisaccharid verbunden ist, bezeichnet man als Kestosen. Abbildung 9.22 zeigt drei Haupttypen der Fructane. Bei den Fructanen des 6-Kestosetyps ist der Fructoserest der Saccharose in Position 6 mit einer weiteren Fructose in 2ß-Position glycosidisch verknüpft. Durch (6→2β)-Verknüpfungen mit weiteren Fructoseresten werden Ketten mit unterschiedlicher Länge (10 bis 200 Fructoseresten) gebildet. Man bezeichnet Fructane aus 6-Kestosen auch als Lävantyp. Man findet diese Fructane häufig in Gräsern.
Bei den Fructanen des 1-Kestosetyps sind die Fructosereste der Kette mit dem Saccharosemolekül und untereinander in (1→2β)-glycosidischer Bindung verknüpft. Diese Fructane - die man auch als Inulintyp bezeichnet - bestehen aus bis zu 50 Fructoseresten. Inulin findet man in den Knollen der Dahlien.

Bei den Fructanen des Neokestosetyps gehen zwei Polyfructoseketten von der Saccharose aus, eine ist wie bei der 1-Kestose (1→2β)-glycosidisch mit der Fructose verknüpft, die andere (6→2β)-glycosidisch mit dem Glucoserest. Die Fructane des Neokestosetyps sind mit fünf bis zehn Fructoseresten die kleinsten Fructane. Verzweigte Fructane, die sowohl (1→2β)- als auch (6→2β)-glycosidisch verknüpft sind, werden auch als Graminane bezeichnet. Man findet sie in Weizen und Gerste.
Ausgangssubstanz für die in der Vakuole erfolgende Synthese der Fructane ist Saccharose. Durch das Enzym Saccharose-Saccharose-Fructosyltransferase wird der Fructoserest von einer Saccharose auf eine zweite Saccharose übertragen (Abb. 9.23A). Dabei wird eine 1-Kestose gebildet, übrig bleibt Glucose. Für eine Verlängerung der Kestosekette wird der erforderliche Fructoserest nicht von der Saccharose, sondern von einer anderen Kestose übertragen (Abb. 9.23B). Das Enzym Fructan-Fructan-1-Fructosyltransferase überträgt bevorzugt den Fructoserest von einem Trisaccharid auf eine längerkettige Kestose. Die Bildung der 6-Kestosen wird entsprechend durch eine Fructan-Fructan-6-Fructosyltransferase katalysiert. Zur Bildung der Neokestosen wird durch 6-Glucose-Fructosyltransferase ein Fructoserest von einer 1- Kestose auf den Glucoseteil einer Saccharose übertragen (Abb. 9.23C). Das so gebildete Trisaccharid ist Ausgangsprodukt für weitere Kettenverlängerungen entsprechend (Abbildung 9.23B). Der Abbau der Fructane erfolgt durch eine sukzessive Abspaltung der Fructosereste vom Ende her durch exohydrolytische Enzyme.

In vielen Gräsern werden Fructane für eine bestimmte Zeitdauer in den Blättern und im Stängel angereichert. Sie können dabei bis zu 30% des Trockengewichtes ausmachen. So werden in manchen Pflanzen vor Blühbeginn Kohlenhydrate als Fructane angesammelt, um nach Befruchtung der Blüten als Reserve für eine schnelle Samenbildung zu dienen. Pflanzen in marginalen Lebensräumen, bei denen sich Perioden der positiven CO2-Bilanz mit Zeiten abwechseln, in denen keine ausreichende Photosynthese möglich ist, nutzen Fructane als Reserve für ein Aufrechterhalten des Wachstums auch bei ungünstigen Bedingungen. So werden Fructane auch vermehrt bei Trocken und Kältestress gebildet. Neben der Rolle der Fructane als Kohlenhydratspeicher wurden in den letzten Jahren weitere Funktionen für diese Polymere in Pflanzen gefunden, insbesondere die Stabilisierung von Membranen unter Frost- und Trockenstress sowie ein erhöhter Schutz vor reaktiven Sauerstoff-Spezies.
Viele Pflanzen, die in ihren Blättern Fructane speichern, lagern dort für gewöhnlich auch Saccharose und Stärke. Fructan ist dann ein zusätzlicher Speicher. Abbildung 9.24 zeigt in einer stark vereinfachten Darstellung die Bildung des Fructans als alternative Speichersubstanz in einem Blatt. Um einen durch die Photosynthese als Fructose-6-phosphat bereitgestellten Fructoserest in Fructan umzuwandeln, muss zunächst Saccharose (Details gezeigt in (Abb. 9.14) synthetisiert werden. Die dabei erforderliche UDP-Glucose wird aus der bei der Fructansynthese in der Vakuole freigesetzten Glucose nach Phosphorylierung durch eine Hexokinase durch UDP-Glucose-Pyrophosphorylase bereitgestellt. Somit erfordert die Reaktion des bei der Photosynthese gebildeten Fructose-6-phosphats zu Fructan insgesamt 2 ATP-Äquivalente pro Molekül, das ist doppelt so viel wie für die Synthese der Stärke in den Plastiden. Ein Grund für diesen Mehraufwand liegt darin, dass die in Plastiden vorkommende Pyrophosphatase, welche die ADP-Glucose-Pyrophosphorylasereaktion irreversibel macht (Abschn. 9.1), im Cytosol nicht vorhanden ist.

Die Speicherung von Kohlenhydraten im Blatt als Fructan in der Vakuole hat den Vorteil, dass durch die Größe der Vakuole (sie nimmt etwa 80% des Zellvolumens ein) eine sehr hohe Speicherkapazität besteht. In einem Blatt können so, zusätzlich zu den erforderlichen diurnalen Kohlenhydratspeichern in Form von transitorischer Stärke und Saccharose, eine größere Kohlenhydratreserve angelegt werden, zum Beispiel für eine schnelle Samenproduktion oder als Notvorrat.

9.6 Cellulose wird durch Enzyme der Plasmamembran synthetisiert
Wir haben in Abschnitt 1.1 als wichtigen Zellwandbestandteil Cellulose kennengelernt, ein Glucan, bei dem Glucosereste ß-1,4-glycosidisch zu einer sehr langen Kette verknüpft sind. Die Cellulosesynthese erfolgt durch die in der Plasmamembran lokalisierte Cellulose-Synthase, wobei die Glucosebausteine als UDP-Glucose vom Zellinnern her angeliefert werden und die wachsende Cellulosekette in den extrazellulären Raum ausgestoßen wird (Abb. 9.25B).

Die Cellulosesynthese konnte besonders gut an Baumwolle untersucht werden. Hierbei zeigte sich, dass auch die UDP-Glucose in der Membran bereitgestellt wird: Durch eine membrangebundene Saccharose-Synthase (Abschn. 9.2) wird aus Saccharose, die vom Cytosol geliefert wird, UDP-Glucose gebildet und letztere direkt auf die Cellulose-Synthase übertragen. Alternativ wird UDP-Glucose durch die UDP-Glucose-Pyrophosphorylase (Abschn. 9.2) aus Glucose-1-phosphat und UTP gebildet. Die Cellulosesynthese beginnt mit der Übertragung eines Glucoserestes von UDP-Glucose auf Sitosterol (Abb. 15.3), einem Lipid der Plasmamembran. Der durch die glycosidische Verknüpfung an die Hydroxylgruppe des Membranlipids gebundene Glucoserest wirkt als Primer für die Cellulosesynthese und bewirkt, dass die wachsende Cellulosekette an der Membran verankert ist. Cellulose kommt nie in einzelnen Ketten, sondern stets in einer als Mikrofibrille bezeichneten kristallinen Anordnung vieler Ketten vor Abschnitt 1.1. Man nimmt an, dass durch viele in der Membran benachbarte Cellulose-Synthasen alle ß-1,4-Glucanketten einer Mikrofibrille gleichzeitig gebildet werden und sich sofort zusammenlagern.



Die Synthese von Callose wird oft durch Gewebsverletzungen ausgelöst
Callose ist ein ß-1,3-Glucan (Abb. 9.25A) mit einer langen unverzweigten, schraubig gewundenen Kette. Callose bildet ohne weitere Bestandteile sehr kompakte Strukturen und dient der Pflanze als universelles Abdichtungsmaterial. Callose kann an der Plasmamembran nach Gewebsverletzung rasch in beträchtlichen Mengen synthetisiert werden. Diese Callosesynthese erfolgt nach bisherigen Untersuchungen in prinzipiell gleicher Weise wie die in Abbildung 9.25B gezeigte Cellulosesynthese, ebenfalls unter Bereitstellung von UDP-Glucose durch Saccharose-Synthase. Die Callosesynthese wird durch einen Anstieg der Ca2+-Konzentration im Cytosol stimuliert. Eine Zellverletzung, die durch Ca2+2+-Einstrom einen Anstieg der cytosolischen Ca2+2+-Konzentration bewirkt, löst so die Synthese von Callose als Abdichtungsmaterial aus. Durch Callosebildung werden auch die Plasmodesmen defekter Zellen verschlossen, um eine Gefährdung anderer Zellen des Symplasten (Abschn.1.1) zu verhindern. Callose dient auch als Kitt, um defekte Siebröhren zu verschließen (Abschn. 13.2).

Zellwand-Polysaccharide werden auch im Golgi-Apparat synthetisiert
Im Gegensatz zu den Synthesen von Cellulose und Callose, die an der Plasmamembran stattfinden, erfolgt die Synthese der Zellwand-Polysaccharide Hemicellulose und Pektin im Golgi-Apparat. Die Glucosyltransferasen im Golgi-Apparat benötigen Zucker, die mit UDP aktiviert wurden, wie schon am Beispiel der UDP-Glucose gezeigt. Manche Hexosen werden als GDP-Derivate aktiviert, z. B. GDP-Mannose und GDP-Fucose. Der Transfer der im Golgi-Apparat gebildeten Polysaccharidketten zur Zellwand erfolgt über einen exocytotischen Vesikeltransport.
Im Holz befindet sich neben Lignin und Cellulose auch ca. 30% Hemicellulose, in denen die Xylane zumeist stark dominieren. Xylane bestehen aus langen Ketten der Pentose Xylose, die durch Acetylierungen modifiziert werden. Ausgehend von der UDP-Glucose, die aus der Photosynthese stammt, wird diese zunächst am C6-Atom 2-fach oxidiert, so dass UDP-Glucuronsäure entsteht (Abb. 9.26). Durch Epimerisierung entsteht UDP-Galacturonsäure ist ein Hauptbestandteil der Pektine. Durch Abspaltung von CO2 von UDP-Glucuronsäure wird die Pentose UDP-Xylose gebildet, sie ist Baustein für die Xylane im Holz.
Bei der Papierherstellung fallen neben dem Lignin, das zumeist thermisch verwertet wird, auch große Mengen an Xylanen an. Mit gentechnisch modifizierten Hefen ist es inzwischen gelungen, auch aus Pentosen Bioethanol herzustellen. Normalerweise können Hefen Ethanol nur aus Hexosen vergären.

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10 Die Assimilation von Nitrat wird zur Synthese von organischem Material benötigt
Lebende Materie enthält einen hohen Anteil an Stickstoff, der in Proteine, Nukleinsäuren und viele andere Biomoleküle eingebaut ist. Dieser "organische" Stickstoff liegt in der Oxidationsstufe -III (wie in NH3) vor. Beim N-autotrophen Wachstum wird der Stickstoffbedarf für die Bildung der Zellmaterie aus anorganischem Stickstoff gedeckt. Hierfür gibt es drei verschiedene Möglichkeiten:
     1. Fixierung des molekularen Stickstoffs aus der Luft.
     2. Assimilation von Nitrat oder Ammonium, das im Wasser oder im Boden enthalten ist.
     3. Aufnahme von Aminosäuren aus dem Boden durch arbuskuläre Mykorrhiza.
Der Stickstoff aus der Luft kann nur von einer beschränkten Anzahl von Bakterien, darunter auch einige Cyanobakterien, fixiert werden. Wie wir in Kapitel 11 ausführlich diskutieren werden, nutzen einige Pflanzen diese Fähigkeit, indem sie eine Symbiose mit N2-fixierenden Bakterien eingehen, um von ihnen mit organisch gebundenem Stickstoff versorgt zu werden. Etwa 99 % des organischen Stickstoffs in der Biosphäre stammt jedoch aus der Nitratassimilation. Beim Abbau der organischen Materie, vor allem durch den Stoffwechsel der Tiere und Bakterien, entsteht letztlich NH4+, das durch so genannte nitrifizierende Bakterien im Boden wieder zu Nitrat oxidiert wird. Es besteht so ein .steter Kreislauf zwischen dem Nitrat im Boden und dem organischen Stickstoff der auf diesem Boden wachsenden Pflanzen. Nur in schlecht belüfteten Böden mit ungenügender Entwässerung, in denen nitrifizierende Bakterien wegen Sauerstoffmangel nicht wachsen können, oder auch in versauerten Böden, reichert sich NH4+ an. Insbesondere durch Massentierhaltung kann ein starker NH3 Eintrag in die Böden sowohl durch die Gülle als auch durch die Luft verursacht werden. Falls verfügbar, können viele Pflanzen auch NH4+ statt Nitrat als Stickstoffquelle nutzen.

10.1 Die Reduktion des Nitrat zu NH3 erfolgt in zwei Teilreaktionen
Die Nitratassimilation findet sowohl in den Wurzeln als auch in den Blättern statt. Bei den meisten ausgewachsenen krautigen Pflanzen tragen die Blätter den Hauptanteil der Nitratassimilation. Hingegen ist bei vielen Holzpflanzen (Bäumen, Sträuchern) die Nitratassimilation auf die Wurzeln konzentriert dies gilt aber auch für Leguminosen wie die Sojabohne. Bei den meisten Pflanzen ist in einem frühen Wachstumsstadium die Nitratassimilation in den Wurzeln besonders ausgeprägt. Bei schnellwachsenden Baumarten erfolgt Nitratassimilation auch in den Blättern.
Der Transport von Nitrat in die Wurzelzellen erfolgt als Symport mit 2 Protonen (Abb.10.1). Ein Protonengradient über der Plasmamembran, erzeugt durch eine H+-P-ATPase (Abschn. 8.2), treibt die Aufnahme von Nitrat sogar gegen einen hohen Konzentrationsgradienten. Das für die Bildung des Protonengradienten erforderliche ATP wird zumeist durch mitochondriale Atmung geliefert. Bei der Ausschaltung der mitochondrialen ATP-Synthese in den Wurzeln durch Hemmer oder Entkoppler der Atmung kommt daher in der Regel die Nitrataufnahme zum Erliegen. Nach neueren Ergebnissen enthalten Wurzelzellen mehrere Nitrattransporter, solche mit relativ niedriger Affinität (Halbsättigung > 500 μM Nitrat), die meist konstitutiv (d.h. immer vorhanden) sind und solche mit sehr hoher Affinität (Halbsättigung 20-100 μM Nitrat) die zum Teil erst bei Bedarf induziert werden. Die Effizienz dieser Aufnahmesysteme ermöglicht bereits ein Pflanzenwachstum bei einer Nitratkonzentration von nur 10 μM im Außenraum.

Das in die Zellen der Wurzel aufgenommene Nitrat kann dort in der Vakuole zwischengespeichert werden. Wie in Abschnitt 10.2 ausführlich besprochen, wird Nitrat in den Epidermis- und Cortexzellen der Wurzel unter Beteiligung der Leukoplasten zu NH4+ reduziert; letzteres wird vor allem zur Synthese von Glutamin und Asparagin (die in Abb. 10.1 als Amide bezeichnet werden) verwendet. Diese beiden Aminosäuren können durch die Xylemgefäße zu den Blättern transportiert werden. Wenn die Kapazität der Nitratassimilation in den Wurzeln erschöpft ist, wird das Nitrat aus der Wurzel in die Xylemgefäße entlassen und gelanngt durch diese in die Blätter. Die Aufnahme des Nitrats in die Mesophyllzellen erfolgt wahrscheinlich ebenfalls über einen Protonensymport. Durch Aufnahme in die Vakuole können große Mengen von Nitrat im Blatt gespeichert werden. Mitunter wird dieser Speicher nachts auf gefüllt, um dann tagsüber für die Nitratassimilation genutzt zu werden. So findet man in Spinatblättern den höchsten Nitratgehalt am frühen Morgen.
In den Mesophyllzellen wird das Nitrat durch die im Cytosol vorhandene Nitrat-Reduktase zunächst zu Nitrit und dann durch die Nitrit-Reduktase der Chloroplasten weiter zu NH4+ reduziert Abb. 10.1.

Nitrat wird im Cytosol zu Nitrit reduziert
Bei der Nitratreduktion von Pflanzen wird meist NADH als Reduktionsmittel verwendet. Manche Pflanzen enthalten Nitrat-Reduktasen, die sowohl mit NADH als auch mit NADPH reagieren. Die Nitrat-Reduktase der höheren Pflanzen besteht aus zwei identischen Untereinheiten. Die Molekülmasse einer Untereinheit beträgt je nach Spezies 99 bis 104 kDa. Jede der Untereinheiten trägt eine Elektronentransportkette (Abb. 10.2),

die aus je einem Molekül Flavinadenindinukleotid (FAD), einem Häm des Cytochrom-b-Typs (Cyt-b-557) und einem Molybdänatom, das Bestandteil eines Cofaktors ist, besteht (Abb. 10.3).

Dieser Cofaktor ist ein Pterin, das eine Seitenkette enthält, mit der das Molybdän über zwei Schwefelbindungen verknüpft ist. Man nennt das Addukt Molybdän-Cofaktor, abgekürzt MoCo. Gebunden an den Cofaktor wechselt das Molybdänatom wahrscheinlich zwischen den Oxidationsstufen +IV und +VI. Die drei Redoxüberträger der Nitrat-Reduktase sind jeweils kovalent an eine Untereinheit des Enzyms gebunden. Durch eine begrenzte Proteinhydrolyse lässt sich die Proteinkette der Untereinheit in drei Domänen spalten, die jeweils nur einen der drei Redoxüberträger besitzen. Sowohl das ganze Enzym als auch die voneinander abgetrennten Domänen können mit ihren Redoxüberträgern einen Elektronenfluss auf künstliche Elektronenakzeptoren vermitteln (z.B. von NADH auf Fe3+-Ionen durch die FAD-Domäne oder von reduziertem Methylviologen, (s. Abb. 3.39), auf Nitrat durch die Mo-Domäne). Die Nitrat-Reduktase kann auch Chlorat (ClO3-) zu Chlorit (ClO2-) reduzieren. Chlorat kann über einige Nitrat-Transporter in die Wurzeln aufgenommen werden. Es ist ein sehr starkes Oxidationsmittel und somit für die Pflanzenzelle sehr toxisch. Man hat daher früher Chlorat als billiges Totalherbizid benutzt, um Gleiskörper der Bahn vegetationsfrei zu halten.

Die Reduktion von Nitrit zu Ammonium findet in den Plastiden statt
Die Reduktion von Nitrit zu Ammonium erfordert die Aufnahme von sechs Elektronen. Die gesamte Reaktion wird durch nur ein Enzym katalysiert, die ausschließlich in den Plastiden lokalisierte Nitrit-Reduktase (Abb. 10.4).

Als Elektronendonor dient reduziertes Ferredoxin, das als Produkt des photosynthetischen Elektronentransports von Photosystem I bereitgestellt wird (Abb. 3.16). In geringem Umfang kann das für die Nitritreduktion im Blatt erforderliche Ferredoxin jedoch auch im Dunkeln durch NADPH reduziert werden. NADPH kann in den Chloroplasten im Dunkeln und in den Leukoplasten (Abschnitt 1.3) durch den oxidativen Pentosephosphatweg (Abb. 6.22, 10.8) geliefert werden.
Die Nitrit-Reduktase enthält in kovalent gebundener Form ein 4Fe-4S-Zentrum (siehe Abb. 3.26), ein FAD und ein Sirohäm. Sirohäm (Abb. 10.5) ist ein cyclisches Tetrapyrrol mit einem Fe-Atom im Zentrum, das sich in seiner Struktur vom Häm sehr unterscheidet: Es enthält noch die aus der Pyrrolsynthese stammenden Essigsäure- und Propionsäurereste.

Das 4Fe-4S-Zentrum, das FAD und das Sirohäm bilden eine Elektronentransportkette, durch die Elektronen vom Ferredoxin auf das Nitrit übertragen werden. Die Affinität des Enzyms zu seinem Substrat Nitrit ist ungewöhnlich hoch. Außerdem ist in den Chloroplasten die Kapazität der Nitritreduktion sehr viel höher als die der cytosolischen Nitratreduktion. Aus diesen Gründen kann das durch die Nitrat-Reduktase gebildete Nitrit vollständig zu NH4+ umgesetzt werden. Dies ist wichtig, da Nitrit für die Zelle toxisch ist. Es bildet mit Aminogruppen von Nukleinbasen (-NH2) Diazoverbindungen, die unter Stickstoffabspaltung in Alkohole übergehen.

So kann beispielsweise Cytosin zu Uracil umgesetzt werden. Diese Reaktion kann Mutationen auslösen. Durch die sehr effiziente Reduktion des Nitrits in den Chloroplasten wird vermieden, dass sich Nitrit in der Zelle anhäuft.

Die Assimilierung des NH4+ erfolgt in gleicher Weise wie bei der Photorespiration
Durch die in den Chloroplasten vorhandene Glutamin-Synthetase wird das gebildete NH4+ unter Verbrauch von ATP auf Glutamat übertragen, dabei entsteht Glutamin (Abb. 10.6). Die Aktivität der Glutamin-Synthetase und die Affinität des Enzyms zu NH4+ (Km ≈ 5 μmol/L) sind so hoch, dass das anfallende NH4+ quantitativ metabolisch gebunden wird. Durch die gleiche Reaktion wird auch das bei der Photorespiration freigesetzte NH4+ fixiert (siehe Abb. 7.9). Wegen der hohen Rate der Photorespiration ist die Menge an NH4+, die durch die Oxidation des Glycins entsteht, etwa fünf bis zehnmal höher als die Menge des bei der Nitratassimilation gebildeten NH4+. Daher ist für die Glutamin-Synthetase der Blätter die Beteiligung an der Nitratassimilation gewissermaßen nur eine Nebenbeschäftigung, die allerdings allein neuen Stickstoff für die Pflanze verfügbar macht. Der Vollständigkeit halber sei erwähnt, dass es auch ein Isoenzym der Glutamin-Synthetase gibt, das im Cytosol lokalisiert ist.

Durch Glufosinat (Abb. 10.7), einem Substratanalogon von Glutamat, lässt sich die Glutamin-Synthetase hemmen. Pflanzen, bei denen durch Zugabe von Glufosinat die Glutamin-Synthetase gehemmt ist, akkumulieren das Zellgift Ammoniak und sterben ab.

NH4+-Glufosinat wird unter dem Handelsnamen "Basta" (Bayer) als Herbizid (Abschn. 3.6) vertrieben. Glufosinat hat den Vorteil, dass es im Boden rasch abgebaut wird und die Umwelt nicht mit toxischen Abbauprodukten belastet. Es ist mit gentechnischen Methoden gelungen, Glufosinat-resistente Kulturpflanzen zu erzeugen, so dass Glufosinat als selektives Herbizid zur Unkrautbekämpfung in wachsenden Kulturen eingesetzt werden kann (siehe Abschn. 22.6).
Das in den Chloroplasten gebildete Glutamin wird über die Glutamat-Synthase (die auch als Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase, abgekürzt GOGAT, bezeichnet wird) mit α-Ketoglutarat zu zwei Molekülen Glutamat umgesetzt (siehe Abb. 7.9). Dabei dient reduziertes Ferredoxin als Reduktionsmittel. In manchen Chloroplasten und den Leukoplasten gibt es auch eine NADPH-abhängige Glutamat-Synthase. Glutamat-Synthasen können durch das Substratanalogon Azaserin (Abb. 10.7) gehemmt werden. Daher ist diese Substanz für Pflanzen toxisch.
Das für die Glutamat-Synthase erforderliche α-Ketoglutarat wird im Gegentausch mit Malat in die Chloroplasten importiert und das gebildete Glutamat ebenfalls im Gegentausch mit Malat in das Cytosol ausgeschleust. Der Anteil des Glutamats, der aus dem durch Nitritreduktion gebildeten NH4+ stammt, bildet somit das Produkt der Nitratassimilation (Abb. 10.6). Die Chloroplastenhüllmembran besitzt einen Translokator, durch den Glutamin im Gegentausch mit Glutamat transportiert werden kann. Auf diese Weise kann aus den Chloroplasten auch Glutamin ausgeschleust werden.

Die Nitratassimilation erfolgt auch in der Wurzel
Wie bereits besprochen, erfolgt in Pflanzen die Nitratassimilation teilweise und manchmal sogar vorwiegend in der Wurzel. Aus dem Boden aufgenommenes NH4+ wird stets in den Wurzeln assimiliert. Die Reduktion von Nitrat und Nitrit und die Fixierung des NH4+ erfolgen in den Wurzelzellen analog wie bei den Mesophyllzellen. Ein Unterschied besteht jedoch darin, dass in den Wurzelzellen die dabei benötigten Reduktionsäquivalente nur durch die Oxidation von Kohlenhydraten geliefert werden. Die Reduktion des Nitrits und die Fixierung des dabei gebildeten NH4+ (Abb. 10.8) erfolgen in den Leukoplasten, einer Differenzierungsform der Plastiden (Abschn. 1.3).

Der oxidative Pentosephosphatweg liefert Reduktionsäquivalente
Die für die Reduktion des Nitrits und die Bildung des Glutamats erforderlichen Reduktionsäquivalente werden durch die Oxidation von Glucose-6-phosphat über den in Abschnitt 6.5 besprochenen oxidativen Pentosephosphatweg bereitgestellt (Abb. 10.8).

Die Aufnahme von Glucose-6-phosphat erfolgt im Gegentausch mit dem Molekül Triosephosphat. Der Glucose-6-phosphat-Phosphat-Translokator der Leukoplasten unterscheidet sich von dem Triosephosphat-Phosphat-Translokator der Chloroplasten dadurch, dass er neben Phosphat, Triosephosphat und 3-Phosphoglycerat zusätzlich auch Glucose-6-phosphat transportiert. Im oxidativen Pentosephosphatweg werden drei Moleküle Glucose-6-phosphat zu drei Molekülen Ribulose-5-phosphat umgesetzt, dabei werden sechs Moleküle NADPH gebildet und drei Moleküle CO2 freigesetzt. Die weitere Umwandlung ergibt ein Molekül Triosephosphat und zwei Moleküle Fructose-6-phosphat; letztere reagieren über die Hexosephosphat-Isomerase wieder zurück zu Glucose-6-phosphat. Im Cytosol wird über die Aldolase, die cytosolische Fructose-1,6-bisphosphatase und die Hexosephosphat-Isomerase aus zwei Molekülen Triosephosphat Glucose-6-phosphat zurückgewonnen. Auf diese Weise kann Glucose-6-phosphat unter Bildung von NADPH vollständig zu CO2 oxidiert werden.
Wie in den Chloroplasten, so ist auch in den Leukoplasten reduziertes Ferredoxin das Reduktionsmittel; seine Reduktion erfolgt durch NADPH. Das für die Glutamin-Synthetase erforderliche ATP kann durch die mitochondriale ATP-Synthese gebildet werden und wird durch einen ATP-Translokator im Gegentausch mit ADP in die Leukoplasten aufgenommen. Auch die Glutamat-Synthase der Leukoplasten reagiert mit einem durch NADPH reduzierten Ferredoxin als Redoxpartner. Unter Vermittlung von Ferredoxin kann so das durch den oxidativen Pentosephosphatweg gelieferte NADPH als Reduktionsmittel für die Nitritreduktion und NH4+-Fixierung in den Leukoplasten der Wurzeln dienen. Außerdem gibt es in Leukoplasten auch eine Glutamat-Synthase, die NADPH und NADH als Reduktionsmittel verwendet. Bei ausschließlicher Nitratreduktion in der Wurzel erhält der Spross organische Stickstoffverbindungen über das Xylem. Diese sind meist Glutamin und Asparagin. Dies gilt auch, wenn NH4+ die Stickstoffquelle im Boden ist.

10.2 Die Nitratassimilation unterliegt einer strengen Kontrolle
Bei der Photosynthese einer Pflanze müssen CO2-Assimilation und Nitratassimilation aufeinander abgestimmt werden. Die Nitratassimilation kann nur dann ablaufen, wenn durch die CO2Assimilation die Kohlenstoffgerüste für die Aminosäuren bereitgestellt werden. Auch muss die Nitratassimilation so gesteuert werden, dass die Produktion der Aminosäuren den Bedarf nicht überschreitet. Schließlich ist es wichtig, dass die Nitratreduktion nicht schneller erfolgt als die Nitritreduktion, da sich sonst das toxische Nitrit (siehe Abschn. 10.1) in den Zellen anstauen würde. Eine solche „gefährliche" Nitritbildung findet unter bestimmten Bedingungen in Wurzeln statt, die zum Beispiel bei Hochwasser durch Überfluten anaerob werden. Hier wird das regulatorische System offenbar überfordert. Überflutete Wurzeln können Nitrit aber an das Wasser abgeben, wodurch die Gefahr der Selbstvergiftung verringert wird. In Blättern wäre das nicht möglich. Deshalb ist die regulatorische Kontrolle der Nitratreduktion dort besonders wichtig. Da das für die Nitratreduktion erforderliche NADH auch im Dunkeln angeliefert werden kann - beispielsweise durch glycolytischen Abbau von Glucose - ist die Reduktion des Nitrats zu Nitrit auch ohne Photosynthese möglich. Die in den Chloroplasten ablaufende Reduktion des Nitrits und die Assimilierung des NH4+ erfordert hingegen eine Bereitstellung von Reduktionskraft und von ATP, welche während des Tags durch die Photosynthese erfolgt. Eine Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten im Dunkeln durch den dann ablaufenden oxidativen Pentosephosphatweg ist in nur sehr beschränktem Umfang möglich. Um einen Anstau des Nitrits zu vermeiden, muss daher in den Blättern die Nitratreduktion im Dunkeln sehr stark reduziert oder sogar abgeschaltet werden. Diese Beispiele sollen verdeutlichen, wie wichtig es für die Pflanze ist, dass die Nitrat-Reduktase, das Startenzym der Nitratassimilation, in ihrer Aktivität streng reguliert wird.

Die Synthese der Nitrat-Reduktase wird auf der Ebene der Genexpression reguliert
Die Nitrat-Reduktase ist ein außergewöhnlich kurzlebiges Protein, seine Halbwertszeit beträgt nur wenige Stunden. Die Rate der Neusynthese dieses Enzyms ist daher außerordentlich hoch. Somit kann durch eine Regulation seiner Synthese die Aktivität der Nitrat-Reduktase innerhalb von Stunden verändert werden.
Die Synthese des Enzyms wird auf der Ebene der Genexpression durch mehrere Faktoren reguliert: Nitrat und Licht stimulieren die Synthese. Ein Teil des Lichteffekts geht möglicherweise auf durch Photosynthese gebildete Kohlenhydrate zurück und die Transkription der Nitrat-Reduktase wird durch Glucose und andere Kohlenhydrate im Dunkeln stimuliert und durch NH4+, Glutamin und andere Aminosäuren gehemmt (Abb. 10.9).

Welche Metabolite unmittelbar auf die Genexpression einwirken, ist nicht bekannt. Es gibt offenbar Sensoren, die über eine Regulation der Genexpression die Kapazität der Nitrat-Reduktase dem Bedarf an Aminostickstoff und dem Angebot von CO2-Assimilationsprodukten als Kohlenstoffbausteine für die Aminosäuresynthese anpassen.

Die Nitrat-Reduktase wird auch durch reversible kovalente Modifikation reguliert
Die bisher besprochene Regulation der Neusynthese der Nitrat-Reduktase(NR)erlaubt nur eine Regulation der Enzymaktivität im Stundenbereich. Sie würde nicht ausreichen, um im Dunkeln einen Anstau des Nitrits in den Pflanzen zu vermeiden. Eine schnelle Inaktivierung der Nitrat-Reduktase innerhalb von Minuten erfolgt über eine Proteinphosphorylierung (Abb. 10.9). Nach Verdunkeln wird ein Serinrest, welcher sich in dem Nitrat-Reduktase-Protein zwischen der Häm-und der MoCo-Domäne befindet, durch eine Protein-Kinase - die Nitrat-Reduktase-Kinase - phosphoryliert. Diese Protein-Kinase wird durch das Photosyntheseprodukt Triosephosphat und andere Phosphatester gehemmt, und durch Ca2+-Ionen - einem Botenstoff vieler Signalketten (Abschn. 19.1) - stimuliert. Die phosphorylierte Nitrat-Reduktase bindet ein Inhibitorprotein. Dadurch wird der Elektronentransport zwischen Cytochrom b557 und der MoCo-Domäne (Abb. 10.2) unterbrochen und die Nitrat-Reduktase gehemmt. Durch die Nitrat-Reduktase-Phosphatase wird das Serinphosphat des Enzyms hydrolysiert, das Inhibitorprotein löst sich vom Enzym und verliert dadurch seine Wirkung: Das Enzym ist wieder aktiv. Okadainsäure hemmt die Nitrat-Reduktase-Phosphatase, und damit auch die Reaktivierung der Nitrat-Reduktase. Durch Reversibilität der Phosphorylierung des Serinrestes und der Bindung des Inhibitorproteins besteht ein dynamisches Gleichgewicht zwischen der aktiven und der inaktiven Form der Nitrat-Reduktase. Die Hemmung der Nitrat-Reduktase-Kinase durch Triosephosphat und andere Phosphatester bewirkt, dass die Nitrat-Reduktase nur dann aktiv ist, wenn durch die CO2-Fixierung die Kohlenstoffskelette für die in folgendem Abschnitt behandelte Synthese von Aminosäuren bereitgestellt werden.

14-3-3-Proteine sind wichtige Regulatoren des Stoffwechsels
Das Nitrat-Reduktase-Inhibitorprotein gehört zu einer im Tier- und Pflanzenreich weit verbreiteten und hoch konservierten Familie von Regulatorproteinen, den so genannten 14-3-3-Proteinen. 14-3-3-Proteine haben die Eigenschaft, dass sie an eine aus sechs Aminosäuren (Arg-X-X-SerP/ThrP-X-Pro) bestehende spezifische Bindungsstelle des Zielproteins binden, welche in der vierten Position ein Serin- oder Threoninphosphat enthält. Im Falle der Nitratreduktase wurde dies durch ein Experiment bestätigt: Ersetzte man in der 14-3-3-Protein-Bindungsstelle der Nitratreduktase das Serin über eine gezielte Mutagenese durch Alanin, wurde die so veränderte Nitratreduktase durch Phosphorylierung nicht mehr inaktiviert. 14-3-3-Proteine binden an eine Vielfalt von Proteinen und ändern deren Aktivität. 14-3-3 Proteine regulieren in Pflanzen die Aktivität der H+-P-ATPase (Abschn. 8.2) der Plasmamembran. Sie regulieren die Wirkung von Transkriptionsfaktoren (Abschn. 20.2) sowie den Proteinimport in Chloroplasten (Abschn. 21.3). Es gibt Hinweise dafür, dass 14-3-3 Proteine an Signalketten (Abschn. 19.1) beteiligt sind, indem sie an verschiedene Proteinkinasen binden, und eine Rolle bei den Antworten auf biotischen und abiotischen Stress spielen. Die Aufklärung dieser Zusammenhänge ist derzeit ein sehr aktuelles Forschungsgebiet.
Diese allgemeine Bedeutung der 14-3-3 Proteine für die Stoffwechselregulation nutzt der für Pflanzen pathogene Pilz Phomopsis amygdalis (früher: Fusicoccum) für seinen Angriff: Er bildet die Substanz Fusicoccin, welche sich spezifisch an die Komplexe zwischen 14-3-3-Proteinen und verschiedenen von ihnen regulierten Zielproteinen anlagert und damit beide Liganden stabilisiert. So wird durch Fusicoccin die H+-P-ATPase konstant in die aktive Form überführt. Dadurch kann der Stoffwechsel so gestört werden, dass das vom Pilz befallene Pflanzenorgan schließlich abstirbt.

Die Regulation der Nitrat-Reduktase und der Saccharosephosphat- Synthase weisen große Ähnlichkeiten auf
Der hier gezeigte Mechanismus für die Regulation der Nitrat-Reduktase durch Phosphorylierung von Serinresten des Enzymproteins durch spezielle Proteinkinasen und Proteinphosphatasen hat eine auffallende Ähnlichkeit mit der im vorigen Kapitel besprochenen Regulation der Saccharosephosphat-Synthase (siehe Abb. 9.18). Bei beiden Enzymen erfolgt bei Belichtung eine Reaktivierung durch gesteigerte Aktivität der Protein-Phosphatase, und in beiden Fällen wird die Protein-Phosphatase durch Okadainsäure gehemmt. Auch die Saccharosephosphat-Synthase besitzt eine Bindungsstelle für 14-3-3-Proteine, wobei deren Bedeutung für die Regulation des Enzyms noch ungeklärt ist. So spielen 14-3-3-Proteine z.B. bei der Regulation der Saccharosephosphat-Synthase während der Anpassung an geringe Verfügbarkeit von Phosphaten eine Rolle.

10.3 Endprodukt der Nitratassimilation ist die ganze Palette der Aminosäuren
Wie in Kapitel 13 besprochen, werden die als Produkt der CO2-Assimilation gebildeten Kohlenhydrate nur in ganz bestimmten, artspezifischen Transportformen, zum Beispiel als Saccharose, von den Mesophyllzellen über die Siebröhren zu den Verbrauchsorganen exportiert. Für die Produkte der Nitratassimilation gibt es keine derartig speziellen Exportformen. Alle proteinogenen Aminosäuren werden entsprechend ihrer Bildung in den Mesophyllzellen auch von diesen exportiert. Man kann daher bei Wachstum auf Nitrat die Summe aller gebildeten Aminosäuren als Endprodukt der Nitratassimilation betrachten. Die Synthese dieser Aminosäuren findet hauptsächlich in den Chloroplasten statt. Dabei entfällt - je nach Art und nach Stoffwechselbedingungen - auf die einzelnen Aminosäuren ein unterschiedlicher Anteil. Oft haben Glutamat und Glutamin einen hohen Anteil an den gebildeten Aminosäuren. Glutamat wird im Gegentausch mit α-Ketoglutarat und Glutamin im Gegentausch mit Glutamat aus den Chloroplasten ausgeschleust (Abb. 10.6). Auch Serin und Glycin, die beide im Photorespirationsweg als Zwischenprodukte gebildet werden, stellen einen erheblichen Anteil der von den Mesophyllzellen gelieferten Aminosäuren. Alanin wird oft in bestimmten C4 -Pflanzen in größeren Mengen gebildet (Abschn. 8.4).

Die CO2-Assimilation liefert die Kohlenstoffgerüste, die dann in der Endstufe der Nitratassimilation für die Aminosäuresynthese verwendet werden
Für die Synthese der einzelnen Aminosäuren müssen die dazu erforderlichen Kohlenstoffgerüste durch die CO2-Assimilation bereitgestellt werden. Abbildung 10.10 gibt einen Überblick über die Herkunft der Kohlenstoffgerüste der einzelnen Aminosäuren.

Die wichtigste Kohlenstoffquelle für die Synthese der Aminosäuren ist 3-Phosphoglycerat. Es wird im Calvin-Cyclus gebildet und im Gegentausch mit Phosphat durch den Triosephosphat-Phosphat-Translokator aus den Chloroplasten in das Cytosol transportiert (Abb. 10.11). Durch Phosphoglycerat-Mutase und durch Enolase erfolgt eine Umsetzung zu Phosphoenolpyruvat (PEP). Hier verzweigt sich der Weg. Zum einen wird durch die Pyruvat-Kinase Pyruvat gebildet, zum anderen durch die PEP-Carboxylase Oxalacetat. Schließlich ist PEP zusammen mit Erythrose-4-phosphat Ausgangsprodukt für die Synthese von aromatischen Aminosäuren über den im Folgenden behandelten Shikimat-Weg. Da der Shikimat-Weg in den Chloroplasten lokalisiert ist, wird das dazu erforderliche PEP über einen spezifischen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator in die Chloroplasten transportiert.

Die PEP-Carboxylasereaktion wurde bereits im Zusammenhang mit dem Stoffwechsel der Schließzellen (Abschn. 8.2) und dem C4-und CAM-Stoffwechsel (Abschn. 8.4) besprochen. Das gebildete Oxalacetat hat bei der Nitratassimilation zwei Funktionen:
1. Es wird zur Bildung von Aspartat verwendet, einem Ausgangssubstrat für die Synthese von fünf weiteren Aminosäuren (Asn, Thr, Ile, Lys, Met).
2. Zusammen mit Pyruvat ist es Ausgangssubstrat für die Bildung von α-Ketoglutarat, das durch Transaminierung zu Glutamat umgesetzt wird.
Von Glutamat leiten sich drei weitere Aminosäuren (Gln, Arg, Pro) ab.
Das bei der Photorespiration gebildete Phosphoglycolat ist Ausgangssubstanz für die Bildung von Glycin und Serin (siehe Abb. 7.1); Serin ist auch Ausgangsprodukt für die Bildung von Cystein (Kapitel 12). In nicht-grünen Zellen können Serin und Glycin auch aus 3-Phosphoglycerat gebildet werden. Auf Einzelheiten können wir hier aber nicht eingehen. Ribose-5-phosphat ist die Ausgangsverbindung der Histidinsynthese. Dieser Syntheseweg wurde in Pflanzen noch nicht im Detail aufgeklärt.

Die Synthese von Glutamat erfordert eine Beteiligung der Mitochondrien
Wie in Abbildung 10.6 gezeigt wurde, erfordert die Bildung von Glutamat α-Ketoglutarat. An der Bereitstellung des α-Ketoglutarats ist der Stoffwechsel der Mitochondrien beteiligt (Abb. 10.11). Pyruvat und Oxalacetat werden über jeweils spezifische Translokatoren in die Mitochondrien transportiert. Das Pyruvat wird durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex oxidiert (siehe Abb. 5.4), das dabei gebildete Acetyl-CoA kondensiert mit Oxalacetat zu Citrat (siehe Abb. 5.6). Das Citrat kann in den Mitochondrien über die Citratcyclus-Enzyme Aconitase (Abb. 5.7) und eine NAD-Isocitrat-Dehydrogenase (Abb. 5.8) oxidiert, und das dabei gebildete α-Ketoglutarat in das Cytosol exportiert werden. Der Umsatz der mitochondrialen Isocitrat-Dehydrogenase ist jedoch oft relativ gering (in Abb. 10.11 ist er nicht eingezeichnet). Ein Isoenzym der Aconitase und außerdem eine NADP-Isocitrat-Dehydrogenase sind aber im Cytosol vorhanden. Wahrscheinlich beschränkt sich die Mitwirkung der Mitochondrien bei der Bereitstellung von α-Ketoglutarat in erster Linie auf die Bildung von Citrat, das dann außerhalb der Mitochondrien zu α-Ketoglutarat umgesetzt wird. In diesem Fall wäre nur eine kurze Teilsequenz des Citratcyclus beteiligt. Der Export von Citrat erfolgt im Gegentausch mit dem Import von Oxalacetat über den Oxalacetat-Translokator.

Biosynthese von Prolin und Arginin
Glutamat ist Ausgangssubstanz für die Synthese von Prolin (Abb. 10.12). Durch eine Glutamat-Kinase wird zunächst die Δ-Carboxygruppe zu einem energiereichen Phosphorsäureanhydrid umgesetzt. Dann wird die Δ-Carboxygruppe durch NADPH zum Aldehyd reduziert, die dabei erfolgende Abspaltung des energiereichen Phosphats treibt die Reaktion. Es handelt sich prinzipiell um die gleiche Reaktion wie bei der Reduktion des 3-Phosphoglycerats zu Glycerinaldehydphosphat im Calvin-Cyclus. Durch die intramolekulare Kondensation der Carbonylgruppe mit der α-Aminogruppe erfolgt der Ringschluss. Reduktion durch NADPH führt zur Bildung von Prolin.
Neben seiner Funktion als Proteinbaustein hat Prolin auch eine besondere Bedeutung als Schutzsubstanz gegen Austrocknungsschäden der Blätter. Man findet in vielen Pflanzen bei starker Trockenheit oder auch bei einer hohen Salzbelastung des Bodens (in beiden Fällen spricht man von osmotischem Stress) in den Blättern eine sehr hohe Akkumulation von Prolin. Der Prolingehalt, der normalerweise sehr gering ist, kann dann das mehrfache der Summe aller anderen Aminosäuren betragen. Man nimmt an, dass die Akkumulation des Prolins bei Wasserstress auf einer Induktion der Synthese der Pyrrolin-5-carboxylat-Reduktase beruht.

Die Wirkungsweise des Prolins beruht darauf, dass es im Gegensatz zu anorganischen Salzen auch in sehr hohen Konzentrationen Enzyme nicht hemmt. Man bezeichnet Prolin daher auch als eine kompatible Substanz. Andere wichtige kompatible Substanzen sind Betaine, zwitterionische Aminosäuren mit methylierten Aminogruppen. Dazu gehören Prolin-, Glycin- und Alaninbetaine. Weitere kompatible Substanzen sind Zuckeralkohole wie Mannit (Abb. 10.13).

Diese werden jeweils in bestimmten Pflanzen als Reaktion auf Wasserstress gebildet. Durch die Akkumulation dieser kompatiblen Substanzen - insbesondere im Cytosol, den Chloroplasten und den Mitochondrien - wird ein durch Trockenheit oder Salzbelastung des Bodens verursachter Wasserentzug aus diesen Kompartimenten vermieden. Zugleich sind diese Substanzen aber auch an der Eliminierung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) beteiligt. Trockenheit oder Salzbelastung des Bodens führt zu einer Hemmung der CO2-Assimilation und dadurch zu einer erhöhten Bildung von ROS, wodurch Pflanzen geschädigt werden.
Für die Synthese von Arginin wird als erster Schritt die α-Aminogruppe des Glutamats durch Acetyl-CoA acetyliert und dadurch geschützt. Dann wird die Δ-Carboxygruppe phosphoryliert und zum Semialdehyd reduziert, dies erfolgt in prinzipiell gleicher Weise wie bei der Prolinsynthese. Da jetzt aber die α-Aminogruppe geschützt ist, kann kein Ringschluss erfolgen. Die Aldehydgruppe wird durch Transaminierung mit Glutamat in eine Aminogruppe umgewandelt, es entsteht dabei nach Abspaltung des Acetylrestes Ornithin. Die Reaktion von Ornithin zu Argipin (in Abb. 10.12 nur summarisch behandelt) erfolgt analog wie beim Harnstoffcyclus der Tiere durch Kondensation mit aktiviertem Kohlensäureamid (Carbamoylphosphat) zu Citrullin; dieses übernimmt eine Aminogruppe von einem Aspartat, das dabei in Fumarat übergeht, und wird selbst zu Arginin umgesetzt.

Aspartat ist die Vorstufe für fünf Aminosäuren
Aspartat wird aus Oxalacetat durch Transaminierung mit Glutamat durch die Glutamat-Oxalacetat-Aminotransferase gebildet (Abb. 10.14).
Die Synthese von Asparagin aus Aspartat erfordert ebenso wie die Glutaminsynthese eine vorübergehende Phosphorylierung der entständigen Carboxygruppe durch ATP. Im Unterschied zur Glutaminsynthese dient jedoch bei der Asparaginsynthese in der Regel nicht NH4+ als NH2-Donor, sondern die Amidgruppe des Glutamins. Dadurch ist der Energieaufwand für die Amidierung von Aspartat doppelt so hoch wie bei der von Glutamat. In den Blättern spielt die Asparaginsynthese oft eine eher untergeordnete Rolle. In sehr hohem Maße wird Asparagin in den Wurzeln gebildet, insbesondere wenn NH4+ die Stickstoffquelle im Boden ist (siehe Abschn. 10.2).

Für die Synthese von Lysin, Isoleucin, Threonin und Methionin sind die ersten beiden Schritte prinzipiell die gleichen wie bei der Prolinsynthese:
Nach Phosphorylierung durch eine Kinase wird die y-Carboxygruppe zu einem Semialdehyd reduziert. Für die Synthese von Lysin (in Abb. 10.14 nicht im Detail gezeigt) kondensiert der Semialdehyd mit Pyruvat. In einer Folge von sechs Reaktionen wird nach Reduktion durch NADPH und Transaminierung durch Glutamat meso-2,6-Diaminopimelat gebildet, aus diesem entsteht durch Decarboxylierung Lysin.
Für die Synthese von Threonin wird der Semialdehyd weiter zum Alkohol reduziert, das Produkt ist Homoserin. Nach Phosphorylierung der Hydroxygruppe durch die Homoserin-Kinase erfolgt bei gleichzeitiger Abspaltung des Phosphats durch Isomerisierung der Hydroxygruppe die Bildung von Threonin. Die Synthese von Isoleucin aus Threonin wird im folgenden Abschnitt (Abb. 10.16B), die Synthese von Methionin im Zusammenhang mit der Besprechung des S-Stoffwechsels in Kapitel 12 behandelt.
Die Synthese von Aminosäuren aus Aspartat unterliegt einer starken Rückkopplungskontrolle durch die Endprodukte (Abb. 10.15).

Die Aspartat-Kinase als Startventil für die Synthesewege liegt in zwei Isoformen vor. Eine wird durch Threonin und die andere durch Lysin gehemmt. Zusätzlich werden an der Verzweigungsstelle der beiden Reaktionswege jeweils die Startreaktionen des Aspartatsemialdehyds durch die jeweiligen Endprodukte gehemmt.

Die Acetolactat-Synthase ermöglicht die Synthese von hydrophoben Aminosäuren
Durch Transaminierung kann Pyruvat zu Alanin reagieren (Abb. 10.16A). Diese Reaktion hat eine besondere Bedeutung in zwei Ausprägungen des C4 -Stoffwechsels (siehe Abb. 8.14 und Abb. 8.15).
Die Synthese von Valin und Leucin beginnt mit der Bildung von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat. Die Acetolactat-Synthase (ALS), die diese Reaktion katalysiert, enthält als prosthetische Gruppe Thiaminpyrophosphat (TPP), das in gleicher Weise wie bei der Pyruvat-Dehydrogenase (siehe Abb. 5.4) mit Pyruvat unter Abspaltung von CO2 Hydroxyethyl-TPP bildet. Letzteres überträgt den Hydroxyethylrest auf ein zweites Molekül Pyruvat, dabei entsteht Acetolactat. Durch Reduktion, Umlagerung und Wasserabspaltung entsteht α-Ketoisovalerat und bei der nachfolgenden Transaminierung durch Glutamat Valin.

Die Bildung des Leucins aus α-Ketoisovalerat erfolgt in den prinzipiell gleichen Reaktionsschritten wie die in Abbildung 5.3 gezeigte Bildung von Glutamat aus Oxalacetat. Zunächst kondensiert Acetyl-CoA mit α-Ketoisovalerat(analog zur Bildung von Citrat), das Produkt α-lsopropylmalat isomerisiert(analog zur Isocitratbildung), das so entstandene ß-Isopropylmalat wird unter Abspaltung von CO2 durch NAD+ zu α-Ketoisocapronat (analogzur lsocitrat-Dehydrogenasereaktion) oxidiert und letzteres zu Leucin transaminiert.
Für die Synthese von Isoleucin aus Threonin wird dieses zunächst durch eine Desaminase in α-Ketobutyrat umgewandelt (Abb. 10.16B). Acetolactat-Synthase kondensiert α-Ketobutyrat mit Pyruvat in analoger Weise wie bei der Synthese von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat in (Abb. 10.16A). Die weiteren Reaktionsschritte bis zum Isoleucin entsprechenden Reaktionsschritten bei der Synthese von Valin.

Auch die Synthesen von Leucin, Valin und Isoleucin unterliegen einer Kontrolle durch die Endprodukte (Abb. 10.17).

Die Isopropylmalat-Synthase wird durch Leucin gehemmt, die Threonin-Desaminase durch Isoleucin (Abb. 10.15). Das Startenzym Acetolactat-Synthase (ALS) wird durch Valin und Leucin gehemmt. Sehr starke Inhibitoren der ALS sind Sulfonylharnstoffe, wie Chlorsulfuron, und Imidazolinone, zum Beispiel Imazethapyr (Abb. 10.18).

Diese Hemmstoffe binden an die ALS. Bereits eine Chlorsulfuronkonzentration von 10+ mol/L ist ausreichend, um die ALS zu 50 % zu hemmen. Da es den Syntheseweg für die Bildung von Valin, Leucin und Isoleucin nur in Pflanzen und Mikroorganismen gibt, eignen sich die beiden genannten Hemmsubstanzen, um gezielt Pflanzen abzutöten; man verwendet sie daher als Herbizide Abschn. 3.6. Chlorsulfuron (Handelsbezeichnung Glean, DuPont) wird als selektives Herbizid für den Anbau von Getreide verwendet, Imazethapyr (Pursuit, American Cyanamide Co.) für den Anbau von Sojabohnen. Einige natürlich entstandene Mutanten von Mais, Sojabohne, Raps und Weizen sind gegen Sulfonylharnstoffe, Imidazolinone oder auch gegenüber beiden Herbiziden resistent. Man fand dabei stets Mutationen in dem Gen für die Acetolactat-Synthase, wodurch das Enzym, ohne in seiner Aktivität beeinflusst zu sein, gegenüber den genannten Herbiziden unempfindlich wird. Durch Einkreuzen dieser Mutationen wurden von den genannten Pflanzen herbizidresistente Sorten gezüchtet und sind zum Teil bereits im Anbau.

Über den Shikimatweg werden aromatische Aminosäuren synthetisiert
Vorläufer für die Bildung aromatischer Aminosäuren sind Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat. Die beiden Substanzen kondensieren unter Abspaltung der beiden Phosphate zu dem cyclischen Dehydrochinat (Abb. 10.19).

Nach Abspaltung von Wasser und Reduktion der Carbonylgruppe entsteht Shikimat. Nach Schutz der 3'-Hydroxygruppe durch Phosphorylierung wird die 5'-Hydroxygruppe mit Phosphoenolpyruvat zu dem Enolether 5'-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat (EPSP) verknüpft, aus dem durch Abspaltung von Phosphat Chorismat entsteht. Hier verzweigt sich der Weg:
• Über vier hier nicht in Detail behandelten Reaktionen wird Tryptophan gebildet.
• Durch eine Umlagerung, bei der die Seitenkette in die 1'-Position des Ringes verlagert wird, entsteht Prephenat und nach Transaminierung der Ketogruppe Arogenat. Durch Abspaltung von Wasser, die zur Bildung der dritten Doppelbindung führt, und eine Decarboxylierung wird aus Arogenat Phenylalanin gebildet. Die Oxidation des Arogenats durch NAD+ bei gleichzeitiger Decarboxylierung führt zur Bildung von Tyrosin. Die Enzyme des Shikimatweges sind nach neueren Ergebnissen ausschließlich in Plastiden lokalisiert.
Auch die Synthese der aromatischen Aminosäuren wird durch die Endprodukte an verschiedenen Schritten des Syntheseweges kontrolliert (Abb. 10.20).

Glyphosat wirkt als Herbizid
Glyphosat (Abb. 10.18) ist ein sehr starker Hemmer der EPSP-Synthase. Wegen seiner ähnlichen Struktur hemmt es kompetitiv zu Phosphoenolpyruvat. Glyphosat wirkt relativ spezifisch auf den Aromatenstoffwechsel, aber nur schwach auf andere Enzyme, die Phosphoenolpyruvat umsetzen (z.B. Pyruvat-Kinase und PEP-Carboxykinase). Eine Unterbrechung des Shikimatweges durch Glyphosat wirkt für die Pflanzen letal. Bei Tieren gibt es keinen Shikimatweg. Daher wird Glyphosat (unter dem Handelsnamen Round up, Monsanto) als Herbizid (Abschn. 3.6) verwendet. Glyphosat hat den Vorteil, dass es aufgrund seiner einfachen Struktur relativ schnell durch Bodenbakterien abgebaut wird. Von allen Herbiziden erzielt Glyphosat wertmäßig den höchsten Umsatz weltweit. Es ist gelungen, durch molekulargenetische Veränderungen Nutzpflanzen gegen Glyphosat resistent zu machen in (siehe Kapitel 22) behandelt. Es ist so möglich, durch Glyphosat Unkräuter besonders wirksam auch in Gegenwart von Nutzpflanzen zu bekämpfen. Glyphosat schädigt symbiontische Bakterien in Insekten


Ein großer Teil der Pflanzensubstanz wird über den Shikimatweg gebildet
Die Bedeutung des Shikimatweges liegt nicht allein in der Bereitstellung von Aminosäuren für die Proteinsynthese, sondern auch für die Synthese einer großen Vielfalt anderer Substanzen (Abb. 10.21), die von Pflanzen in großen Mengen gebildet werden (siehe Kapitel 16 und 18), insbesondere Phenylpropanoide wie Flavonoide und Lignin. Da die Summe dieser Produkte einen hohen Anteil an der Zellsubstanz ausmacht - gewöhnlich entspricht dies einem Viertel bis einem Drittel der Trockenmasse, kann aber bei manchen Bäumen bis zu 50% sein - ist der Shikimatweg einer der Hauptbiosynthesewege der Pflanzen.


10.4 Glutamat ist Ausgangssubstanz für die Synthese von Chlorophyllen und Cytochromen
Chlorophyll macht ein bis zwei Prozent der Trockensubstanz der Blätter aus. Seine Synthese erfolgt in den Plastiden. Wie bereits in Abbildung 2.4 gezeigt, besteht Chlorophyll aus einem Tetrapyrrolring mit Magnesium als Zentralatom und mit einer Phytolseitenkette als hydrophoben Membrananker. Ebenfalls ein Tetrapyrrol, aber mit Fe2+ als Zentralkation, ist Häm, ein Bestandteil von Cytochromen und auch der Katalase.
Baustein für die Synthese von Tetrapyrrolen ist Porphobilinogen, das durch Kondensation von zwei Molekülen δ-Aminolävulinat gebildet wird. In Tieren, Hefen und manchen Bakterien wird Δ-Aminolävulinat aus Succinyl-CoA und Glycin unter Abspaltung von CoASH und CO2 synthetisiert. Hingegen wird in Plastiden, Cyanobakterien und vielen Eubakterien δ-Aminolävulinat durch Reduktion von Glutamat gebildet. Wie bereits in Abschnitt 6.3 besprochen, ist die Redoxpotenzialdifferenz zwischen einem Carboxylat und einem Aldehyd so hoch, dass eine Reduktion der Carboxygruppe durch NADPH nicht möglich ist, es sei denn, diese Carboxygruppe wird zuvor aktiviert, zum Beispiel als Thioester (Abb. 6.10) oder als gemischtes Phosphatanhydrid (Abb. 10.12). Bei der plastidären δ-Aminolävulinatsynthese wird Glutamat auf sehr ungewöhnliche Weise durch kovalente Bindung an eine Transfer-RNA (tRNA) aktiviert (Abb. 10.22). Diese tRNA für Glutamat wird in den Plastiden codiert und ist dort sowohl an der δ-Aminolävulinat- als auch der Proteinbiosynthese beteiligt. Wie bei der Beladung für die Translation erfolgt die Bindung der tRNA an die Carboxygruppe des Glutamats unter Verbrauch von ATP. Bei der Reduktion der Glutamat-tRNA durch die Glutamat-tRNA-Reduktase wird die tRNA abgespalten; dadurch ist die Reaktion irreversibel. Der dabei entstandene Glutamat-1-semialdehyd wird durch eine Aminotransferase, die Pyridoxal- beziehungsweise Pyridoxaminphosphat als prosthetische Gruppe enthält, in δ-Aminolävulinat umgewandelt. Diese Reaktion verläuft nach dem gleichen Mechanismus wie die in Abbildung 7.4 gezeigte Aminotransferasereaktion, mit dem einzigen Unterschied, dass hier der Aminodonor und die Ketogruppe als Aminoakzeptor im gleichen Molekül vorhanden sind.

Zwei Moleküle δ-Aminolävulinat kondensieren zu Porphobilinogen (Abb. 10.22). Durch die Hydroxymethylbilan-Synthase werden vier Moleküle Porphobilinogen zu dem offenkettigen Tetrapyrrol Hydroxymethylbilan verknüpft (Abb. 10.23).

Das Enzym enthält als Cofaktor ein Dipyrrol, das es selbst synthetisiert. Nach Austausch der beiden Seitenketten am Ring "d" ergibt der Ringschluss Uroporphyrinogen III. Daraus entsteht mittels einer Decarboxylase und zwei Oxidasen Protoporphyrin IX. Durch Magnesium-Chelatase wird Mg2+ in den Tetrapyrrolring eingebaut; das Mg-Protoporphyrin IX wird durch drei weitere Enzyme zu Protochlorophyllid umgesetzt (Abb. 10.24).

Der Tetrapyrrolring des Protochlorophyllids besitzt genausoviele Doppelbindungen wie Protoporphyrin IX. Die Reduktion einer Doppelbindung im Ring "d" durch NADPH ergibt Chloropbyllid. Das Enzym Protochloropbyllid-Reduktase, die diese Reaktion katalysiert, ist nur aktiv, wenn das Protochlorophyllid durch Absorption von Licht aktiviert wird. Die Übertragung einer durch Pyrophosphat aktivierten Phytylkette durch eine als Chlorophyll-Synthetase bezeichnete Prenyltransferase (siehe Abschn. 17.2) schließt die Synthese des Chlorophylls ab.
Wegen der Lichtabhängigkeit der Protochlorophyllid-Reduktase werden Keime von Angiospermen erst dann grün, wenn sie direkt dem Licht ausgesetzt werden. Auch die Synthese der chlorophyllbindenden Proteine der Lichtsammelkomplexe ist lichtabhängig. Gymnospermen, Grünalgen, Moose und Farne besitzen zusätzlich noch eine im Dunkeln aktive Protochlorophyll-Reduktase, sodass sowohl die Protochlorophyllid-Reduktion als auch die Synthese der chlorophyllbindenden Proteine im Dunkeln erfolgen.
Porphyrine werden im Licht photooxidiert; dies führt zu photochemischen Zellschädigungen. Es ist daher für die Pflanze wichtig, dass sich Intermediate der Chlorophyllsynthese nicht anstauen. Dies wird zum einen dadurch vermieden, dass die Synthese des δ-Aminolävulinats über eine schnelle posttranslationelle Suppression reguliert wird. Zum anderen unterliegt die δ-Aminolävulinatsynthese einer Endprodukthemmung durch Chlorophyllid und Häm. Die Regulation der Chlorophyllsynthese ist in (Abb. 10.24) zusammengefasst. Schließlich ist Chlorophyll b für den Einbau verschiedener Antennenproteine in die Antennen notwendig (Abschnitt 2.4).

Protoporphyrin ist auch Ausgangssubstanz für die Hämsynthese
Der Einbau eines Eisenions in das Protoporphyrin IX durch die Ferro-Chelatase führt zur Bildung des Häms. Durch Zusammenbau des Häms mit Apoproteinen werden in Chlororoplasten Cytochrome und Phytochrome gebildet. Die Hämsynthese findet aber auch in den Mitochondrien statt. Nach dem heutigen Erkenntnisstand wird das Häm für die mitochondrialen Cytochrome in den Mitochondrien gebildet, während die plastidäre Hämsynthese nicht nur für die Versorgung der Plastiden, sondern wahrscheinlich auch für die Bereitstellung von Häm für die Bildung cytosolischer Häm-Proteine zuständig ist.nach oben zum Kapitelanfang

11 Durch N2-Fixierung kann der Luftstickstoff für das Pflanzenwachstum genutzt werden
In einem geschlossenen Ökosystem stammt das für das Pflanzenwachstum erforderliche Nitrat aus dem Abbau der Biomasse. Nitrat kann, im Gegensatz zu anderen Pflanzennährstoffen wie Phosphat, nicht durch eine Verwitterung von Gesteinen nachgeliefert werden. Kleinere Mengen von Nitrat werden durch Blitze erzeugt und mit dem Regenwasser eingetragen (in unseren Breiten jährlich circa 5 kg N/ha). Durch menschliche Einflüsse (Autoverkehr, Massentierhaltung etc.) kann heute der jährliche Eintrag von Nitrat, anderen Stickoxiden und NH3 durch das Regenwasser je nach Verschmutzungsgrad der Luft zwischen 15 bis 70 kg N/ha betragen. Bei der landwirtschaftlichen Produktion muss der durch die Entnahme der Ernteprodukte verursachte Stickstoffverlust durch Düngung ausgeglichen werden. So werden zum Beispiel beim Maisanbau etwa jährlich 200 kg N/ha in Form von Nitrat- und Ammoniumdünger eingebracht. Als Ausgangsstoff wird dafür Ammoniak durch die Haber-Bosch-Synthese aus Stickstoff und Wasserstoff hergestellt:

Wegen der hohen Bindungsenergie der N≡N-Dreifachbindung hat diese Synthese eine hohe Aktivierungsenergie, sie wird daher trotz Katalysator bei 400 bis 500°C und bei einem Druck von mehreren hundert Atmosphären durchgeführt. Sie ist somit sehr energieaufwändig. Daher entfallen etwa ein Drittel der für den landwirtschaftlichen Anbau von Mais auf gewendeten Energie auf die Herstellung des erforderlichen Stickstoffdüngers. Ohne die Gewinnung von Stickstoffdünger durch die Haber-Bosch-Synthese könnten heute große Teile der Weltbevölkerung nicht mehr ernährt werden. Während bei einer "biologischen" Kreislauf-Landwirtschaft etwa 10 Personen von dem Ertrag von 1 ha landwirtschaftlicher Fläche ernährt werden können, ist dieser Wert bei der Verwendung von Stickstoff-Kunstdünger um das Vierfache höher.
Nur Cyanobakterien und einige Bakterien können aus dem Stickstoff der Luft NH3 bilden. Eine Reihe von Pflanzen gehen mit N2-fixierenden Bakterien Symbiosen ein, um sich auf diese Weise mit Stickstoff zu versorgen. Als Gegenleistung übernehmen die Pflanzen die Ernährung der Bakterien. Wichtig für die Landwirtschaft ist dabei die Symbiose von Leguminosen mit den Knöllchenbakterien (Rhizobien). Leguminosen, zu denen unter anderen Sojabohne, Bohne, Linse, Erbse, Klee und Lupine gehören, bilden eine sehr große Familie mit etwa 20.000 Spezies. Ein sehr großer Teil der Leguminosen können eine Symbiose mit Rhizobien eingehen. Durch Leguminosen kann in unseren Klimaten eine N2-Fixierung von 100 bis 400 kg N/ha pro Jahr erzielt werden. Daher haben Leguminosen als Gründünger eine große Bedeutung: Beim Fruchtwechsel sind sie eine ausgezeichnete Alternative zum Kunstdünger. Für die Stickstoffversorgung von Reisfeldern ist die Symbiose des Wasserfarns Azolla mit dem Cyanobakterium Nostoc von Bedeutung. Erwähnt sei auch die Symbiose der Gattung Frankia mit Gehölzen wie der Erle, oder auch der australischen Casuarina, die als Pionierpflanze auf stickstoffarmen Böden wächst.

11.1 Leguminosen bilden eine Symbiose mit Knöllchenbakterien
Die Wurzelknöllchen der Leguminosen (Abb. 11.1) wurden zunächst als Zeichen eines Krankheitsbefalls der Pflanze angesehen, bis sie von H. Hellriegel und H. Wilfarth 1888 mit der N2 -Fixierung in Verbindung gebracht wurden. Sie erkannten, dass Bohnen bei Vorhandensein dieser Knöllch:en auch ohne Stickstoffdüngung wachsen können.
Zu den Knöllchenbakterien zählen unter anderem die Gattungen Rhizobium, Bradyrhizobiurm und Azorhizobium. Arten der Gattung Rhizobium bilden Knöllchen unter anderem mit Erbsen, Bradyrhizobium mit der Sojabohne und Azorhizobium mit der tropischen Leguminose Sesbania. Es handelt sich um streng aerobe, Gram-negative Stäbchen, die im Boden leben und mit organischen Verbindungen heterotroph wachsen. Es gibt aber auch Stämme die autotroph durch Photosynthese wachsen können.

Phylogenetische Untersuchungen haben gezeigt, dass alle zur Wurzelknöllchen-Symbiose befähigten Pflanzen zu einer bestimmten Klade (Evolutionszweig) gehören, bestehend aus den Ordnungen Fabales, Fagales, Curcubitales und Rosales. Alle Vertreter dieser Klade lassen sich auf einen gemeinsamen Vorläufer zurückführen. Allerdings bilden nicht alle Abkömmlinge diese Wurzelknöllchen-Symbiose aus. Es wird danach gesucht, welches die Gene sind, die in diesen Pflanzen die Wurzelknöllchen-Symbiose ermöglichen. Man hofft durch einen gentechnischen Transfer dieser Gene in monokotyle Agrarpflanzen, wie z.B. Mais, Reis und Weizen, diese zur Wurzelknöllchen Symbiose zu befähigen.
Die Aufnahme der Rhizobien in die Wirtspflanze stellt eine kontrollierte Infektion dar. Die molekulare Basis von Spezifität und Erkennung ist bisher nur teilweise bekannt. Die Rhizobien bilden artspezifische Nodulationsfaktoren (Nod-Faktoren). Es handelt sich dabei um Lipochitooligosaccharide, Chitin-Oligomere mit einer Fettsäure am nicht-reduzierenden Ende. Durch die verschiedensten chemischen Dekorationen wie Acetylierung, Sulfatierung und Fukosylierung erreichen sie eine hohe strukturelle Spezifität. Wie ein vielzackiger „Schlüssel" schließen sie das „Haus" desjenigen Wirts auf, für den die Rhizobien spezialisiert sind. Die Nod-Faktoren binden an spezifische Rezeptorkinasen des Wirts, welche Teil einer Signalkette sind (Abschn. 19.1). Die Rhizobien dringen in den meisten Fällen über die Wurzelhaare in die Wurzel ein. Die Erkennung der Nod-Faktoren führt bei wachsenden Wurzelhaaren zu Wachstumsstopp und Reinduktion von Wachstum mit Richtungsänderung. Wenn sich ein Rhizobium an die Wurzelhaarspitze angelagert hat, kann es dabei von einer Krümmung des Wurzelhaars eingeschlossen werden. Dann kommt es zur Bildung eines Infektionsschlauchs (Abb. 11.2) im gekrümmten Wurzelhaar, der in Richtung Wurzelkortex wächst und durch den die Rhizobien in die Wurzel eindringen können.

Währenddessen werden durch die Nod-Faktoren in der Wurzelrinde Zellteilungen induziert, die im Endeffekt zur Entstehung eines neuen Organs, eines Knöllchens führen. Dessen Morphogenese ist von ähnlicher Komplexität wie die aller anderen Pflanzenorgane, wie Wurzel oder Spross. Die Knöllchen sind durch Leitgefäße mit der Wurzel verbunden und werden so mit Substrat versorgt. Aus der Plasmamembran der infizierten Zelle wird die Peribakteroidmembran gebildet, welche die in die Pflanzenzelle auf genommenen Bakterien umgibt. Dadurch sind die Rhizobien in einem Symbiosom vom Cytoplasma der Wirtszelle abgetrennt. Im Symbiosom differenzieren sich die Rhizobien zu Bakteroiden. Meist sind mehrere dieser Bakteroide von einer Peribakteroidmembran (auch als Symbiosomenmembran bezeichnet) umgeben (Abb. 11.3).

Die Rhizobien besitzen eine Atmungskette, die prinzipiell wie die mitochondriale Atmungskette aufgebaut ist (siehe Abb. 5.15). Bei einer Bradyrhizobium-Art wurde gefunden, dass bei der Differenzierung zu Bakteroiden ein zusätzlicher Elektronentransportweg exprimiert wird. Er zweigt beim Cytbc1-Komplex von der zum Cyt-aa3 führenden Atmungskette ab zu einer anderen terminalen Oxidase, die eine erhöhte Atmungsrate ermöglicht. Dieser Teil der Atmungskette wird durch symbiosespezifische Gene codiert.

Die Knöllchenbildung beruht auf einem regulierten Zusammenspiel der Expression spezifischer bakterieller und pflanzlicher Gene
Zur Symbiose fähige Rhizobien enthalten eine große Anzahl von Genen, die bei den frei lebenden Bakterien ausgeschaltet sind und erst nach einer Wechselwirkung mit dem Wirt aktiviert werden und so zur Bildung eines N2-fixierenden Wurzelknöllchens beitragen. Die bakteriellen Gene für die Proteine zur N2-Fixierung werden als nif- und fix-Gene bezeichnet, die zur Induktion der Bildung der Wurzelknöllchen als nod-, nol- und noe-Gene.
Die Wirtspflanze scheidet verschiedene Flavenoide aus (siehe Abschn.18.5), die als Signalsubstanzen zur chemotaktischen Anlockung der Rhizobien dienen. Diese Flavonoide binden an ein bakterielles Protein, welches die Transkription der anderen nod-, nol- and noe-Gene aktiviert. Die durch diese nod-Gene codierten Proteine sind an der Synthese der bereits erwähnten Nod-Faktoren beteiligt. In fast allen Rhizobien sind vier so genannte „allgemeine" nod-Gene vorhanden, nodD und nodABC. Letztere codieren für die Proteine, die das Chitin-Oligomer mit der Fettsäure am nicht-reduzierenden Ende herstellen, das allen Nod-Faktoren gemeinsam ist. Darüber hinaus sind mehr als zwanzig verschiedene nod-Gene bekannt, die für die Wirtsspezifität verantwortlich sind.
Die speziell für die Knöllchenbildung notwendigen Proteine, die im Verlauf der Organbildung von den Wirtspflanzen synthetisiert werden, fasst man unter der Sammelbezeichnung Noduline zusammen. Zu diesen Nodulinen zählen das in Abschnitt 11.2 beschriebene Leghämoglobin, Enzyme des Kohlenhydratabbaus (darunter auch die Saccharose-Synthase, siehe Abschn. 9.2), Enzyme des Citratcyclus, der Glutamin-, Asparagin- und gegebenenfalls auch der Ureidsynthese sowie ein Aquaporin der Peribakteroidmembran (siehe folgender Abschnitt). Es handelt sich dabei um Proteine die zur normalen Ausstattung der Wurzeln gehören, aber bei der Knöllchenbildung vermehrt gebildet werden. Die pflanzlichen Gene zur Bildung dieser Proteine werden Nodulingene genannt. Man unterscheidet dabei so genannte "frühe" Noduline, die am Infektionsprozess und der Bildung der Knöllchen beteiligt sind. Die Expression der entsprechenden Gene wird unter anderem durch Signalsubstanzen von den Rhizobien induziert. "Späte" Noduline werden erst nach dem Einsetzen der symbiotischen N2-Fixierung synthetisiert.

Zwischen Bakteroiden und Wirtszelle findet ein Austausch von Stoffwechselprodukten statt
Die Versorgung der Bakteroide mit Substrat erfolgt vielfach über einen Transport von Malat (Abb. 11.4). Dieses entsteht in der Wirtszelle durch die Spaltung der durch die Leitgefäße angelieferten Saccharose durch die Saccharose-Synthase (Abb. 13.5), die dann weiter glycolytisch zu Phosphoenolpyruvat abgebaut wird, nachfolgend zu Oxalacetat carboxyliert (siehe Abb. 10.11) und schließlich zu Malat reduziert wird. Knöllchenzellen enthalten hohe Aktivitäten der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase. Als Produkt der N2-Fixierung liefern die Bakteroide über einen spezifischen Transporter der Peribakteroidmembran der Wirtszelle NH4+, das dort vor allem zu Glutamin (Abb. 10.8) und Asparagin (Abb. 10.14) umgesetzt und über die Xylemgefäße der Pflanze zur Verfügung gestellt wird. Inzwischen ist auch ein zusätzlicher Export von Alanin aus Bakteroiden nachgewiesen worden.

Die Knöllchen mancher Pflanzen, zum Beispiel die von Sojabohnen, exportieren den fixierten Stickstoff in Form von Ureiden (Harnsäureabbauprodukten), insbesondere als Allantoin und Allantoat (Abb. 11.5). Diese Substanzen haben - bezogen auf den Kohlenstoffgehalt - einen besonders hohen Stickstoffgehalt. Die Bildung der Ureide in den Wirtszellen erfordert einen langen Syntheseweg, der nur in infizierten Zellen stattfindet. Zunächst wird über den in allen Zellen zur Synthese von AMP und GMP vorhandenen Purinsyntheseweg Inosinmonophosphat gebildet, welches im Anschluss über Xanthin und Harnsäure zu den Ureiden abgebaut wird. Das in die Bakteroide aufgenommene Malat (Abb. 11.4) wird durch den Citratcyclus (Abb. 5.3) oxidiert, die dabei anfallenden Reduktionsäquivalente werden zur Fixierung des N verwendet.


Die Dinitrogenase-Reduktase liefert Elektronen für die Dinitrogenasereaktion
Die Stickstofffixierung erfolgt im Nitrogenasekomplex, einem hochkomplexen System mit den Hauptkomponenten Dinitrogenase-Reduktase und Dinitrogenase (Abb. 11.6). Dieser Komplex ist hochkonserviert und im Cytoplasma der Bakteroide vorhanden. Aus dem im Citratcyclus gebildeten NADH werden unter Vermittlung eines löslichen Ferredoxins Elektronen auf die Dinitrogenase-Reduktase übertragen. Diese ist ein Ein-Elektronen-Überträger und besteht aus zwei identischen Untereinheiten, die gemeinsam ein 4Fe-4S-Zentrum (siehe Abb. 3.26) bilden und zwei Bindungsstellen für ATP besitzen. Nach der Reduktion binden zwei Moleküle ATP an die Dinitrogenase-Reduktase; dies führt zu einer Konformationsänderung des Proteins, wodurch das Redoxpotenzial des 4Fe-4S-Zentrurns von -0,25 auf -0,40 V angehoben wird. Nach Übertragung eines Elektrons auf die Dinitrogenase werden die zwei am Protein gebundenen ATP-Moleküle zunächst in ADP und Phosphat gespalten und dann wieder abgelöst. Dadurch wird die Konformation mit dem niedrigeren Redoxpotenzial wiederhergestellt, und das Enzym kann wieder ein Elektron vom Ferredoxin aufnehmen. Auf diese Weise wird durch die Dinitrogenase-Reduktase unter Verbrauch von zwei Molekülen ATP jeweils ein Elektron vorn NADH auf die Dinitrogenase übertragen.


Durch die Dinitrogenase werden sowohl N als auch H+ reduziert
Die Dinitrogenase ist ein α2ß2-Tetramer. Die Untereinheiten α und ß sind fast gleich groß und auch ähnlich gefaltet. Das Tetramer enthält zwei wahrscheinlich unabhängig voneinander reagierende katalytische Zentren, von denen jedes einen so genannten P-Cluster enthält, der aus jeweils zwei 4Fe-4S-Zentren sowie einem Eisen-Molybdän-Cofaktor (FeMoCo) besteht. Der FeMoCo ist ein großes Redoxzentrurn aus Fe4S3 und Fe3MoS3, die über drei anorganische Sulfidbrücken miteinander verknüpft sind (Abb. 11.7).

Ein Bestandteil des Cofaktors ist Homocitrat, das über je ein Sauerstoffatom der Hydroxy- und der Carboxygruppe an das Molybdän gebunden ist. Ein weiterer Ligand des Molybdäns ist der Imidazolring eines Histidinrestes des Proteins. Die Funktion des Mo-Atoms ist ungeklärt. Es gibt alternative Dinitrogenasen, bei denen das Mo durch Vanadium oder auch• durch Fe ersetzt ist. Diese sind im Vergleich zu der FeMoCo-haltigen Dinitrogenase jedoch deutlich instabiler. Möglicherweise wird durch das Mo-Atom eine günstigere Geometrie und Elektronenstruktur des Zentrums erreicht. Es ist nicht geklärt, wie der Stickstoff mit dem Eisen-Molybdän-Cofaktor reagiert. Möglicherweise wird das Nr Molekül im Hohlraum des FeMoCo-Zentrums gebunden (Abb. 11.7) und die für die N2 Fixierung erforderlichen Elektronen durch den P-Cluster in das FeMoCo-Zentrum übertragen.
Die Dinitrogenase kann neben N2 auch andere Substrate reduzieren: So werden Protonen zu molekularem Wasserstoff reduziert:

In Gegenwart von N2 wird pro reduziertem N2 mindestens ein H2 gebildet, häufig aber mehr.

Demnach beträgt die Bilanz der N2-Fixierung:

Ist Acetylen in genügend hohen Konzentrationen vorhanden, wird ausschließlich Acetylen zu Ethylen reduziert:

Man benutzt diese Reaktion zur Messung der Aktivität der Dinitrogenase. Warum bei der N2-Fixierung stets auch H2 entwickelt wird - ob dies Teil des katalytischen Mechanismus, eine Nebenreaktion oder eine Reaktion zum Schutz des aktiven Zentrums vor der hemmenden Wirkung des Sauerstoffs, die im folgenden Abschnitt beschrieben wird, darstellt - ist umstritten. In einem Kleefeld lässt sich die Entstehung des bei der N2-Fixienmg gebildeten molekularen Wasserstoffs nachweisen. Da jedoch viele Rhizobienstämme Hydrogenasen besitzen, wird das H2 in diesen über einen Elektronentransport wieder oxidiert.

In manchen Fällen ist diese Reaktion wie in den sogenannten Knallgasbakterien mit einer ATP-Gewinnung gekoppelt.

11.2 Die N2Fixierung kann nur bei sehr niedrigen Sauerstoffkonzentrationen erfolgen
Die Dinitrogenase ist extrem sauerstoffempfindlich. Daher kann die N2-Fixierung nur bei sehr niedrigen 02-Konzentrationen ablaufen. Die Bildung der Knöllchen führt dazu, dass für die N2-Fixierung ein mikroaerobes Kompartiment entsteht. Da die N2-Fixierung auf eine Zufuhr von Stickstoff aus der Luft angewiesen ist, stellt sich die Frage, wie das Enzym vor dem gleichfalls vorhandenen Luftsauerstoff geschützt wird.
Das in die Knöllchen mit dem N2 eindiffundierte 2 wird durch die in der Bakteroidenmembran vorhandene Atmungskette verbraucht. Durch eine hohe Affinität des bakteroiden Cytochrom-a/a3-Komplexes ist eine Atmung bei einer O2-Konzentration von nur 109 mol/L möglich. Wir haben gesehen, dass für die Fixierung von einem Molekül N2 insgesamt 16 Moleküle ATP erforderlich sind. In der mitochondrialen Atmungskette werden bei der Oxidation von einem Molekül NADH etwa 2,5 Moleküle ATP gewonnen (Abschn. 5.6). Bei der bakteriellen Atmungskette, die im Allgemeinen einen niedrigeren Kopplungsgrad hat als die der Mitochondrien, werden entsprechend nur etwa 2 ATP gebildet. Demnach würden für die Bildung von 16 ATP etwa 4 Moleküle 2 verbraucht (Abb. 11.8). Wenn die Bakteroide eine Hydrogenase besitzen, würde sich der Sauerstoffverbrauch durch die Oxidation des bei der N2-Fixierung gebildeten H2 noch um 0,5 02 erhöhen. Man erkennt daraus, dass bei der N2-Fixierung für jedes N2-Molekül mindestens vier O2Moleküle in der bakteriellen Atmung verbraucht werden (02/N2 größer oder =4). Dagegen beträgt das 02/N2-Verhältnis in der Luft etwa 0,25. Die für die N2-Fixierung erforderliche Luft weist also im Verhältnis zum Stickstoff viel zu wenig Sauerstoff auf.

Die äußere Schicht der Knöllchen bildet in erheblichem Maße ein Diffusionshindernis für die eintretende Luft. Der Diffusionswiderstand ist so groß, dass die Zufuhr des Sauerstoffs die Atmung limitiert. So kommt es zu der auf den ersten Blick erstaunlichen Situation, dass die N2-Fixierung durch die Zufuhr von 02 zur Bildung des erforderlichen ATP begrenzt ist. Dies wurde durch ein Experiment des Australiers Frazer Bergersen bewiesen: Die Verdopplung des O2Gehaltes in der Luft (bei einer entsprechenden Verringerung des N2-Gehaltes) führte in Sojabohnenknöllchen zu einer Verdopplung der Geschwindigkeit der N2Fixierung. Eine weitere Erhöhung des 02 führte dann allerdings wegen der O2-Empfindlichkeit des Nitrogenase-Komplexes zu einem steilen Abfall der N2Fixierung.
Da die bakterielle Atmungskette in der Plasmamembran lokalisiert ist und die Dinitrogenase im Innern der Bakteroide, wird so in überaus effizienter Weise 02 von der Dinitrogenase ferngehalten. Der hohe Diffusionswiderstand für 02, der - wie im Experiment gezeigt - sogar die N2Fixierung begrenzen kann, sorgt dafür, dass auch bei tiefen Temperaturen, bei denen die N2-Fixierung und die bakterielle Atmung gedrosselt sind, der Sauerstoff keinen Kontakt zu dem Nitrogenasekomplex hat.
Ein weiterer Faktor spielt bei der gegebenen Konstellation eine wesentliche Rolle: Die durch Rhizobien infizierten Zellen bilden Leghämoglobin. Dieses ist dem Myoglobin der Tiere ähnlich, besitzt aber eine zehnfach höhere Affinität zum Sauerstoff. Die für eine fünfzigprozentige Sättigung des Leghämoglobins erforderliche O2Konzentration beträgt lediglich 10 bis 20•10-9 mol/L. Das Leghämoglobin liegt außerhalb der Peribakteroidmembran im Cytosol der Wirtszellen und kommt dort in ungewöhnlich hohen Konzentrationen vor (in Sojabohnen 3•10-3 mol/L). Leghämoglobin kann 25% des löslichen Gesamtproteins der Knöllchen ausmachen und verleiht diesen eine rosa Färbung. Leghämoglobin sorgt dafür, dass der Atmungskette der Bakteroide genügend 2 angeliefert wird, obwohl die O2Konzentration und der -Konzentrationsgradient nur sehr niedrig ist. Damit wird der Elektronentransport in der Atmungskette aufrecht gehalten, was wiederum eine essentielle Voraussetzung für die ATP-Synthese ist.

11.3 Die Energiekosten für die Nutzung des N2 als Stickstoffquelle sind höher als bei der Nutzung von N02-
Wie in Abbildung 11.8 gezeigt, werden für die Bildung von einem Molekül NH4+ mindestens sechs Moleküle NADH verbraucht. Zudem kostet der Aufbau der Knöllchen viel metabolische Energie. Dagegen erfordert die Nitratassimilation für die Bildung von NH4+ nur vier Äquivalente NAD(P)H (Kapitel 10). Auch für die Pflanzen, die mithilfe ihrer Symbionten N2 fixieren können, ist es daher viel günstiger, wenn sie ihren Stickstoffbedarf durch Nitratassimilation decken können. Daher ist die Knöllchenbildung reguliert, sie tritt nur dann auf, wenn im Boden Nitratmangel herrscht. Der Vorteil der Symbiose liegt darin, dass Leguminosen auch auf stickstofflimitierten Böden wachsen können, auf denen andere Pflanzen keine Chance mehr haben.

11.4 Pflanzen verbessern ihre Nährstoff-Versorgung durch die Symbiose mit Pilzen
Häufig wird das Pflanzenwachstum durch die Verfügbarkeit des Phosphats im Boden begrenzt. Wegen der niedrigen Löslichkeit ist Phosphat für Wurzeln oft schwer zugänglich. Daher besitzen Pflanzenwurzeln hochaffine Phosphat-Transporter, die bei 1-5 μM Phosphat bereits zur Hälfte gesättigt sind, wobei die aktive Aufnahme, ähnlich wie bei der Aufnahme von Nitrat (Abschn. 10.1), durch Protonen-Symport getrieben wird. Für eine Steigerung der Aufnahme von Phosphat, aber auch anderen mineralischen Nährstoffen wie Nitrat und K+-Ionen, gehen Pflanzen Symbiosen mit Pilzen ein. Pilze können ein Mycel ausbilden, deren Hyphen einen viel geringeren Durchmesser haben als Wurzelhaare, und daher besonders geeignet sind, den Boden zu durchdringen und die darin vorhandenen mineralischen Nährstoffe zu mobilisieren. Diese Nährstoffe liefern sie als Mikrosymbionten an die Pflanzenwurzel und werden dafür von der Pflanze mit Substraten zur Bestreitung ihres Stoffwechsels versorgt.
Besonders häufig ist die arbuskuläre Mykorrhiza
Die arbuskuläre Mykorrhiza wurde in mehr als 80% aller terrestrischen Pflanzenfamilien nachgewiesen. Bei dieser Symbiose dringt der Pilz in einem durch die Pflanze kontrollierten Vorgang in das Cortexgewebe der Pflanzenwurzel ein, und bildet dort ein Netzwerk von Hyphen, die in die Wurzelcortexzellen eindringen, und dabei bäumchenartige Invaginationen bilden, die als Arbuskel bezeichnet werden (Abb. 11.9). Dabei bleiben die Grenzmembranen von Pilz und Wirt intakt. Die Arbuskeln bilden eine große Oberfläche, durch die der Stoffaustausch zwischen Pilz und Wirt erfolgt. Der Pilz kann Nitrat, Ammonium und Aminosäuren aufnehmen. Er liefert Ammonium an die Pflanze, während der Wirt die Kohlenhydrate bereitstellt. Die Arbuskel haben eine Lebensdauer von nur maximal 2 Wochen, sie degenerieren dann in einer Weise, dass die betroffene Wirtszelle nicht geschädigt wird. Daher ist zur Aufrechterhaltung der Symbiose ständig die Bildungen neuer Arbuskeln erforderlich. Die arbuskuläre Mykorrhiza hat sich schon zu einem sehr frühen Zeitpunkt der Pflanzenevolution (vor etwa 450 Millionen Jahren) herausgebildet. Der sehr großen Anzahl der zu dieser Symbiose befähigten Pflanzen stehen nur 6 Gattungen von Pilzen als Symbionten entgegen.

Die für die Ausbildung der Symbiose erforderliche Infektion der Pflanzenwurzel durch den Pilz wird durch von beiden Organismen ausgesendete Signalsubstanzen kontrolliert, wobei die Details noch weitgehend unbekannt sind. Dabei gibt es offenbar gemeinsame Schritte mit der in Abschnitt 11.1 beschriebenen Infektion durch Rhizobien, denn die pilzlichen Signalfaktoren sind Chitooligosaccharide oder Lipochitooligosaccharide. Die Versorgung der symbiontischen Pilze durch die Pflanze erfordert einen sehr hohen Aufwand an Assimilaten. Daher machen Pflanzen die Ausbildung der arbuskulären Mykorrhiza von der Phosphat-Verfügbarkeit im Boden abhängig.

Ectomykorrhiza versorgt Waldbäume mit Nährstoffen
Viele Waldbäume in gemäßigten und kühlen Klimazonen leben in einer als Ectomykorrhiza bezeichneten Symbiose mit Pilzen, um die Aufnahme mineralischer Nährstoffe zu erhöhen. Bei dieser Form der Symbiose dringen die Pilzhyphen nicht in die Wurzelrindenzellen ein, sondern besiedeln lediglich die Oberfläche und den interzellulären Raum der Wurzelrinde mit einem Hyphengeflecht, welches als Hartigsches Netz bezeichnet wird und mit einem sehr weit in den Boden ausstrahlenden Mycel verbunden ist. Bei den Symbionten handelt es sich um Asco- und Basiodiomyceten aus über 60 Gattungen. Von diesen Pilzen gebildete Fruchtkörper umfassen auch Speisepilze wie Pfifferlinge und Steinpilze. Die vom Pilz befallenen pflanzlichen Wurzeln sind verdickt und wachsen langsam. Sie bilden keine Wurzelhaare aus. Die Funktion der Nährstoff- und Wasseraufnahme ist so an den Symbionten delegiert, als Gegenleistung wird dieser von der Pflanze mit Assimilaten zur Bestreitung des Stoffwechsels versorgt. Der Stoffaustausch findet wie bei der arbuskulären Mykorrhiza über die in enger Nachbarschaft befindlichen pilzlichen und pflanzlichen Plasmamembranen statt. Durch die Ectomykorrhiza kann auch ein Austausch von Assimilaten zwischen benachbarten Bäumen erfolgen.
Die Ectomykorrhiza ist für das Wachstum von Waldbäumen wie z. B. Buche, Eiche, Fichte von großer Bedeutung, durch sie wird die Phosphataufnahme auf das 3-5-fache erhöht. Es wurde beobachtet, dass sich ein erhöhter Stickstoffgehalt im Boden negativ auf die Ausbildung der Ectomykorrhiza auswirkt, möglicherweise bietet dies auch eine Erklärung für die Schadwirkung, den der durch Luftverschmutzung hervorgerufene NH3-Eintrag auf Wälder hat (siehe Anfang dieses Kapitels).
Es gibt weitere Formen der Mykorrhiza, wie die Endomykorrhiza bei Orchideen und Ericaceen, auf die hier aber nicht eingegangen wird.nach oben zum Kapitelanfang

12 Die Assimilation von Sulfat ermöglicht die Synthese schwefelhaltiger Verbindungen
Schwefel ist ein essenzieller Bestandteil der lebenden Materie. Er ist in der Oxidationsstufe II Baustein der Aminosäuren Cystein und Methionin, des universellen Entgiftungsmittels Glutathion sowie der bereits mehrfach besprochenen Fe-S-Redoxzentren, Peroxiredoxine und Thioredoxine. Pflanzen, Bakterien und Pilze können diese Stoffe durch die Assimilation von Sulfat aus ihrer Umgebung bilden. Der tierische Stoffwechsel ist auf die Zufuhr schwefelhaltiger Aminosäuren mit der Nahrung angewiesen. Dadurch ist die pflanzliche Sulfatassimilation ebenso wie die bislang besprochene CO2- und Nitratassimilation eine Voraussetzung für das Leben der Tiere.
Während Nitrat nur in der reduzierten Form von der Pflanze genutzt wird, ist Schwefel auch in Form von Sulfat ein essenzieller Bestandteil. Sulfit ist in Sulfolipiden enthalten, die etwa fünf Prozent der Lipide der Thylakoidmembran ausmachen (siehe Kapitel 15). In den Sulfolipiden ist der Schwefel als Sulfonsäure über eine C-S-Bindung mit einem Kohlenhydrat des Lipids verknüpft.

12.1 Sulfatassimilation erfolgt durch Photosynthese
In Pflanzen erfolgt die Sulfatassimilation vorwiegend in den Chloroplasten und ist dann ein Teil der Photosynthese, aber sie findet auch in den Plastiden von Wurzeln statt. Die Geschwindigkeit der Sulfatassimilation ist vergleichsweise gering, sie beträgt nur etwa fünf Prozent der Rate der Nitratassimilation und nur ein bis zwei Promille der CO2 Assimilation. Die Aktivitäten der an der Sulfatassimilation beteiligten Enzyme sind daher relativ niedrig. Dies hat die Untersuchung der an der Sulfatassimilation beteiligten Reaktionen in der Vergangenheit sehr erschwert.

Die Sulfatassimilation zeigt Parallelen, aber auch Unterschiede zur Nitratassimilation
Pflanzen nehmen Sulfat - ähnlich wie bereits in Kapitel 10 für Nitrat beschrieben - über spezifische Translokatoren in die Wurzeln auf. Es gelangt durch den Transpirationsstrom in die Blätter und wird über einen spezifischen Translokator, wahrscheinlich über einen Symport mit drei Protonen, in die Mesophyllzellen aufgenommen (Abb. 12.1). Überschüssiges Sulfat wird in die Vakuole transportiert und dort deponiert.
Das Grundschema der in den Mesophyllzellen ablaufenden Sulfatassimilation entspricht dem der Nitratassimilation. Durch die Aufnahme von zwei Elektronen wird zunächst aus Sulfat Sulfit gebildet und durch die Aufnahme von weiteren sechs Elektronen Schwefelwasserstoff:

Während das bei der Nitritreduktion gebildete NH3 durch die Bildung der Aminosäure Glutamin fixiert wird (Abb. 10.6), wird das bei der Sulfitreduktion entstehende H2S durch Bildung der Aminosäure Cystein fixiert. Ein wesentlicher Unterschied zur Nitratassimilation besteht jedoch darin, dass die Sulfatassimilation einen viel höheren Energieaufwand erfordert. Abbildung 12.1 zeigt dies in einem Überblick. Die Reduktion des Sulfats zum Sulfit, die im Gegensatz zur Nitratreduktion in den Chloroplasten erfolgt, erfordert insgesamt zwei energiereiche Phosphatbindungen und die Fixierung des H2S im Cystein weitere zwei. Damit ist der ATP-Verbrauch bei der Sulfatassimilation vier mal so hoch wie bei der Nitratassimilation.

Vor der Reduktion wird das Sulfat aktiviert
Nach dem Eintransport des Sulfats in die Chloroplasten kann es dort jedoch nicht direkt reduziert werden, da das Redoxpotenzial des Substratpaares SO32-/SO42- (ΔE -517 mV) zu hoch ist. Es gibt in den Chloroplasten kein Reduktionsmittel, das in einem Reaktionsschritt SO42- zu SO32- reduzieren kann. Um eine Reduktion des Sulfats zu ermöglichen, wird zuvor durch eine Aktivierung des Sulfats die Potenzialdifferenz zum Sulfit abgesenkt. Wie in Abbildung 12.2A gezeigt ist, erfolgt die Aktivierung des Sulfats über die Bildung einer Anhydridbindung mit einem Phosphatrest des AMP. Durch das Enzym ATP-Sulfurylase wird Sulfat gegen einen Pyrophosphatrest im ATP ausgetauscht, es entsteht dabei AMP-Sulfat (APS). Da jedoch die freie Enthalpie der Hydrolyse der Sulfat-Phosphat-Anhydridbindung (ΔG = -71 kJ/mol) sehr viel höher ist als die der Phosphat-Phosphat-Anhydridbindung im ATP (ΔG = -31 kJ/mol), liegt das Gleichgewicht der Reaktion ganz auf der Seite des ATP. Die Reaktion kann nur ablaufen, da durch die hohe Pyrophosphatase-Aktivität in den Chloroplasten das Pyrophosphat dem Gleichgewicht entzogen wird.

Das am APS vorhandene Sulfat wird durch Glutathion (Abb. 3.38, 12.5) zu Sulfit reduziert. Die daran beteiligte APS-Reduktase katalysiert nicht nur die Reduktion, sondern auch die sich daran anschließende Freisetzung des Sulfits vom AMP. Die Redoxpotenzialdifferenz zwischen Sulfat und Sulfit ist erniedrigt, da durch die Hydrolyse der sehr energiereichen Sulfit-Anhydridbindung die Reduktion des Sulfats getrieben wird. Der genaue Mechanismus der APS-Reduktase-Reaktion ist noch nicht bekannt.
Alternativ wird APS über eine APS-Kinase zu 3-Phospho-AMP-Sulfat (PAPS) phosphoryliert (Abb. 12.2B), wodurch der Sulfat-Rest aktiviert wird. Wegen des hohen Sulfatübertragungs-Potential ist PAPS ein wichtiger Ausgangsstoff zur Einführung von Sulfatgruppen in biologische Moleküle, wie z.B. Glucosinolate (Abschn. 16.4).


Die Sulfit-Reduktase ist der Nitrit-Reduktase sehr ähnlich
Für die Sulfitreduktion in den Chloroplasten sind wie bei der Nitritreduktion sechs Moleküle reduziertes Ferredoxin als Reduktionsmittel erforderlich (Abb. 12.3).

Die Sulfit-Reduktase ist zu der Nitrit-Reduktase eine homologe Verbindung, sie enthält ebenfalls ein Sirohäm (Abb. 10.5) und ein 4Fe-4S-Zentrum. Das Enzym zeigt 50-prozentige Sättigung bei einer Sulfitkonzentration im Bereich von 10-6 mol/L und kann daher das gebildete Sulfit sehr effizient reduzieren. Als Produkt entsteht Schwefelwasserstoff. Wie für die Nitrit-Reduktase gezeigt (Abb. 10.8), kann das für die Sulfit-Reduktase erforderliche Ferredoxin auch durch NADPH reduziert werden. Dies ermöglicht eine Sulfitreduktion auch in heterotrophen Geweben.

H2S wird in Form von Cystein fixiert
Für die Fixierung des gebildeten H2S muss Serin zunächst aktiviert werden. Dazu wird seine Hydroxygruppe durch die Serin-Acetyltransferase acetyliert (Abb. 12.4). Überträger des Acetylrestes ist Acetyl-CoA, dieses entsteht aus Acetat und CoA unter Verbrauch von ATP (das dabei zu AMP umgesetzt wird) durch das Enzym Acetyl-CoA-Synthetase. Das dabei gebildete Pyrophosphat wird durch die chloroplastidäre Pyrophosphatase gespalten. Die Aktivierung des Serins kostet also den Chloroplasten zwei energiereiche Phosphate.

Die Fixierung des H2S erfolgt durch die 0-Acetylserio-(thiol)-Lyase. Das Enzym enthält Pyridoxalphosphat als prosthetische Gruppe und hat eine hohe Affinität zu H2S und Acetylserin. Man kann die Einfügung der SH-Gruppe als eine Spaltung der Esterbindung durch H-S-H auffassen. Damit bildet Cystein das Endprodukt der Sulfatassimilation. Die Enzyme 0-Acetylserin(thiol)-Lyase und Serin-Acetyltransferase bilden einen reversiblen Komplex aus insgesamt zehn Untereinheiten, den Cystein-Synthasekomplex. Die Metabolite Sulfid (Stabilisierung) und 0-Acetylserin (Destabilisierung) bestimmen das Gleichgewicht der Komplexbildung.
Von den proteinbildenden Aminosäuren bestimmt Cystein in besonderem Maße die Struktur und katalytische Aktivität von Enzymen und kann in dieser Funktion durch keine andere Aminosäure ersetzt werden. Außerdem können Cysteinreste in Proteinen Eisen-Schwefel-Zentren bilden (Abb. 3.26). Als Bestandteil des Thioredoxins sind Cysteinreste an der Lichtregulation von chloroplastidären Enzymen beteiligt (siehe Abb. 6.25). Zudem ist Cystein ein Ausgangsstoff für die Synthese der Schwefelhaltigen Phytoalexine Camalexin und Brassinin (Kap.16) und für die Co-Faktoren Biotin, Thiamin, CoA und Liponsäure (Abb. 15.10).

12.2 Glutathion dient der Zelle als Antioxidans und zur Entgiftung von Schadstoffen
Ein relativ hoher Anteil des in der Pflanze produzierten Cysteins wird zur Synthese von Glutathion (GSH) verwendet, einem Tripeptid (Abb. 12.5). Die Synthese verläuft in zwei enzymatischen Schritten: Durch eine y-Glutamyl-Cystein-Synthetase wird unter Verbrauch von ATP eine Amidbindung zwischen der y-Carboxygruppe von Glutamat mit der Aminogruppe des Cystein hergestellt und durch die Glutathion-Synthetase, wiederum unter Verbrauch von ATP, eine Peptidbindung zwischen der Carboxygruppe des Cysteins und der Aminogruppe eines Glycins.

Glutathion liegt in Pflanzenzellen in relativ hohen Konzentrationen vor und erfüllt dort mehrere Funktionen. GSH dient als Reduktionsmittel bei Synthesen, wie im letzten Abschnitt behandelt. Als Antioxidans schützt es Zellbestandteile gegen Oxidationen. So entsorgt Glutathion im Zusammenspiel mit Ascorbat die bei der Photosynthese als Nebenprodukt auftretenden Sauerstoffradikale. Weitere wichtige Schutzfunktionen erfüllt Glutathion bei der Konjugation von Fremdstoffen und als Ausgangsstoff für Phytochelatine zur Entgiftung von Schwermetallen. Außerdem wirkt Glutathion als Reserve für organischen Schwefel. Durch enzymatischen Abbau kann daraus im Bedarfsfall Cystein zurückgewonnen werden. Darüberhinaus übt Glutathion wichtige Funktionen bei der Redox-Regulation unter Stress aus, vor allem durch die Glutathionylierung von Proteinen und die Bildung der Signalsubstanz Glutathion-Stickoxid (GSNO).

Xenobiotika werden durch Konjugation unschädlich gemacht
Durch Reaktion mit Glutathion werden giftige Substanzen, die von der Pflanze gebildet oder von ihr aufgenommen wurden (Xenobiotika, darunter die vielfach erwähnten Herbizide), unschädlich gemacht. Katalysiert durch Glutathion-S-Transferasen kann die stark reaktive SH-Gruppe des Glutathions mit elektrophilen Kohlenstoffdoppelbindungen, Carbonylgruppen sowie anderen reaktiven Gruppen Thioether bilden. Auf diese Weise im Cytosol entstandene Glutathionkonjugate (Abb. 12.6) werden durch einen spezifischen Glutathion-Translokator unter Verbrauch von ATP gegen einen Konzentrationsgradienten in die Vakuole gepumpt.

Im Gegensatz zu den bislang bekannten Transportprozessen, in denen Metabolite durch sekundär-aktiven Transport gegen einen Gradienten transportiert werden (Abb. 1.20), erfolgt die Aufnahme der Glutathionkonjugate in die Vakuole durch einen ATP-getriebenen primär-aktiven Transport. Dieser Translokator gehört zu der in Bakterien, Pflanzen und Tieren weit verbreiteten Superfamilie der ABC-Transporter (ATP binding cassette). Es gibt in der Vakuolenmembran verschiedene ABC-Transporter, mit unterschiedlicher Spezifität. Die importierten Konjugate werden häufig modifiziert, zum Beispiel durch den Abbau zum Cysteinkonjugat, und in dieser Form endgelagert. Auf diese Weise können Pflanzen auch Herbizide entgiften. Eine Herbizidresistenz, zum Beispiel von Mais gegen Atrazin, kann durch die Aktivität einer spezifischen Glutathion-S-Transferase bedingt sein. Die Pflanzenschutzforschung zielt darauf, Herbizide zu entwickeln, die möglichst nur Unkräuter, nicht aber Kulturpflanzen angreifen. Dabei entdeckte man sehr unterschiedliche chemische Substanzen, welche die Toleranz von Kulturpflanzen gegen bestimmte Herbizide erhöhen, und die daher als Safener bezeichnet werden. Die Wirkung dieser Safener beruht darauf, dass sie als Xenobiotika eine verstärkte Expression der Glutathion-S-Transferase und des vakuolären Glutathion-Translokators auslösen, wodurch in die Pflanze aufgenommene Herbizide schneller entgiftet werden. Die Bildung von Glutathionkonjugaten und deren Transport in die Vakuole dient auch der Ablagerung von Blütenfarbstoffen (Abschn. 18.6).

Phytochelatine schützen die Pflanze vor Schwermetallen
Glutathion ist darüber hinaus Ausgangssubstanz für die Bildung von Phytochelatinen (Abb. 12.7). Die Phytochelatin-Synthase, eine Transpeptidase, überträgt ein Glutamyl-Cysteinyl-Dipeptid auf die Aminogruppe des Glutamats eines weiteren Glutathion-Moleküls, unter Abspaltung von Glycin. Die Wiederholung dieses Vorganges führt zur Bildung von Ketten aus bis zu elf (Glu-Cys)-Resten mit einem carboxy-terminalem Glycin. Man hat Phytochelatine in allen bislang untersuchten Pflanzen gefunden, manchmal allerdings in abgewandelter Form als iso-Phytochelatine, bei denen Glycin durch Serin, Glutamat oder ß-Alanin ersetzt ist.

Phytochelatine schützen die Pflanze vor Vergiftung mit Schwermetallen. Sie bilden über die Thiolgruppen der Cysteinreste feste Komplexe mit Metallionen wie Cd2+ , Ag+, Pb2+, Cu2+, Hg2+ und Zn2+ sowie auch das Semimetall As3+ (Abb. 12.8). Die im Cytosol vorhandene Phytochelatin-Synthase wird durch die Anwesenheit von mindestens einem der genannten Schwermetallionen aktiviert. Dadurch kann bei einer Schwermetallbelastung die Pflanze in sehr kurzer Zeit die zur Entgiftung erforderlichen Phytochelatine aus Glutathion neu synthetisieren. Eine akute Schwermetallbelastung kann zu einem drastischen Abfall der Glutathionreserve der Zellen führen. Die mit Schwermetallen beladenen Phytochelatine werden unter Verbrauch von ATP in die Vakuolen gepumpt. Wegen des sauren Milieus in der Vakuole werden dort die Schwermetall-Ionen von den Phytochelatinen abgespalten und häufig als mikrokristalline Sulfid-Komplexe, umhüllt von Phytochelatinen, endgelagert. Dazu wirken Phytochelatine auch als Speichersubstanzen für Cu2+ und Zn2+.

Für einen Schutz von Pflanzen gegen Schwermetallvergiftungen sind Phytochelatine essenziell. Man hat Mutanten von Arabidopsis mit einem Defekt der Phytochelatin-Synthase gefunden, die eine extreme Empfindlichkeit gegenüber Cd2+ zeigten.
Die Fähigkeit von Pflanzen, mithilfe der Phytochelatine Schwermetalle zu binden, wird neuerdings genutzt, um schwermetallverseuchte Böden zu entgiften. Man lässt auf diesen Böden Pflanzen wachsen, die durch Züchtung oder durch molekulargenetische Veränderungen eine besondere Kapazität der Aufnahme von Schwermetallen durch die Wurzeln und der Phytochelatinbiosynthese haben, und so dem Boden Schwermetalle zu entziehen vermögen. Dieses als Phytoremedation bezeichnete Verfahren dürfte eine große Zukunft haben, da es gegenüber anderen Methoden zur Entseuchung schwermetallbelasteter Böden sehr kostengünstig ist.

12.3 Aus Cystein wird Methionin synthetisiert
Cystein ist der Ausgangsstoff für Methionin, eine weitere S-haltige Aminosäure. 0-Phosphohomoserin, das bereits als Zwischenprodukt der Threoninsynthese (Abb. 10.14) besprochen wurde, bildet mit Cystein unter Abspaltung der Phosphatgruppe Cystathionin (Abb. 12.9). Durch die Cystathionin-β-Lyase wird der Thioether gespalten, und es entstehen dabei Homocystein und ein instabiles Enamin, das spontan in Pyruvat und NH4+ zerfällt. Durch Methyltetrahydrofolat (Methyl-THF), ein Methylgruppenüberträger (siehe Abb. 7.6 und Abb. 7.7), wird die Sulfhydrylgruppe des Homocysteins methyliert, und es entsteht das Endprodukt Methionin.


S-Adenosylmethionin ist ein universelles Methylierungsreagens
Die als Methyl-THF gelieferte Methylgruppe stammt aus einem Formiat-Molekül, welches unter Verbrauch von ATP an THF gebunden wird und durch zwei NADPH-Moleküle von Formyl-THF zu Methyl-THF reduziert wird. Methyl-THF hat nur ein geringes Methylübertragungspotenzial. Eine allgemeine Bedeutung als Methyldonor hat dagegen S-Adenosylmethionin. Dieses ist an der Methylierung von Nukleinsäuren, Proteinen, Kohlenhydraten, Membranlipiden und vielen anderen Substanzen wie z.B. Chlorophylle, Plastochinone, Biotin und Polyamine, beteiligt und kann daher als universelles Methylierungsmittel der Zelle angesehen werden. Auch ist es Ausgangssubstanz für die Synthese des Phytohormons Ethylen (Abschn. 19.7).
S-Adenosylmethionin wird durch die Übertragung eines Adenosylrestes vom ATP auf das Schwefelatom des Methionins unter Freisetzung von Phosphat und Pyrophosphat gebildet (Abb. 12.10).

Die Methylgruppe, die an dem positiv geladenen S-Atom gebunden ist, ist aktiviert, sie kann so durch entsprechende Methyl-Transferasen auf andere Akzeptoren übertragen werden. Das verbleibende S-Adenosylhomocystein wird zu Adenosin und Homocystein hydrolysiert, und aus Letzterem wird durch Reaktion mit Methyltetrahydrofolat (Abb. 12.9) Methionin zurückgewonnen.

12.4 Im Uberschuss ist Schwefeldioxid für Pflanzen ein Schadstoff
S02 in der Luft, das in besonders hohem Maße bei der Verhüttung schwefelhaltiger Erze, aber auch bei der Verbrennung fossiler Brennstoffe entsteht, kann den Schwefelbedarf von Pflanzen vollständig decken. In höheren Konzentrationen führt es jedoch bei Pflanzen zu drastischen Schädigungen. Das gasförmige S02 wird durch die Stomata in die Blätter auf genommen und bildet dort Sulfit:

Pflanzen besitzen Schutzmechanismen, durch die das in den Blättern gebildete Sulfit entfernt wird: Zum einen wird Sulfit durch die in Abschnitt 12.1 besprochene Sulfit-Reduktase zu H2S und dann weiter zu Cystein umgewandelt. Vermehrt gebildetes Cystein kann zu Glutathion umgesetzt werden. Man findet in Blättern S02-belasteter Pflanzen oft eine Anhäufung von Glutathion. Das vermehrt gebildete H2S kann, wenn auch nur in geringem Umfang, aus den Blättern durch die Stomata entweichen. Zum andern kann Sulfit durch die Sulfit-Oxidase im Blatt zu Sulfat oxidiert werden. Da dieses Sulfat aus den Blättern nicht abtransportiert werden kann, wird es in den Vakuolen der Blattzellen als K + - oder Mg2+-Sulfat endgelagert. Wird die Speicherkapazität überschritten, werden die Blätter abgeworfen. Dies erklärt zu einem Teil die Schadwirkung des S02 auf Nadelbäume: Der frühe Verlust der Nadeln SO2-geschädigter Bäume beruht in hohem Maße darauf, dass die Kapazität der Vakuolen für die Endlagerung von Sulfat erschöpft ist. Der hohe Kationenbedarf für die Endlagerung des Sulfats kann bei kationenarmen Böden zu einem empfindlichen K + - oder Mg2+-Mangel in den Blättern oder Nadeln führen. Das bei SO2-Belastung häufig beobachtete Vergilben der Fichtennadeln wird teilweise auf eine vermindete Mg2+-Verfügbarkeit zurückgeführt.nach oben zum Kapitelanfang

13 Durch den Phloemtransport erreichen die Photoassimilate ihre Verbrauchsorte
In diesem Kapitel wird behandelt, wie die Photoassimilate aus den Blättern zu den anderen Teilen der Pflanze exportiert werden. Neben dem Xylem, dem Leitungssystem für den Transport von der Wurzel zu den Blättern, besitzen Pflanzen ein zweites „Ferntransportsystem", das Phloem, durch das die im Blatt gebildeten Photoassimilate zu den Verbrauchsorten geliefert werden. Das Xylem und das Phloem sind eng benachbart und bilden zusammen mit Parenchymzellen die Leitbündel (Abbildung 13.1). Das Xylem (griech. xylon „Holz") besteht aus verholzten Röhren, durch welche Wasser und die darin gelösten Nährstoffe aus der Wurzel in die Blätter gelangen. Das Phloem (griech. phloios „Rinde, Borke") besteht aus meist an der Außenseite der Leitbündel angeordneten Leitgefäßen, durch die Photoassimilate vom Ort der Bildung (Source), zum Beispiel einem Blatt, zu den Verbrauchsorten oder den Speicherorten (Sink), wie Wurzel, Knolle, Frucht oder wachsendem Spross, transportiert werden. Sink- und Source-Gewebe stehen so über das Phloem miteinander in Verbindung.

Das Phloem enthält langgestreckte Zellen, die durch siebartig durchbrochene Quer- und Schrägwände, so genannte Siebplatten, miteinander verbunden sind. Diese Zellen werden als Siebelemente und ihre Aneinanderreihung als Siebröhre bezeichnet (Abb. 13.2) . Die Poren der Siebplatten sind erweiterte Plasmodesmen, die mit Callose (siehe Abschn. 9.6) ausgekleidet sind. Die Siebelemente sind als lebende Zellen zu betrachten, die allerdings Zellkern, Golgi-Apparat und Vakuolen verloren haben und nur noch wenige Mitochondrien, Plastiden und etwas endoplasmatisches Reticulum enthalten. Das Fehlen vieler Zellstrukturen, die normalerweise in Zellen vorhanden sind, spezialisiert die Siebröhren für den Ferntransport von Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen, sowie eine Reihe anderer anorganischer und organischer Verbindungen. Die Haupttransportform für Kohlenstoff ist bei den meisten Pflanzen Saccharose. Einige Pflanzen transportieren auch Oligosaccharide der Raffinosefamilie (Abschn. 9.4), oder Zuckeralkohole (Polyole) wie Sorbit oder Mannit (Abb. 9.19). Stickstoff wird fast ausschließlich in organischer Form als Aminosäuren transportiert. In geringeren Konzentrationen sind zusätzlich auch noch organische Säuren, Nukleotide, Proteine, Signalsubstanzen und Phytohormone im Phloemsaft vorhanden. Neben diesen organischen Substanzen werden auch anorganische Ionen, hauptsächlich Kalium, transportiert.

Den Siebelementen der Angiospermen sind Geleitzellen benachbart. Diese enthalten alle Bestandteile einer normalen lebenden Pflanzenzelle, einschließlich des Zellkerns, und sind besonders reich an Mitochondrien und Ribosomen. Geleitzellen versorgen die benachbarten Siebelemente mit Energie und synthetisierten Proteinen. Siebelemente und Geleitzellen gehen zumeist aus einer gemeinsamen Zelle hervor und sind über sehr viele Plasmodesmen (Abschn. 1.1) miteinander verbunden. Sie bilden daher bei der Phloembeladung eine funktionelle Einheit. Je nach Phloembeladung werden die Geleitzellen als ordinäre Geleitzellen, Transferzellen oder als Intermediärzellen bezeichnet.

13.1 Es gibt zwei Wege der Phloembeladung
Die in den Mesophyllzellen gebildeten Photoassimilate Saccharose und verschiedene Oligosaccharide, Polyole sowie Aminosäuren als Produkte der Nitrat- und Sulfatassimilation diffundieren durch Plasmodesmen zu den Bündelscheidenzellen. Für den Weitertransport von den Phloemparenchymzellen zu den Siebröhren gibt es zwei prinzipielle Möglichkeiten, die in unterschiedlichem Ausmaß in Kombination in einer Pflanzenart vorkommen können.
1. Insbesondere in Pflanzen, bei denen der Ferntransport der CO2-Assimilate zumindest teilweise in Form von Oligosacchariden der Raffinosefamilie (Abschn. 9.4) erfolgt (dazu gehören beispielsweise die Kürbisgewächse), sind die Bündelscheidenzellen mit speziellen Geleitzellen, die als Intermediärzellen bezeichnet werden, im weiteren mit den Siebelementen durch eine große Zahl von Plasmodesmen verbunden. Daher kann der Transfer der Photoassimilate in die Siebröhren weiterhin symplastisch über die vorhandenen Plasmodesmen erfolgen.
2. Im Gegensatz dazu werden bei der apoplastischen Phloembeladung, die beispielsweise in Getreiden, Zuckerrüben, Kartoffeln und Raps nachgewiesen wurde, Photoassimilate aus den Source-Zellen über die Bündelscheidenzellen zunächst in den extrazellulären Raum, den Apoplasten, exportiert (Abb. 13.3). Da die Konzentration der Saccharose, der Polyole und der Aminosäuren in den Source Zellen höher ist als im Apoplasten, erfordert dieser Transport wahrscheinlich keinen Energieaufwand. Die Translokatoren, die diesen Export bewirken, konnten bislang noch nicht charakterisiert werden.
Die an der apoplastischen Phloembeladung beteiligten Geleitzellen werden als Transferzellen bezeichnet. Der Transport der Saccharose und der Aminosäuren aus dem Apoplasten in das Phloem erfolgt durch Protonensymport (Abb. 13.3). Dieser wird durch einen zwischen dem Apoplasten und dem Inneren der Geleitzellen und Siebröhren bestehenden Protonengradienten getrieben, der durch eine in der Plasmamembran vorhandene H+-P-ATPase (Abschn. 8.2) gebildet wird. Das dazu erforderliche ATP wird durch mitochondriale Oxidation produziert. Inzwischen wurden in einer Reihe von Pflanzen H+-Symporter für Saccharose, Polyole und Aminosäuren charakterisiert: In Leitbündeln von Wegerich wurde durch den Einsatz spezifischer Antikörper die Lokalisation eines H+-Saccharose-Translokators und zweier H+-Polyol-Transporter in der Plasmamembran der Geleitzellen nachgewiesen (Abb. 13.2). Die Substrate für die mitochondriale Atmung werden durch die Spaltung der Saccharose über die Saccharose-Synthase (siehe auch Abb. 13.5) und den glycolytischen Abbau der so gebildeten Hexosephosphate bereitgestellt. Auch Glutamat ist ein mögliches Substrat für die Atmung (Abschn. 5.3). Diese Aminosäure ist in vielen Pflanzen in relativ hohen Konzentrationen im Phloemsaft vorhanden.

Während bei den bislang untersuchten Pflanzen mit apoplastischer Phloembeladung Saccharose, z. T. auch in Kombination mit den Polyolen Sorbit oder Mannit, die einzige Transportform für Kohlenhydrate ist (Hexosen werden nicht transportiert), gibt es für den Aminostickstoff keine spezielle Transportform. Es werden grundsätzlich alle proteinogenen Aminosäuren transportiert, das Verhältnis der Aminosäuren im Phloemsaft zueinander entspricht dabei dem entsprechenden Verhältnis in den Source-Zellen. Die häufigsten Aminosäuren im Phloemsaft sind in der Regel Glutamat, Glutamin und Aspartat, in manchen Pflanzen auch Alanin oder Asparagin. Es wurden verschiedene Aminosäuretranslokatoren identifiziert, die an der Phloemladung beteiligt sein könnten. Wahrscheinlich erfolgt der Transport aller Aminosäuren durch Translokatoren die eine sehr breite Substratspezifität besitzen.

13.2 Der Phloemtransport erfolgt durch einen Massenstrom
Durch den Protonen-Substrat-Cotransport werden in den Siebröhren sehr hohe Konzentrationen erreicht. Je nach Pflanze und Wachstumsbedingungen betragen die Konzentrationen der Saccharose im Phloemsaft 0,6 bis 1,5 mol/L, die der Polyole 0,5 mol/L und die der Summe der Aminosäuren 0,05 bis 0,5 mol/L. Bei der Gewinnung von Phloemsaft für derartige Analysen lassen sich Blattläuse einsetzen. Blattläuse können (nach einigem Probieren) ihre Stechborsten genau in eine Siebröhre stechen. Der unter Überdruck stehende Phloemsaft läuft durch den Stechborstenkanal und dient der Blattlaus als Nahrung (Abb. 13.4). Da sie mehr Saccharose aufnimmt, als sie gebrauchen kann, scheidet sie den unverbrauchten Rest als Honigtau aus. Daher sind verlauste Zimmerpflanzen mit einer klebrigen Zuckerschicht bedeckt. Durchtrennt man die Stechborste einer sich ernährenden Blattlaus durch einen Laserstrahl, tritt aus dem in den Siebröhren steckenden Stechborstenstumpf Phloemsaft aus. Auch wenn die Menge des so gewonnenen Phloemsaftes sehr gering ist (0,05 bis 0,1•-6 L/h), ist so mithilfe moderner Techniken eine quantitative Analyse des Phloemsaftinhalts möglich.

Mit Pflanzen, die bei der Photosynthese radioaktiv markiertes CO2 erhielten, wurden Phloemtransportgeschwindigkeiten von 30 bis 150 cm/h gemessen. Dieser rasche Transport verläuft im Massenstrom, er wird einerseits durch das sehr effiziente Pumpen der Saccharose, der Polyole und der Aminosäuren in die Siebröhren getrieben und andererseits durch die Entnahme an den Verbrauchsorten. Triebkraft dabei sind sehr viele transversale osmotische Gradienten. In dem Massenstrom werden niedrig konzentrierte Substanzen, beispielsweise Phytohormone, mitgerissen. Die Richtung des Massenstroms wird allein durch den Verbrauch bestimmt: Je nach Bedarf kann daher ein Transport in aufsteigender Richtung, zum Beispiel vom ausgewachsenen Blatt zu dem wachsenden Spross oder der Blüte, oder absteigend in die Wurzeln oder Speicherknollen erfolgen. Da der Phloemsaft unter Überdruck steht und das Phloem stark vernetzt ist, könnte eine Gewebsverletzung zu einem Ausbluten führen. Dies wird jedoch durch Schutzmechanismen verhindert: Durch die Anwesenheit von Substraten im Phloemsaft sowie den Enzymen Saccharose-Synthase und Callose-Synthase - die wahrscheinlich membrangebunden sind - werden die Siebporen beschädigter Siebröhren durch Callosebildung (Abschn. 9.6) versiegelt und die Siebröhren auf diese Weise stillgelegt. Zum anderen kann eine schnelle Versiegelung der Siebplatten durch sogenannte P-Proteine erfolgen.

13.3 Durch Phloementladung werden Sink-Gewebe versorgt
Für die Phloementladung bestehen wiederum zwei Möglichkeiten (Abb. 13.2). Bei der symplastischen Entladung gelangen Saccharose und Aminosäuren über Plasmodesmen direkt von den Siebelementen in die Zellen der Verbrauchsorgane. Bei der apoplastischen Entladung erfolgt zunächst ein Export in den extrazellulären Raum und dann eine Aufnahme in die Zellen der Verbrauchsorgane. Elektronenmikroskopische Untersuchungen der Plasmodesmendichte sprechen dafür, dass die Phloementladung in vegetativen Geweben, wie zum Beispiel Wurzeln oder wachsendem Spross, vor allem symplastisch erfolgt, während in Speichergeweben die Entladung häufig auf apoplastischem Wege stattfindet.

In Speicherorganen werden die angelieferten Kohlenhydrate meist zu Stärke umgesetzt und deponiert. Bei apoplastischer Phloementladung sind hierfür zwei Wege möglich: In dem in Abbildung 13.5 rot gezeichnetem Weg wird Saccharose aus dem Apoplasten in die Speicherzellen aufgenommen und über die Saccharose-Synthase und die UDP-Glucose-Pyrophosphorylase in Fructose und Glucose-1-phosphat umgewandelt. Dabei wird Pyrophosphat verbraucht und UTP gebildet. Bei diesem Weg ist nicht eindeutig geklärt, wie das Pyrophosphat gebildet wird. Glucose-1-phosphat wird durch Phosphoglucomutase in Glucose-6-phosphat umgewandelt. Alternativ wird die Saccharose zunächst im Apoplasten durch das Enzym Invertase in Glucose und Fructose gespalten. Diese beiden Hexosen werden dann in die Zelle transportiert. Durch eine Hexokinase (sie phosphoryliert neben Glucose auch Mannose) und durch eine Fructokinase werden die entsprechenden Hexosephosphate gebildet. Glucose-6-phosphat wird über einen Glucosephosphat-Phosphat-Translokator (siehe Abschn. 8.2) im Gegentausch mit Phosphat in den Amyloplasten transportiert; dort wird über die Synthese von ADP-Glucose (Abschn. 9.1) Stärke gebildet. Manche Leukoplasten transportieren im Gegentausch mit Phosphat auch Glucose-1-phosphat. Die Stärkespeicherung in der Kartoffelknolle verläuft wahrscheinlich in erster Linie über die Saccharose-Synthase. In den Speicherwurzeln der Zuckerrübe werden Kohlenhydrate als Saccharose in den Vakuolen gespeichert. In manchen Früchten, zum Beispiel der Weintraube, werden Kohlenhydrate als Glucose in den Vakuolen gespeichert.

13.4 Der Glykolyseweg hat eine zentrale Funktion bei der Verwertung der Kohlenhydrate
Die durch den Phloemtransport zu den Verbrauchszellen angelieferten Kohlenhydrate bilden den Treibstoff für die Energieversorgung μnd zugleich die Kohlenstoffquelle für die Synthese von Zellmaterial. Der Glykolyseweg, der zumindest als Teil in fast allen lebenden Organismen vorhanden ist, spielt dabei eine fundamentale Rolle. Die Enzyme dieses Stoffwechselweges sind in allen Pflanzenzellen enthalten, wobei jede Zelle zwei Sätze dieser Enzyme enthält, einen im Cytosol und einen in den Plastiden. Allerdings ist in manchen Pflanzen in den Plastiden der Glykolyseweg unvollständig, da ein oder zwei Enzyme fehlen. Eine Reihe der plastidischen Enzyme ist am Calvin Cyclus beteiligt, wie in Kap. 6 beschrieben. Abb. 13.6 zeigt den Glykolyseweg im Cytosol.

Glucose-6-phosphat, bereitgestellt entweder durch den Abbau von Saccharose (Abb.13.5) oder den Abbau von Stärke (Abb. 9.12) wird in einer reversiblen Reaktion durch die Hexosephosphat-Isomerase in Fructose-6-phosphat überführt. Diese Reaktion erfolgt in Analogie zu der Isomerisierung von Ribose-5-phosphat (Abb. 6.18). Katalysiert durch die ATP-Phosphofructokinase wird Fructose-6-phosphat durch ATP zu Fructose-1,6-bisphosphat phosphoryliert. Alternativ kann diese Phosphorylierung über die Pyrophosphat-Phosphofructokinase auch durch Pyrophosphat erfolgen. Dieses Enzym ist allerdings nicht in Plastiden enthalten. Da bei beiden Reaktionen die Freie Energie für die Hydrolyse des Anhydridphosphat-Donors viel höher ist als die des gebildeten Phosphatesters, ist die Bildung des Fructose-1,6-bisphosphats ein irreversibler Schritt. Daher verläuft die Rückreaktion, die Überführung von Fructose-1,6-bisphosphat zu Fructose-6-phosphat über ein anderes Enzym, die Fructose-1,6-bisphosphatase (Abb. 6.15). Bei der Glykolyse wird Fructose-1,6-bisphosphat in einer reversiblen Reaktion durch Aldolase in Glycerinaldehyd-3-phosphat und Dihydroxyacetonphosphat gespalten (Abb. 6.14). Durch die Triosephosphat-Isomerase wird Dihydroxyacetonphosphat zu Glycerinaldehyd-3-phosphat isomerisiert.
Durch die bis hier beschriebenen Teilschritte des Glykolyseweges werden das ursprünglich eingesetzte Hexosephosphat für die Gewinnung von Reduktionsäquivalenten (NADH) und ATP vorbereitet. Durch die anschließende reversible Oxidation des Glycerinaldehydphosphats durch die Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase zu 1,3-Bisphosphoglycerat wird NADH gebildet. In umgekehrter Richtung und unter Verbrauch von NADPH ist diese Reaktion Teil des Calvin-Cyclus (Abb. 6.9, 6.10). Die Änderung der Freien Energie während der Oxidation des Aldehyds zu einem Carboxylat wird durch die Bildung eines Phosphat-Carboxylat-Anhydrids konserviert, wobei letzteres in einer anschließenden Reaktion, katalysiert durch die Phosphoglycerat-Kinase, in reversibler Reaktion zur ATP-Synthese genutzt wird, unter Bildung von 3-Phosphoglycerat. Auch diese Reaktion ist in umgekehrter Richtung Teil des Calvin-Cyclus (Abb. 6.9). Um auch den verbleibenden Phosphatrest für die Gewinnung von ATP zu nutzen, wird 3-Phosphoglycerat in Analogie zu der Phosphoglucomutase-Reaktion (Abb. 9.6) durch die Phosphoglycerat-Mutase in 2-Phosphoglycerat umgewandelt. Das Enzym Enolase katalysiert die Abspaltung von Wasser, wobei Phosphoenolpyruvat (PEP) entsteht. Durch diesen Schritt entsteht aus einem Phosphatester ein Enolester, dessen Freie Energie der Hydrolyse höher ist als die der Anhydridbindung des ATP. Daher ist die nachfolgende Umwandlung des Phosphoenolpyruvats zu Pyruvat unter Bildung von ATP durch die Pyruvat-Kinase ein irreversibler Schritt. Alternativ kann Phosphoenolpyruvat im Cytosol durch die PEP-Carboxylase (Abb. 8.5) in Oxalacetat überführt werden, wobei letzteres durch die Malat-Dehydrogenase (Abb. 5.9) zu Malat reduziert werden kann. Das Malat-Enzym (Abb.8.10) katalysiert die Umwandlung von Malat in Pyruvat. Sowohl Pyruvat als auch Malat können in den mitochondrialen Citratcyclus (Abb. 5.3) eingefüttert werden, zur Gewinnung von ATP und auch von Vorstufen für die Synthese vieler Aminosäuren (Abschn. 10.4).
Unter aeroben Bedingungen hat der eigentliche Glykolyseweg nur einen geringen Anteil an der Energieversorgung der Pflanze. Die Überführung von einem Molekül Glucose-6-phosphat in 2 Moleküle Pyruvat liefert nur 3 Moleküle ATP. Hingegen liefert die Oxidation dieser 2 Moleküle Pyruvat und der bei der Oxidation des Glycerinaldehydphosphats gebildeten 2 Moleküle NADH durch die Mitochondrien insgesamt 25 ATP (Abschn. 5.6). Jedoch in Abwesenheit von Sauerstoff, beispielsweise bei Überflutung oder Staunässe der Wurzeln, oder auch bei der Imbibition während der Samenkeimung, ist die ATP-Bereitstellung durch den Glykolyseweg entscheidend, um einen minimalen Stoffwechsel aufrecht zu erhalten. In einer derartigen Situation kann das bei der Glykolyse gebildete NADH wie bei der Ethanol-Gärung durch Hefen oxidiert werden. Bei diesem Weg wird Pyruvat zunächst durch die Pyruvat-Decarboxylase mit Thiaminpyrophosphat als Co-Faktor (Siehe Abb. 5.4) zu Acetaldehyd decarboxyliert, und letzteres durch die Alkohol-Dehydrogenase unter Oxidation von NADH zu Ethanol reduziert. Das Ethanol wird ausgeschieden. In Pflanzenzellen ist bei Sauerstoffmangel ein hoher Anstieg der Aktivität der Alkohol-Dehydrogenase zu beobachten. Alternativ kann das bei der Glykolyse gebildete NADH über die Lactat-Dehydrogenase durch Reduktion von Pyruvat zu Lactat reoxidiert werden. Das dabei gebildete Lactat wird als Milchsäure ausgeschieden. Die Lactat-Dehydrogenase wird in Wurzeln und keimenden Samen bei Sauerstoffmangel ebenfalls vermehrt gebildet. In den meisten Pflanzen ist aber Ethanol das Hauptprodukt eines anaeroben Stoffwechsels.
Neben der Bereitstellung von ATP liefert die Glykolyse Ausgangsprodukte für eine Vielfalt von Zellbestandteilen. So ist Pyruvat Ausgangsprodukt für die Synthese von Fettsäuren; die Reduktion von Dihydroxyacetonphosphat durch die Glycerinphosphat-Dehydrogenase liefert Glycerin-3-phosphat, beides Grundbausteine für die Synthese von Lipiden. Phosphoenolpyruvat ist Ausgangsprodukt für eine Anzahl von Aminosäuren, wie z.B. Phenylalanin, einem Intermediat für die Synthese von Phenylpropanoiden wie Lignin (Abb.18.9) , Tannine (Abb. 18.6) und Anthocyanidine (Abb. 18.15) .
Der Glykolyseweg unterliegt einer strengen Regulation, insbesondere da die meisten der Enzyme sowohl in den Plastiden wie auch im Cytosol vorkommen. In beiden Kompartimenten wird die Phosphorylienmg des Fructose-6-phosphats durch die ATP-Phosphofructokinase durch Phosphoenolpyruvat gehemmt, wodurch der Substratfluss durch den Glykolyseweg dem Bedarf angepasst werden kann. Die Phosphorylierung des Fructose-6-phosphats durch die im Cytosol lokalisierte Pyrophosphat-Phosphofructokinase wird durch Fructose-2,6-bisphosphat aktiviert, während die Rückreaktion, die Hydrolyse des Fructose-1,6- bisphosphats durch Fructose-2,6-bisphosphat gehemmt wird. Die Bedeutung dieser Regulation für die Saccharose Synthese wird in Abschn. 9.3 besprochen.nach oben zum Kapitelanfang

14 Produkte der Nitratassimilation werden in der Pflanze in Form von Proteinen gespeichert
Wie in Kapitel 9 besprochen, werden Produkte der CO2-Assimilation in der Pflanze in Form von Polysacchariden gespeichert. Für die als Produkt der Nitratassimilation gebildeten Aminosäuren bilden Proteine die Reserveform. Es handelt sich dabei in erster Linie um spezielle Speicherproteine, die keine enzymatische Funktion besitzen und die in der Zelle in Proteinkörpern gelagert werden. Proteinkörper sind von einer einfachen Membran umgeben und leiten sich von den Vakuolen beziehungsweise dem Endomembransystem des endoplasmatischen Reticulums und des Golgi-Apparates ab. In Kartoffelknollen werden Speicherproteine auch in der Vakuole gelagert.
Speicherproteine können je nach Aminosäureangebot in verschiedenen Pflanzenorganen, wie Blättern, Stängeln und Wurzeln, deponiert werden. Sie werden jedoch insbesondere in Samen und Knollen, aber auch im Kambium von Baumstämmen während der Winterzeit gelagert, um eine schnelle Blattbildung bei der Samenkeimung oder beim Austreiben zu ermöglichen.
In Samen von Getreiden werden die Speicherproteine im Endosperm gespeichert, in den Samen der meisten Leguminosen (Hülsenfrüchten) in den Kotyledonen. Während in Getreidekörnern der Proteingehalt 10 bis 15% des Trockengewichtes ausmacht, beträgt er in manchen Leguminosen (z.B. Sojabohne) 40 bis 50% . Von diesen Proteinen sind etwa 85% Speicherproteine. Weltweit bezieht die Menschheit etwa 70% ihres Proteinbedarfs aus dem Verzehr von Pflanzensamen, entweder direkt oder nach Verfütterung an Tiere (Fleischproduktion). Dadurch sind die pflanzlichen Speicherproteine Grundlage für die menschliche Ernährung. Jedoch ist ihre Aminosäurezusammensetzung für die Ernährung von Mensch und Tier oft nicht ausgeglichen. So sind in Getreiden die Speicherproteine arm an Threonin, Tryptophan und vor allem an Lysin, während in Leguminosen ein Mangel an Methionin besteht. Da die genannten Aminosäuren vom menschlichen Stoffwechsel nicht gebildet werden können, ist der Mensch auf ihre Zufuhr mit der Nahrung angewiesen (essentielle Aminosäuren). Für Menschen, die sich ausschließlich vegetarisch ernähren, kann dieser Mangel vor allem bei Kindern zu irreparablen physischen und mentalen Schäden führen. Auch bei der Mast von Schweinen und Geflügeln fällt dieser Aminosäuremangel stark ins Gewicht. Bei der Züchtung und gentechnischen Entwicklung von Getreide und Leguminosen wird daher besonders auf eine verbesserte Aminosäurezusammensetzung der Speicherproteine Wert gelegt.
Pflanzliche Proteine werden seit langem intensiv beforscht. Bereits 1745 isolierte der Italiener J. Beccari die Proteine aus Weizen. Eine Einteilung pflanzlicher Proteine aufgrund ihrer Löslichkeitseigenschaften wurde 1924 von T.B. Osborne an der Connecticut Agricultural Experimental Station vorgenommen. Er fraktionierte pflanzliche Proteine in Albumine (löslich in reinem Wasser), Globuline (löslich in verdünnten Salzlösungen), Gluteline (löslich in verdünnten Alkali- und Säurelösungen) und Prolamine (löslich in wässrigem Ethanol). Als später die Strukturen dieser Proteine ermittelt wurden, zeigte sich jedoch, dass Gluteline und Prolamine strukturell sehr verwandt sind. In der neueren Literatur werden Gluteline der Gruppe der Prolamine zugerechnet. Tabelle 14 .1 zeigt einige Beispiele für verschiedene pflanzliche Speicherproteine.

14.1 Globuline sind die am weitesten verbreiteten Speicherproteine
Speicherglobuline kommen, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß, in praktisch allen Pflanzen vor. Die wichtigsten Globuline gehören zur Gruppe der Legumine und Viciline. Beide Globuline werden jeweils von einer Multigenfamilie codiert, wobei beide Familien auf einen gemeinsamen Ursprung zurückgehen. Legumin ist das Hauptspeicherprotein von Hülsenfrüchten. So liegt in der Ackerbohne 75% des gesamten Speicherproteins als Legumin vor. Legumin ist ein Hexamer mit einer Molekularmasse von 300 bis 400kDa. Die Monomere enthalten zwei verschiedene Peptidketten (a, ß), die durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Die große Kette (α) hat meist eine Molekularmasse von etwa 35 bis 40kDa, die kleine (ß) von etwa 20kDa. Hexamere können aus unterschiedlichen (a ß)-Monomeren aufgebaut sein. In dem Hexamer liegt das Proteinmolekül in einer sehr regelmäßigen Packung vor und kann so in den Proteinkörpern gestapelt werden. Falschgepackte Proteinmoleküle, bei denen zum Beispiel die Faltung einzelner Ketten fehlerhaft ist, werden durch Peptidasen wieder gespalten. Auch wenn es heute recht einfach ist, in einem Protein Aminosäuren durch gentechnische Methoden auszutauschen, so hat sich dies bei Speicherproteinen als sehr schwierig erwiesen, da meist auch die Faltungsweise und damit die räumliche Struktur der Moleküle verändert wird. Eine erfolgreiche Verbesserung der Aminosäurezusammensetzung von Speicherproteinen setzt detaillierte Kenntnisse der dreidimensionalen Proteinstruktur voraus. Solche Untersuchungen können jetzt durchgeführt werden, da in den letzten Jahren die Kristallisierung und damit auch die Aufklärung der Proteinstruktur sowohl reifer, prozessierter Speicherproteine als auch eines Vorstufentrimers gelungen ist. Diese Strukturuntersuchungen zeigen, dass die Stabilität der Speicherproteine gegenüber den in den Speichervakuolen vorhandenen Proteasen darauf beruht, dass mögliche Schnittstellen in der Quartärstruktur des Proteins verborgen und so geschützt sind.
Vicilin zeigt in seiner Aminosäuresequenz Ähnlichkeiten zum Legumin. Es liegt meist als Trimer vor, wobei die Monomere nur aus einer Peptidkette bestehen, sie enthalten kein Cystein und damit keine Disulfid-Brücken (S-SBrücken). Im Gegensatz zu den Leguminen sind die Viciline häufig glycosyliert; sie enthalten Kohlenhydratreste wie Mannose, Glucose und N-Acetylglucosamm.

14.2 Prolamine werden als Speicherproteine in Gräsern gebildet
Prolamine sind nur in Gräsern, und damit auch in Getreiden, enthalten. Sie liegen als polymorphes Gemisch vieler verschiedener Untereinheiten von je 30 bis 90kDa vor. Manche dieser Untereinheiten enthalten Cysteinreste und werden durch S-S-Brücken verknüpft. Auch in Glutenin, das in Weizen- und Roggenkörnern vorkommt, sind die Monomere durch S-S-Brücken verknüpft. Diese Gluteninmoleküle haben unterschiedliche Größen. Hochmolekulare Glutenine verleihen dem Mehl die Backfähigkeit. Gerste, Hafer oder Mais enthalten kein Glutenin, ihr Mehl ist daher zum Brotbacken nicht geeignet. Da der Gluteningehalt ein entscheidendes Qualitätsmerkmal für Brotgetreide ist, wird versucht, durch gentechnische Ansätze den Gluteningehalt des Brotgetreides zu erhöhen.

14.3 2S-Proteine kommen in Samen dikotyler Pflanzen vor
Auch die so genannten 2S-Proteine sind als Speicherproteine weit verbreitet. Es handelt sich dabei um eine heterogene Proteingruppe, die allein dadurch definiert ist, dass die Proteine einen Sedimentationskoeffizient von etwa 2 besitzen. Strukturuntersuchungen zeigten, dass viele der 2S-Proteine verwandte Strukturen aufweisen und möglicherweise zusammen mit den Prolaminen von einem gemeinsamen Vorstufenprotein abstammen. Ein Beispiel hierfür ist Napin, das dominierende Speicherprotein in Rapskörnern. Die Speicherproteine im Raps sind wirtschaftlich von Bedeutung, da nach der Ölgewinnung die Rückstände der Samen als Viehfutter genutzt werden. Napin und andere verwandte 2S-Proteine bestehen aus zwei relativ kleinen Polypeptidketten von 9kDa und 12kDa, die wiederum durch S-S-Brücken miteinander verknüpft sind. Über die Packung sowohl der Prolamine wie auch der 2S-Proteine in den Proteinkörpern weiß man bisher erst wenig.

14.4 Proteine schützen den Samen davor, von Tieren gefressen zu werden
Neben den bisher genannten Speicherproteinen enthalten die Proteinkörper mancher Samen Proteine, die zugleich die Samen vor Fraß schützen. So hat das Speicherprotein Viciline Abwehrfunktionen, indem es an die Chitinmatrix von Pilzen und Insekten bindet. Bei manchen Insekten stört Vicilin die Larvenbildung. Die Samen von manchen Leguminosen enthalten Lectine. Lectine binden an Zuckerreste, unabhängig davon, ob diese frei oder als Bestandteil von Glycolipiden oder Glycoproteinen vorliegen. Lectine haben eine allgemeine Bedeutung bei der Zell-Zell-Erkennung. Als Bestandteil der Samen wirken sie bei Verzehr verdauungsstörend, da sie an glycoproteinhaltige Rezeptoren im Dünndarm binden und dadurch die Nahrungsresorption stören. Bei manchen Leguminosen, aber auch bei anderen Pflanzen, enthalten die Samen außerdem Proteinase-Inhibitor, die die Proteinasen im Verdauungstrakt von Tieren hemmen. Wegen der Lectine und Proteinase-Inhibitoren sind viele Bohnen erst nach Denaturierung durch Kochen genießbar. Rizinuskerne enthalten das toxische Protein Ricin. Wenige Milligramm davon können einen Mensch töten. Bohnen enthalten Amylase-Inhibitoren, die spezifisch die Amylasen im Verdauungstrakt bestimmter Insekten hemmen. Es ist gelungen, durch Transformation das Gen des α-Amylase-Inhibitors aus Bohnen in den Samen von Erbsen zu exprimieren. Bei Erbsen traten durch den Fraß der Erbsenkäferlarven hohe Lagerverluste auf, die nun mit den transgenen Erbsenpflanzen deutlich verringert werden konnten.

14.5 Die Proteinsynthese der Speicherproteine erfolgt am rauhen endoplasmatischen Reticulum
Die Samen-Speicherproteine werden durch Ribosomen auf dem rauhen endoplasmatischen Reticulum (ER) (Abb. 14.1) gebildet. Die synthetisierten Proteine befinden sich im Lumen des ER. Die Ablagerung der Speicherproteine erfolgt in Proteinkörpern. Im Falle der 2S-Proteine und Prolamine bilden sich die Proteinkörper durch Abschnürungen der ER-Membran. Die Globuline werden meist aus dem ER durch Vesikeltransfer über den GolgiApparat (Abschn. 1.6) zunächst in die Vakuole geschleust, aus der sich dann durch Fragmentierung Proteinkörper bilden. Es gibt aber auch einen Weg, durch den bestimmte Proteine (z.B. Globuline im Weizen-Endosperm) durch Abschnürungen der ER-Membran am Golgi-Apparat vorbei direkt in die Vakuole transferiert werden.

Abbildung 14.2 zeigt die Bildung des Legumins im Detail. Das im Ribosom gebildete Protein besitzt am Anfang einen hydrophoben Abschnitt, eine so genannte Signalsequenz. Nach Synthese dieser Signalsequenz geht die Translation zunächst nicht weiter. Die Signalsequenz bildet einen Komplex mit drei Komponenten: einem Signalerkennungspartikel, einem an der ER-Membran vorhandenen Bindungsprotein sowie einem dort ebenfalls lokalisierten Porenprotein.

Die Bildung des Komplexes induziert die Öffnung einer Pore in der ER-Membran, die Translation geht weiter, und die neu gebildete Proteinkette (z. B. Prä-Prolegumin) gelangt in das Lumen des ER. Dadurch ist für die Dauer der Proteinsynthese das Ribosom auf der ER-Membran verankert. Durch eine an der Innenseite der ER-Membran vorhandene Signalpeptidase wird unmittelbar nach dem Eintritt der Peptidkette in das Lumen die Signalsequenz abgeschnitten. Das verbleibende Prolegumin enthält die spätere α- und die ß-Kette des Legumins auf einem Polypeptid. Im ER-Lumen bildet sich innerhalb des Prolegumins eine S-S-Brücke. Drei Proleguminmoleküle bilden unter der Mitwirkung von Chaperonen (Abschn. 21.2) ein Trimer. Dabei erfolgt gleichentstehendes zeitig eine Qualitätskontrolle: Trimere, die nicht die korrekte Konformation aufweisen, werden wieder abgebaut. Der Ort dieses proteolytischen Abbaues ist unbekannt: Entweder findet der Abbau im ER selbst, oder nach Export im Cytosol, oder in den Vakuolen statt. Die Trimeren werden dann über den Golgi-Apparat in die Vakuole geschleust, in denen eine Peptidase die α- und ß-Kette voneinander trennt. Die so gebildeten Untereinheiten des Legumins lagern sich zu Hexameren zusammen und werden in dieser Form gespeichert. Die Proteinkörper als endgültiger Speicherort des Legumins entstehen durch Fragmentierung der Vakuole. Die Zuckerketten der glykosylierten Viciline (z. B. des Phaseolins aus der Gartenbohne Phaseolus vulgaris) werden im Golgi-Apparat prozessiert.
Auch bei der Synthese der 2S-Proteine und Prolamine enthalten die im Lumen des ER anfallenden Prä-Pro-Formen eine Signalsequenz. Die Fertigstellung und Aggregation der Proteine erfolgt bereits im Lumen des ER, von dem sich dann die Proteinkörper abschnüren.

14.6 Proteinasen mobilisieren die in den Speicherproteinen deponierten Aminosäuren
Unsere Kenntnisse über die Mobilisierung der Aminosäuren aus den Speicherproteinen beruhen hauptsächlich auf den Untersuchungen der Vorgänge bei der Samenkeimung. Meist wird die Keimung durch die Aufnahme von Wasser ausgelöst, dabei fusionieren die Proteinkörper. Die Spaltung der Speicherproteine erfolgt durch Proteinasen, die zum Teil als inaktive Proform zusammen mit den Speicherproteinen in den Proteinkörpern deponiert werden. Proteinasen können aber auch neu synthetisiert werden und über das Lumen des ER und den Golgi-Apparat in die Vakuole eingeschleust werden (Abb. 14.2). Auch hier erfolgt die Anlieferung als inaktive Proform. Die Aktivierung dieser Pro-Proteinasen erfolgt durch limitierte Proteolyse, bei der durch eine spezielle Peptidase ein Sequenzabschnitt abgespalten wird. Der verbleibende Rest ist die aktive Proteinase.
Der Abbau der Speicherproteine wird wiederum durch eine limitierte Proteolyse ausgelöst. Eine spezifische Proteinase spaltet erst einen kleinen Sequenzabschnitt ab. Dies hat zur Folge, dass sich die Konformation der Speicherproteine ändert. In Getreiden werden S-S-Brücken in Speicherproteinen durch reduziertes Thioredoxin (Abb. 6.25) geöffnet und die ungefalteten Proteine können jetzt von verschiedenen Proteinasen angegriffen werden: durch Exopeptidasen, die nacheinander von außen her Aminosäuren abtrennen, und durch Endopeptidasen, die das Molekül im Innern spalten. So werden die Speicherproteine in der Vakuole vollständig abgebaut, und die freigesetzten Aminosäuren stehen der keimenden Pflanze als Bausteine zur Verfügung.nach oben zum Kapitelanfang

15 Lipide wirken als Membranbausteine und als Kohlenstoffspeicher
Lipide untergliedern sich in Glycerolipide, Sphingolipide und Isoprenoide (Kapitel 17), von denen hier nur die Steroide relevant sind. Glycerolipide sind Fettsäureester von Glycerin (Abb. 15.1). Triacylglycerine (die auch als Triglyceride bezeichnet werden) bestehen aus einem Glycerinmolekül, das mit drei Fettsäuren verestert ist. Während Triglyceride in Tieren in erster Linie Energiespeichers sind, haben sie in Pflanzen vor allem die Funktion eines Kohlenstoffspeichers in Samen und werden vom Menschen als Pflanzenfette genutzt. Polare Glycerolipide sind dagegen nur mit zwei Fettsäuren verestert, an die dritte OH-Gruppe des Diacylglycerins ist eine hydrophile Gruppe geknüpft (Abb. l5.5A). Sphingolipide bestehen aus einem Sphingosin-Rückgrat (langkettiger Aminoalkohol), an das eine Fettsäure über die Aminogruppe (Säureamidbindung) gebunden ist. An die Hydroxylgruppe ist wie im Diacylglycerid ebenfalls eine hydrophile Gruppe gebunden (Abb. 15.1). Steroide (siehe Abb. 15.3) tragen eine hydrophile OH-Gruppe. Polare Lipide bilden den Hauptbestandteil der Membranen.

15.1 Polare Lipide sind wichtige Membranbausteine
Die polaren Glycerolipide, Sphingolipide und Steroide sind amphiphile Moleküle, das heißt, sie besitzen einen hydrophilen Kopf und einen hydrophoben Schwanz. Daher können sie Lipiddoppelschichten bilden, in denen sich die Kohlenwasserstoffschwänze durch hydrophobe Wechselwirkungen aneinander lagern und die hydrophilen Köpfe in die wässrige Phase herausragen. Sie bilden die Grundstruktur einer Membran (Abb. 15.2). Da in einem polaren Glycerolipid das mittlere C-Atom des Glycerins asymmetrisch ist, kann man zwischen den zwei veresterten Gruppen des Glycerins am C-1 und C-2 unterscheiden.

Auch die in Abbildung 15.3 gezeigten Steroide haben amphiphilen Charakter, die OH-Gruppe bildet den hydrophilen Kopf und das Sterangerüst mit der Seitenkette den hydrophoben Schwanz. Neben den hier gezeigten Steroiden gibt es in den Pflanzen eine Vielfalt ähnlicher Steroide (Sterole) als Membranbestandteile. Sie sind vor allem in der äußeren Membran der Mitochondrien, den ER-Membranen und in der Plasmamembran enthalten und bestimmen weitgehend deren Eigenschaften (siehe unten).

Die polaren Glycerolipide enthalten vorwiegend Fettsäuren mit 16 oder 18 C-Atomen (Abb. 15.4). Der weitaus überwiegende Teil dieser Fettsäuren ist ungesättigt und enthält ein bis drei Kohlenstoffdoppelbindungen. Diese Doppelbindungen liegen fast immer in cis-Stellung und nur in seltenen Fällen auch in trans-Stellung vor. Die Doppelbindungen sind in der Regel nicht konjugiert. Abbildung 15.4 zeigt auch den Zahlencode für die Struktur der Fettsäuren: Anzahl der C-Atome: Zahl der Doppelbindungen, Δ Anfangsposition der Doppelbindungen, c = cis-Stellung, (t = trans). In Sphingolipiden befinden sich charakteristische Fettsäuren, die sich durch alpha-Hydroxylierung und oft lange Kettenlängen auszeichnen.

Pflanzen enthalten in ihren Speicherlipiden oft ungewöhnliche Fettsäuren, zum Beispiel mit konjugierten Doppelbindungen, Kohlenstoffdreifachbindungen sowie Hydroxy-, Keto- und Epoxygruppen. Inzwischen sind mehr als 500 dieser ungewöhnlichen Fettsäuren bekannt. Auch gibt es Glycerolipide, bei denen eine Kohlenstoffkette mit dem Glycerin über eine Ethergruppe verknüpft ist.

Die Fluidität der Membran wird durch den Anteil ungesättigter Fettsäuren und den Gehalt an Steroiden geprägt
Die langgestreckten Ketten der gesättigten Fettsäuren können sich zu einer regelmäßigen Packung zusammenlagern (Abb. 15.2), während bei den ungesättigten Fettsäuren die Packung bei den cis-ständigen Kohlenstoffdoppelbindungen durch die Knicke gestört ist. Man sieht dies deutlich, wenn man die Schmelzpunkte der einzelnen Fettsäuren vergleicht (Tab. 15.1). Mit steigender Kettenlänge erhöht sich der Schmelzpunkt, die Packung wird fester, während mit steigender Zahl der Doppelbindungen der Schmelzpunkt stark absinkt. Das gleiche gilt für die entsprechenden Neutrallipide. So ist Kokosfett, das vorwiegend gesättigte Fettsäuren enthält, bei Raumtemperatur fest; Pflanzenöle mit einem hohen, natürlichen Anteil ungesättigter Fettsäuren sind dagegen bei gleicher Temperatur flüssig.

Entsprechendes gilt auch für die Fluidität der Membranen, die durch den Anteil ungesättigter Fettsäuren in den Membranlipiden geprägt wird. Bei manchen Pflanzen werden während des Wachstums bei tiefen Temperaturen vermehrt hochungesättigte Fettsäuren in die Membranen eingebaut, um so einer durch Kälte bedingten Verminderung der Membranfluidität entgegenzuwirken. Steroide und Sphingolipide (Abb. 15.3) erniedrigen die Fluidität von Membranen. Möglicherweise spielen sie auch eine Rolle bei der Temperatur-Adaptation der Membranen. Durch eine gentechnische Erhöhung des Anteils der ungesättigten Fettsäuren in den Membranlipiden konnte die Kältetoleranz von Tabak erhöht werden. Umgekehrt wurde durch eine gentechnisch erzeugte Erniedrigung des Anteils ungesättigter Fettsäuren in den Lipiden von Thylakoidmembranen von Tabak eine höhere Hitzetoleranz der Pflanzen erreicht.

Membranlipide enthalten eine Vielfalt hydrophiler Kopfgruppen
Die Kopfgruppen der polaren Glycerolipide in Pflanzen bestehen aus sehr unterschiedlichen Verbindungen, die aber letztlich alle die gleiche Funktion erfüllen: Sie verleihen dem Lipidmolekül polare Eigenschaften (Abb. 15.5A). In den Phospholipiden besteht die Kopfgruppe aus einem Phosphatrest, der mit der OH-Gruppe des Glycerins und zusätzlich mit einem weiteren Alkohol (Ethanolamin, Cholin, Serin, Glycerin oder Inosit) verestert ist. Die Phosphatidsäure hat als Membranbaustein eine nur geringe Bedeutung, sie wirkt hingegen als Signalsubstanz (Abschn. 19.1). Ebenfalls nicht Struktur- sondern Signalfunktion haben bei allen Eukaryoten die phosphorylierten Derivate des Phosphatidylinositol (PI), die Phosphoinositide genannt werden. Schlüsselenzyme der Phosphoinositidbildung sind Lipidkinasen, die spezifisch verschiedene Positionen des lnositol-Ringes phosphorylieren können. Phosphoinositide haben wichtige Funktionen bei der Steuerung des zellulären Membranverkehrs, der Etablierung der Zellpolarität, beim polaren Spitzenwachstum und bei der Stressadaptation von Pflanzen.

Die oben genannten Phospholipide findet man als Membranbausteine sowohl in Bakterien als auch in Tieren und Pflanzen. Als eine Besonderheit enthalten Pflanzen und Cyanobakterien zudem als Membranbausteine die Galactolipide Monogalactosyldiglycerid (MGDG), Digalactosyldiglycerid (DGDG) und das Sulfolipid Sulfochinovosyldiglycerid (SL). Letzteres enthält als Kopfgruppe einen Glucoserest, bei dem am C-6 ein Sulfonsäurerest geknüpft ist (Abb. 15.5B).

In einer Pflanze haben die verschiedenen Membranen eine sehr unterschiedliche Lipidzusammensetzung (Tabelle 15.2) . So enthalten die Chloroplasten in erster Linie Galactolipide. Sie sind dort Hauptbestandteil der Thylakoidmembranen und auch in den Hüllmembranen enthalten. In den Membranen der Mitochondrien und in der Plasmamembran sind diese Lipide nicht vertreten, dort wird die Membran aus Phospholipiden gebildet. Cardiolipin ist in Tieren und Pflanzen ein spezifischer Bestandteil der inneren Mitochondrienmembran.
In einer grünen Pflanzenzelle entfallen 70 bis 80 % der gesamten Membranlipide auf die Thylakoidmembranen. Pflanzen machen den größten Teil der Biosphäre aus; deshalb sind die Galactolipide MGDG und DGDG die häufigsten Membranlipide auf der Erde. Da der Phosphatgehalt im Boden oder in Gewässern an vielen Standorten das Pflanzenwachstum begrenzt, war es sicherlich für die Evolution der Pflanzen ein Vorteil, dass diese bei der Synthese des überwiegenden Teiles ihrer Membranlipide von der Phosphatversorgung aus der Umgebung unabhängig waren.


Sphingolipide sind wichtige Bausteine der Plasmamembranen
Sphingolipide (Abb. 15.5C) kommen in Plasmamembranen und in ER-Membranen vor. Die Sphingolipide bestehen aus einer so genannten Sphingolipid-Base. Dies ist eine Kohlenwasserstoffkette, welche Doppelbindungen aufweisen kann und in Position 2 eine Aminogruppe sowie in den Positionen 1, 3 und 4 zwei bis drei Hydroxylgruppen enthält. Diese Base ist durch Amidbindung mit einer Fettsäure (C16-C26) verknüpft, die eine Doppelbindung enthalten und alpha-hydroxyliert sein kann. Aus der Vielzahl der in der Natur vorkommenden Sphingolipide wird in (Abb. 15.5C) das Ceramid mit der Base Sphinganin gezeigt. Bei den Glucosylspbingolipiden ist die endständige Hydroxylgruppe mit einem oder mehreren Glucosederivaten verknüpft, bei den Inositolphosphorylceramiden (Abb. 15.5C) mit Phosphoinositol verestert.

Sphingolipide haben eine wichtige Signalfunktion in Tieren und Hefen. Bisherige Ergebnisse weisen darauf hin, dass Sphinganin-1-phosphat in Schließzellen als Botensubstanz an der durch Abscisinsäure (ABA) ausgelösten Ca2+-Mobilisierung beteiligt ist (siehe Abschn. 8.2 und 19.6). Auch gibt es Hinweise für eine Beteiligung von Sphingolipid-Metaboliten als Signale beim programmierten Zelltod.

15.2 Triacylglycerine sind Reservesubstanzen
Triacylglycerine sind vor allem in Samen, aber auch in einigen Früchten, zum Beispiel in Oliven oder Avocados enthalten. In Früchten locken sie Tiere zum Verzehr an, um so die darin enthaltenen Samen zu verbreiten. In Samen haben sie die Funktion eines Kohlenstoffspeichers, um für die Biosyntheseprozesse bei der Samenkeimung den erforderlichen Kohlenstoff zu liefern. Als Speichersubstanz haben Triacylglycerine gegenüber Kohlenhydraten den Vorteil, dass Triacylglycerine - bezogen auf den Kohlenstoff - ein viel geringeres Gewicht haben: Bei der Stärke hat der Glucoserest aus sechs C-Atomen eine Molekularmasse von 162 Dalton. Die Masse von einem gespeicherten C-Atom wäre demnach rein rechnerisch 27 Dalton. Tatsächlich ist dieser Wert höher, da Stärke Wassermoleküle enthält; sie ist hydratisiert. Ein Triacylglycerin mit drei Palmitatresten enthält insgesamt 51 C-Atome und hat eine Molekularmasse von 807 Dalton. Die Masse von einem gespeicherten C-Atom beträgt hier nur 16 Dalton. Da die Triacylglycerine im Gegensatz zur Stärke nicht hydratisiert sind, erfordert daher die Speicherung des Kohlenstoffs im Samen in Form von Fett weniger als die Hälfte an Gewicht.
Triacylglycerine werden in Ölkörpern gelagert (Abb. 15.6). Diese bestehen aus Öltröpfchen, die von einer Phospholipidmonoschicht umgeben sind. Im Endosperm und im Embryonalgewebe von Samen sind in der Lipidmonoschicht der Ölkörper eine Vielfalt von Proteinen (Oleosine, Caloleosine, Steroleosine) verankert.

Diese haben eine Funktion bei der Mobilisierung der Fettsäuren aus dem Triacylglycerinspeicher bei der Samenkeimung (Abschn. 15.6). Die Ölkörper im Fruchtfleisch von Oliven oder Avocados, deren Triacylglycerine keinen für die Pflanze verwertbaren Speicher darstellen, sondern lediglich als Lockmittel für Tiere dienen, enthalten keine Oleosine, und sie sind mit einem Durchmesser von 10 bis 20μm um ein Vielfaches größer als die Ölkörper von Speichergeweben (Durchmesser 0,5 bis 2μm). Wie in Abschnitt 15.5 behandelt, erfolgt die Synthese der Triacylglycerine in der Membran des endoplasmatischen Reticulums. Man nimmt an, dass das gebildete Triacylglycerin zwischen der Lipiddoppelschicht der ER-Membran akkumuliert, bis die Größe des Ölkörpers erreicht wird (Abb. 15.6). Wenn sich dann dieser Ölkörper von der ER-Membran abtrennt, ist er von einer einfachen Phospholipidschicht umgeben.

15.3 Die Neusynthese von Fettsäuren erfolgt in Plastiden
Der bei der CO2Assimilation in den Chloroplasten fixierte Kohlenstoff ist nicht nur Ausgangsmaterial für die Synthese von Kohlenhydraten und Aminosäuren, sondern auch für die Synthese der Fettsäuren sowie der in Kap. 16-18 behandelten Spezialmetabolite. Während jedoch die Produktion von Kohlenhydraten und Aminosäuren durch die Mesophyllzellen vorwiegend für den Export in andere Teile der Pflanze bestimmt ist, erfolgt die Synthese der Fettsäuren außer in Samen und Früchten nur für den Eigenbedarf der Zelle. Pflanzen können Fettsäuren nicht über weite Strecken transportieren. Da Fettsäuren als Bestandteil der Membranlipide in jeder Zelle vorkommen, ist in jeder Zelle der Enzymapparat zur Synthese der Membranlipide und damit auch der Fettsäuren erforderlich.
In Pflanzen erfolgt die Neusynthese der Fettsäuren grundsätzlich in den Plastiden - in den Chloroplasten der grünen Zellen und den Leukoplasten und Chromoplasten der nicht-grünen Zellen. In Pflanzenzellen sind zwar auch Enzyme der Fettsäuresynthese in der Membran des endoplasmatischen Reticulums vorhanden, diese sind nach den heutigen Vorstellungen aber nur an einer Modifizierung bereits vorhandener Fettsäuren beteiligt, zum Beispiel durch Kettenverlängerung durch Elongasen, oder durch die weitere Einführung von Doppelbindungen und anderer funktioneller Gruppen durch die Desaturasen (siehe Abb. 15.15B).

Ausgangsprodukt für die Synthese der Fettsäuren ist Acetyl-CoA
Ausgangsprodukt für die Fettsäuresynthese ist Acetyl-CoA. Plastiden enthalten, wie die Mitochondrien (siehe Abb. 5.4), einen Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, durch den Pyruvat unter Reduktion von NAD+ zu Acetyl-CoA oxidiert wird (Abb. 15.7).

In Chloroplasten wird das für die Synthese der Fettsäuren erforderliche NADPH durch die Photosynthese bereitgestellt. Es ist jedoch immer noch unklar, wie in den Chloroplasten der Weg des Kohlenstoffs von derCO2-Fixierung im Calvin-Cyclus bis zur Bildung des Acetyl-CoA verläuft. In Chloroplasten ist - abhängig vom Entwicklungsstadium der Zellen - die Aktivität der Pyruvat-Dehydrogenase oft gering. Hingegen enthalten Chloroplasten sehr hohe Aktivitäten der Acetyl-CoA-Synthetase, durch die Acetat unter Verbrauch von ATP zu Acetyl-CoA umgesetzt wird. Gibt man radioaktiv markiertes Acetat zu Chloroplasten, so beobachtet man einen sehr schnellen Einbau der Radioaktivität in Fettsäuren. Man nimmt an, dass vielfach Acetat das Ausgangsprodukt für die Acetyl-CoA-Bildung in den Chloroplasten und auch Leukoplasten ist. Woher das Acetat stammt, ist aber noch unklar. Es könnte in den Mitochondrien durch Hydrolyse von Acetyl-CoA, das mittels der mitochondrialen Pyruvat-Dehydrogenase synthetisiert wurde, gebildet werden.
In Leukoplasten werden die für die Fettsäuresynthese erforderlichen Reduktionsäquivalente (NADPH) durch die Oxidation von Glucose-6-phosphat bereitgestellt (Abb. 6.21). Dieses wird über den Glucosephosphat-Phosphat-Translokator in die Plastiden transportiert (siehe Abb. 13.5).
Bei der Fettsäuresynthese wird im ersten Schritt Acetyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase unter Verbrauch von ATP zu Malonyl-CoA carboxyliert (Abb. 15.8).

In einer danach folgenden Reaktion wird CoA durch Acylcarrierprotein (ACP) ausgetauscht. ACP (Abb. 15.9) enthält einen Serinrest, an den über eine Phosphatgruppe ein Pantetheinrest geknüpft ist. Da der Pantetheinrest auch der funktionelle Bestandteil des CoA ist, kann ACP als ein an ein Protein fixiertes CoA angesehen werden. Die ß-Ketoacyl-ACP-Synthase III (KAS III) katalysiert die Kondensation von Acetyl-CoA mit dem Malonyl-ACP. Durch die Freisetzung von CO2 ist diese Reaktion irreversibel. Die Funktion der Enzyme KAS I und KAS II wird in Zusammenhang mit Abb. 15.14 behandelt. Das gebildete Acetoacetat bleibt als Thioester an ACP gebunden und wird unter Verbrauch von NADPH zu ß-D-Hydroxyacyl-ACP reduziert. Nach einer Wasserabspaltung wird die entstandene Kohlenstoffdoppelbindung durch NADPH zu Acyl-ACP reduziert. Das Produkt ist eine um zwei Kohlenstoffatome verlängerte Fettsäure (Abb. 15.8), mit der der Prozess dann zyklisch erneut durchlaufen werden kann.


Die Acetyl-CoA-Carboxylase ist das Startenzym der Fettsäuresynthese
Die Carboxylierung des Acetyl-CoA erfolgt durch Biotin, einen Überträger von „aktiviertem CO2" (Abbildung 15.10).

Biotin ist durch eine Carboxylseitenkette mit der ε-Aminogruppe eines Lysinrestes des Biotin-Carboxyl-Carrierproteins kovalent verknüpft. Biotin enthält eine NH-Gruppe, die unter Verbrauch von ATP mit HCO3- ein Kohlensäureamid bildet. Die Carboxylierung des Acetyl-CoA erfordert zwei Schritte: Zunächst carboxyliert die Biotin-Carboxylase unter ATP-Spaltung das Biotin; dann überträgt die Carboxyl-Transferase die Kohlensäuregruppe auf das Acetyl-CoA. Alle drei Enzyme - Biotin-Carboxyl-Carrierprotein, Biotin-Carboxylase und Carboxyl-Transferase - bilden einen Multienzymkomplex. Da das Biotin an das Carrierprotein mit einer langen, flexiblen Kette befestigt ist, kann es in dem Multienzymkomplex abwechselnd mit der Carboxylase und der Carboxyl-Transferase reagieren (Abb. 15.11).

Da der aus den verschiedenen Untereinheiten aufgebaute Acetyl-CoA-Carboxylase-Multienzymkomplex im Stroma der Plastiden eine große Ähnlichkeit zu den Acetyl-CoA-Carboxylasen in Bakterien aufweist, hat man ihn auch als prokaryontische Form der Acetyl-CoA-Carboxylase bezeichnet. Acetyl-CoA-Carboxylase kommt aber auch außerhalb der Plastiden vor, wahrscheinlich im Cytosol. Das außerhalb der Plastiden gebildete Malonyl-CoA dient der Kettenverlängerung von Fettsäuren und als Ausgangsprodukt für die Bildung von Flavonoiden (siehe Abschn. 18.5). Die extraplastidäre Acetyl-CoA-Carboxylase besteht jedoch im Gegensatz zu dem Prokaryontentyp aus einem großen multifunktionellen Protein, bei dem die Funktionen des Biotincarriers, der Carboxylase und der Carboxyl-Transferase auf verschiedenen Abschnitten der gleichen Polypeptidkette lokalisiert sind. Da dieses multifunktionelle Protein in sehr ähnlicher Form auch im Cytosol von Hefen und Tieren vorkommt, hat man es als eukaryontische Form bezeichnet. Es sei aber betont, dass sowohl die eukaryontische wie auch die prokaryontische Form der Acetyl-CoA-Carboxylase im Kern codiert wird. Lediglich ein Protein des prokaryontischen Enzyms wird möglicherweise von den Plastiden codiert.
In Gramineen (Gräsern) - dazu gehören die verschiedenen Getreidearten - gibt es die prokaryontische Form nicht; dort ist auch innerhalb der Chloroplasten die multifunktionelle eukaryontische Acetyl-CoA-Carboxylase vorhanden. Die eukaryontische Acetyl-CoA-Carboxylase wird durch verschiedene Arylphenoxypropionsäurederivate, wie zum Beispiel Diclofopmethyl (Abb. 15.12), gehemmt.

Da in den Gramineen die eukaryontische Acetyl-CoA-Carboxylase auch an der de-novo-Fettsäuresynthese der Plastiden beteiligt ist, wird die Lipidsynthese von Gramineen durch diesen Hemmer besonders stark beeinträchtigt. Man verwendet daher Diclofopmethyl (Handelsname Hoe-Grass®, Aventis) und ähnliche Substanzen als selektive Herbizide beim Anbau krautiger Nutzpflanzen wie Tomate oder Kartoffel (Abschn. 3.6), um gezielt Gräser als Unkraut zu bekämpfen.
Die Acetyl-CoA-Carboxylase ist als Startenzym der Fettsäuresynthese eine wichtige Regulationsstelle, und ihre Reaktion wird als geschwindigkeitsbestimmender Schritt der Fettsäuresynthese angesehen. In Chloroplasten hat das Enzym nur im Licht seine volle Aktivität und ist im Dunkeln stark gehemmt. Daher läuft die Fettsäuresynthese hauptsächlich tagsüber ab, wenn das dafür erforderliche NADPH durch die Photosynthese angeliefert wird. Der Mechanismus der Lichtaktivierung entspricht dem der Lichtaktivierung von Enzymen des Calvin-Cyclus (Abschn. 6.5): Die Acetyl-CoA-Carboxylase wird durch Thioredoxin reduktiv aktiviert, und die Aktivität durch Steigerung des pH und der Mg2+-Konzentration im Stroma weiter erhöht.

Weitere Schritte der Fettsäuresynthese erfolgen ebenfalls an einem Multienzymkomplex
Das durch die Kondensation von Acetyl-CoA und Malonyl-ACP gebildete ß-Ketoacyl-ACP (Abb. 15.8) wird durch NADPH zu ß-D-Hydroxyacyl-ACP reduziert, und nach Wasserabspaltung wird die Kohlenstoffdoppelbindung des entstandenen Enoyl-ACP wiederum durch NADPH zum Acyl-ACP reduziert. Diese Reaktionssequenz hat Ähnlichkeit mit der Umkehr der Bildung von Oxalacetat aus Succinat im Citratcyclus (Abb. 5.3). Die hier gezeigten Reaktionsschritte werden ebenfalls durch einen Multienzymkomplex katalysiert, in dem die beteiligten Enzyme im Plastidenstroma wahrscheinlich in regelmäßiger Form angeordnet sind. Abbildung 15.13 zeigt schematisch das Zusammenspiel der verschiedenen Reaktionen. Das ACP, das den Acylrest als Thioester gebunden enthält, ist im Zentrum lokalisiert. Der Acylrest hängt an einer flexiblen Kette und kann so von Enzym zu Enzym weitergereicht werden.

Um die gebildete Fettsäure zu verlängern, wird sie vermutlich zunächst auf ein anderes ACP übertragen. Die Kondensation dieses Acyl-ACP mit einem neu gebildeten Malonyl-ACP wird durch ß-Ketoacyl-ACP-Synthase 1(KAS1) katalysiert. Dieses Enzym ermöglicht die Bildung von Fettsäuren mit einer Kettenlänge bis C16, eine weitere Kettenverlängerung bis C18 erfolgt durch die ß-Ketoacyl-ACP-Synthase II (KAS II) (Abb. 15.14).

Es sei erwähnt, dass in Tieren und Pilzen die in Abbildung 15.13 gezeigten Enzyme der Fettsäuresynthese in nur ein bis zwei multifunktionellen Proteinen enthalten sind, die ihrerseits einen Komplex bilden (eukaryontischer Fettsäure-Synthase-Komplex). Da der Fettsäuresyntheseapparat der Plastiden dem von vielen Bakterien ähnlich ist, bezeichnet man ihn auch als prokaryontischen Fettsäure-Synthase-Komplex.

In der neugebildeten Fettsäure wird die erste Doppelbindung durch eine lösliche Desaturase eingefügt
Das im Plastidenstroma gebildete Stearoyl-ACP (18:0) wird im Stroma zu Oleoyl-ACP (18:1) desaturiert (Abb. 15.15A).

Diese Reaktion kann als eine Monooxygenierung aufgefasst werden, bei der von einem O2-Molekül ein 0-Atom zu Wasser reduziert wird und das andere in der Fettsäurekette als Hydroxygruppe eingebaut wird (Abschn. 18.2). Durch nachfolgende Abspaltung von H20 von dem Kohlenwasserstoff (analog der ß-Hydroxyacyl-ACP-Dehydratasereaktion, Abb. 15.8) entsteht eine Kohlenstoffdoppelbindung, im Gegensatz zur Fettsäuresynthese allerdings in cis-Konfiguration. Die Monooxygenierung erfordert zwei Elektronen, die im Plastiden durch NADPH über reduziertes Ferredoxin geliefert werden. Monooxygenasen sind bei Bakterien, Pflanzen und Tieren weit verbreitet. In den meisten Fällen erfolgt die Aktivierung des O2 durch ein spezielles Cytochrom, das so genannte "Cytochrom P450". Bei der Stearoyl-ACP-Desaturase dagegen reagiert das O2Molekül mit einem Di-Eisen-Oxo-Zentrum (Abb. 15.16). Als Redoxüberträger haben wir bisher Eisen-Schwefel-Zentren kennengelernt, bei denen die Fe-Atome über Cysteinreste an Proteine gebunden werden (Abb. 3.26). Bei dem 2Fe-Oxo-Zentrum der Desaturase sind zwei Eisenatome über Carboxygruppen von Glutamat und Aspartat an das Enzym gebunden. Die beiden Fe-Atome wechseln zwischen den Oxidationsstufen +IV, +III und +II. Die Aktivierung von O2 erfolgt durch eine Anlagerung zwischen den beiden Fe-Atomen.

Die Stearoyl-ACP-Desaturase ist ein lösliches Protein, welches in Chloroplasten und anderen Plastiden lokalisiert ist. Das Enzym ist so aktiv, dass neu gebildetes Stearoyl-ACP in der Regel fast vollständig zu Oleoyl-ACP (18:1) umgesetzt wird (Abb. 15.17). Allerdings ist diese Desaturase nur zur Einführung einer Doppelbindung geeignet.

Die Einführung weiterer Doppelbindungen erfolgt über Desaturasen, welche integrale Membranproteine des endoplasmatischen Reticulum (ER) und der plastidären inneren Hüllmembran sind. Diese Desaturasen reagieren nur mit Fettsäuren, die veresterte Bestandteile von Membranlipiden sind. Man bezeichnet sie daher als Acyllipid-Desaturasen. Acyllipid-Desaturasen benötigen O2 als Reaktionspartner, ähnlich wie die im Vorangehenden besprochene ACP-Desaturase. Während die plastidären Acyllipid-Desaturasen das NADPH- und Ferredoxin-abhängige Elektronentransportsystem nutzen, verwenden die extraplastidären, ER-ständigen Acyllipid-Desaturasen eine andere Elektronentransportkette (Abb. 15.15 B).

Die erforderlichen Reduktionsäquivalente werden von NADPH über eine FAD enthaltende NADPH-Cytochrom b5-Reduktase auf Cytochrome-b5 und von dort weiter auf die eigentliche Desaturase übertragen. Acyllipid-Desaturasen enthalten zwei Fe-Atome, die wahrscheinlich durch Histidin-Reste des Proteins gebunden sind. In Plastiden wirkt Ferredoxin als Reduktionsmittel. Die Acyllipid-Desaturasen gehören zu einer großen Familie von Enzymen. Mitglieder dieser Enzymfamilie katalysieren die Einführung von Hydroxylgruppen (Hydroxylasen), von Epoxygruppen (Epoxygenasen) und Kohlenstoff-Dreifach-Bindungen (Acetylenasen) in Fettsäuren von Acyllipiden.

Das in den Plastiden als Produkt der Fettsäuresynthese gebildete Acyl-ACP hat zwei Verwendungszwecke
Das in den Plastiden gebildete Acyl-ACP hat zwei wichtige Funktionen:
1. Für die Verwendung innerhalb der Plastiden wirkt es als Acyldonor für die Synthese plastidärer Membranlipide. Enzyme der Glycerolipidsynthese sind teilweise sowohl in der inneren als auch in der äußeren Hüllmembran vorhanden. Bei der Lipidsynthese findet zwischen diesen beiden Membranen mitunter auch eine Arbeitsteilung statt. Wir werden im Folgenden aber nicht zwischen der Lipidsynthese der inneren und äußeren Hüllmembran unterscheiden, um den Rahmen dieses Buches nicht zu sprengen.
2. Für die Umsetzung außerhalb der Plastiden wird das Acyl-ACP durch Acyl-ACP-Thioesterasen hydrolytisch in Fettsäuren und ACP gespalten (Abb. 15.17). Die so freigesetzten Fettsäuren verlassen die Plastiden, wobei nicht bekannt ist, ob dies über unspezifische Diffusion oder einen spezifischen Transport erfolgt. An der äußeren Hüllrnembran werden diese freien Fettsäuren bereits wieder abgefangen, indem sie durch eine Acyl-CoA-Synthetase unter Verbrauch von ATP zu Acyl-CoA umgesetzt werden. Da durch die Thio-esterasen in den Plastiden in erster Linie 16:0- und 18:1-Acyl-ACP und nur in geringem Maße 18:0-Acyl-ACP gespalten wird, werden durch die Plastiden hauptsächlich CoA-Ester mit den Acylresten 18:1und 16:0 (in geringen Mengen auch 18:0) für den extraplastidären Lipidmetabolismus synthetisiert.

15.4 Glycerin-3-phosphat ist Ausgangssubstrat für die Synthese von Glycerolipiden
Glycerin-3-phosphat ist das Ausgangssubstrat für die Synthese der Glycerolipide; es wird durch die Reduktion von Dihydroxyacetonphosphat mit NADH als Reduktionsmittel gebildet (Abb. 15.18). Entsprechende Dihydroxyacetonphosphat-Reduktasen gibt es sowohl im Plastidenstroma als auch im Cytosol. Bei der plastidären Lipidsynthese werden die Acylreste direkt vom Acyl-ACP auf Glycerin-3-phosphat übertragen. Bei der ersten Acylierung in Position 1 wird meist ein 18:1-, seltener ein 16:0- und in wenigen Fällen auch ein 18:0-Acylrest übertragen. In die C-2-Position wird hingegen stets ein 16:0-Acylrest übertragen. Da man diese Spezifität auch bei Cyanobakterien beobachtet, bezeichnet man die Glycerolipidsynthese der Plastiden auch als prokaryontischen Weg.

Bei der Glycerolipidsynthese an der ER-Membran wird der Acylrest von Acyl-CoA übertragen. Auch hier wird in C-1-Position ein 18:1-, 16:0- oder 18:0-Acylrest verestert, in C-2-Position jedoch stets ein C18-Acylrest unterschiedlichen Desaturierungsgrades. Man spricht von einem eukaryontischen Weg.
Die Bindung der polaren Kopfgruppen an die Membranlipide erfolgt meist über eine Aktivierung der Kopfgruppen, kann aber auch über eine Aktivierung des Diacylglycerins erfolgen. Für die Aktivierung von Cholin und Ethanolamin werden diese zunächst durch ATP über spezifische Kinasen phosphoryliert und dann über Cytidyltransferasen durch Reaktion mit CTP zu CDP-Cholin und CDP-Ethanolamin umgesetzt (Abb. 15.19).

Galactose als Kopfgruppe wird als UDP-Galactose aktiviert (Abb. 15.20).

Letztere wird aus Glucose-1-phosphat und UTP über die UDP-Glucose-Pyrophosphorylase (Abschn. 9.2) und die UDP-Glucose-Epimerase (Abb. 9.21) gebildet. Bei der Synthese von Digalactosyldiglycerid (DGDG) aus Monogalactosyldiglycerid (MGDG) wird ein Galactoserest wiederum von UDP-Galactose übertragen. Auch Sulfochinovose wird als UDP-Verbindung aktiviert, wobei auf Details der Synthese dieses Restes hier nicht eingegangen wird. Akzeptor für die aktivierten Kopfgruppen ist Diacylglycerin, das durch Abspaltung des Phosphatrestes von der Phosphatidsäure gebildet wird.

An der ER-Membran werden Fettsäuren verlängert und in der ER-Membran desaturiert
Wie in Abbildung 15.17 gezeigt ist, werden durch die Plastiden 16:0-, 18:1- und auch in geringem Maße 18:0-Acylreste angeliefert. Manche Speicherfette enthalten jedoch längerkettige Fettsäuren. Dies trifft auch für Wachse zu, die Ester einer sehr langkettigen Fettsäure (C20 bis C24) mit einem sehr langkettigen Alkylalkohol (C24 bis C32) sind. Die Verlängerung der Fettsäuren über C-18 hinaus erfolgt durch so genannte Elongasen, die am endoplasmatischen Reticulum lokalisiert sind (Abb. 15.21). Die Elongation erfolgt wiederum über C2-Stufen; Intermediate und Produkte der Elongation sind Acyl-CoA-Thioester

In der ER-Membran kann auch eine weitere Desaturierung der Acylreste erfolgen. Dazu müssen sie zunächst in Phospholipide, zum Beispiel Phosphatidylcholin, eingebaut werden (Abb. 15.21).

Durch Desaturasen in der Membran des endoplasmatischen Reticulums kann eine Desaturierung von Oleat (18:1) über Linoleat (18:2) bis zum Linolenat (18:3) erfolgen. Durch Acylaustausch kann der 18:2- oder 18:3-Acylrest in C-2-Position des Glycerins gegen einen 18:1-Acylrest ausgetauscht werden, letzteres wird dann gegebenenfalls wieder desaturiert.
Durch das Zusammenspiel von Plastiden und ER steht der Zelle für die verschiedenen Bedürfnisse im Cytosol ein Acyl-CoA-Pool zur Verfügung, für den die 16:0-, 18:0- und 18:1-Acylreste von den Plastiden bereitgestellt und die längerkettigen und höher ungesättigten Acylreste durch Modifikation am ER und in der ER-Membran gebildet werden.

Ein Teil der plastidären Membranlipide wird über den eukaryontischen Weg gebildet
Wie bereits besprochen, erfolgt die Synthese der für die Plastidenmembranen bestimmten Glycerolipide in den Hüllmembranen der Plastiden. Neben dem prokaryontischen Weg, bei dem die Acylreste vom Acyl-ACP übertragen werden, wird aber auch ein Umweg über den eukaryontischen Weg beschritten. Die Desaturasen der ER-Membran werden benutzt, um zweifach ungesättigte Fettsäuren für plastidäre Membranlipide herzustellen. Ausgangsprodukt kann dabei ein Phospholipid mit zweifach ungesättigten Fettsäuren sein, das nach Abbildung 15.21 in der ER-Membran gebildet wurde. Dieses wird in die Hüllmembran der Plastiden transferiert und zu Diacylglycerin hydrolysiert (Abb. 15.22). Das Diacylglycerin wird vorzugsweise mit einem oder zwei Galactoseresten als Kopfgruppe versehen. Durch eine in den Hüllmembranen vorhandene Desaturase können die Acylreste weiter zu 18:3 desaturiert werden.

Es gibt aber auch in den Plastidenhüllmembranen Desaturasen, die lipidgebundene 18:1- und 16:0-Acylreste desaturieren können. Ein Vergleich der Acylreste in der C2-Position (beim prokaryontischen Weg 16:0, beim eukaryontischen Weg 18:n) zeigt jedoch, dass ein großer Teil der hochungesättigten Galactolipide der Plastiden über den eukaryontischen Umweg gebildet werden. Die in den Hüllmembranen gebildeten Membranlipide werden möglicherweise über ein Transferprotein in die Thylakoidmembran übertragen.

15.5 Triacylglycerine werden in den Membranen des endoplasmatischen Reticulums gebildet
In reifen Samen beträgt der Lipidgehalt meist 45 % des Trockengewichts, kann aber in einzelnen Fällen, beispielsweise bei Ricinus, 85% des Trockengewichts ausmachen. Ausgangssubstanz für die Triacylglycerinsynthese ist wiederum Glycerin-3-phosphat. Für die Synthese gibt es mindestens vier Wege, von denen hier nur die zwei wichtigsten gezeigt werden (Abb. 15.23). Durch zweifache Acylierung des Glycerin-3-phosphats entsteht Phosphatidsäure, nach Hydrolyse des Phosphatrestes wird dann auch Position 3 acyliert. Für die Acylierung steht der gesamte Acyl-CoA-Pool (Abb. 15.21) zur Verfügung. Allerdings wird die C-2-Position meist über den eukaryontischen Weg mit einem C18-Rest acyliert. Bei dem zweiten Weg wird zunächst Phosphatidylcholin gebildet, die darin enthaltenden Fettsäuren werden weiter desaturiert, der Cholinphosphatrest abgespalten und das entsprechende Diacylglycerin acyliert. Dieser Weg wird oft für die Synthese von hochungesättigten Triacylglycerinen beschritten. Zwischen den beiden gezeigten Wegen bestehen Querverbindungen, auf die in Abbildung 15.23 jedoch nicht eingegangen wird.


Pflanzliche Fette werden nicht nur als Nahrungsmittel, sondern auch als Rohstoffe für die Industrie genutzt
Der menschliche Stoffwechsel benötigt zwei- und mehrfach ungesättigte Fettsäuren, kann aber keine Doppelbindungen in den Positionen 12 und 15 einfügen. Daher sind Linol- und Linolensäure (Abb. 15.4) für den Menschen essenzielle Fettsäuren, die mit der Nahrung aufgenommen werden müssen. Pflanzliche Fette zeichnen sich gegenüber tierischen Fetten dadurch aus, dass sie einen viel höheren Gehalt an ungesättigten Fettsäuren aufweisen. Pflanzliche Fette haben einen großen Anteil an der menschlichen Ernährung. In Industrieländern werden etwa 20% des calorischen Nahrungsbedarfs durch Pflanzenfette gedeckt. Pflanzliche Fette sind aber auch ein wichtiger Industrierohstoff. Die nach Hydrolyse von Triacylglycerinen (Verseifung) gewonnenen Fettsäuren werden in Form der Alkalisalze als Seife genutzt. Auch Fettsäurealkohole und sulfonierte Fettsäuremethylester finden Verwendung als Detergenzien. In letzter Zeit werden erhebliche Erntemengen pflanzlicher Öle zu Fettsäuremethylester verarbeitet, um als „Biodiesel" als Autotreibstoff genutzt zu werden. Das dabei in großen Mengen anfallende Glycerin ist eine wichtige Ausgangssubstanz für die chemische Industrie.
Tabelle 15.3 zeigt, dass die Fettsäurezusammensetzung verschiedener Pflanzenöle sehr unterschiedlich ist.

Manche pflanzlichen Triacylglycerine enthalten in großen Mengen seltenere Fettsäuren, die industriell verwendet werden (Tab. 15.4). So hat Öl aus Palmkernen einen hohen Gehalt an der kurzkettigen Laurinsäure (12:0), die als Ausgangssubstanz für die Produktion von Waschmitteln, Kosmetika und Detergenzien benutzt wird. Große Plantagen von Kokos- und Ölpalmen in Südostasien sichern die Versorgung der oleochemischen Industrie. Linolensäure aus europäischen Leinsamen dient zur Herstellung von Anstrichmitteln.

Ricinolsäure (Abb. 15.24), eine seltene Fettsäure, die in C-12-Position eine Hydroxygruppe enthält und etwa 90% der Fettsäuren im Ricinusöl ausmacht, wird als Schmiermittel und auch als Oberflächenschutz industriell genutzt.

Ähnliche oleochemisch-technische Verwendungen findet auch die Erucasäure (Abb. 15.24). Erucasäure war ein ernährungsphysiologisch als minderwertig eingestufter Bestandteil des Rapsöls, bis es vor 35 Jahren durch Kreuzungen gelang, erucasäurefreien Raps (sog. Null-Raps) zu züchten. Die Angaben in Tabelle 15.3 beziehen sich auf diese jetzt weltweit angebaute Sorte. Inzwischen werden für die Bedürfnisse der Industrie auch wieder erucasäurehaltige Rapssorten angebaut.

Durch molecular engineering werden Pflanzenfette maßgeschneidert
Die Fortschritte der Molekularbiologie machen es heute möglich, durch eine molekulargenetische Beeinflussung der Enzymausstattung die Qualität der pflanzlichen Fette gezielt zu verändern. Die Verfahren zur Einführung eines neuen Enzyms oder zur Ausschaltung eines in der Pflanze vorhandenen Enzyms werden in Kapitel 22 eingehend besprochen. Die Möglichkeiten zur molekulargenetischen Veränderung von Ölfrüchten sollen bereits hier an drei Beispielen illustriert werden:
Die im Palmkern- und Kokosnussöl vorhandene Laurinsäure (12:0) ist ein wichtiger Rohstoff für die Herstellung von Seifen, Detergenzien und Kosmetika. Durch genetische Transformation konnte man Rapspflanzen erzeugen, deren Öl zu 66 % Laurinsäure enthält. Wie in Abbildung 15.17 gezeigt ist, wird die Synthese der Fettsäuren durch die Hydrolyse des Acyl-ACP beendet. Aus den Samen des California bay tree (Umbellularia californica), die in ihren Speicherlipiden einen sehr hohen Laurinsäureanteil besitzen, wurde eine Acyl-ACP-Thioesterase isoliert, die spezifisch Lauroyl-ACP spaltet und die kodierende cDNA kloniert. Durch die Einführung des Gens dieser Acyl-ACP-Thioesterase in sich entwickelnde Rapssamen wird auch dort die Fettsäuresynthese auf der Stufe 12:0 abgebrochen; die freigesetzte Laurinsäure wird sogar in das Samenöl eingebaut. Bisherige Freilandversuche zeigten, dass diese Pflanzen normal wachsen und normale Erträge liefern können.
Zur Erhöhung der Hitzebeständigkeit von Frittierfetten oder für die Herstellung von Margarine sind Fette erwünscht, die einen relativ hohen Anteil an Stearat (18:0) haben. Durch eine drastische Verminderung der Stearoyl-ACP-Desaturase mittels Antisense-Technik ist es gelungen, die Bildung von Oleat (18:1) zu unterdrücken und den Stearatgehalt im Rapsöl von 1 bis 2% auf 40% zu erhöhen. Es wird aber auch daran gearbeitet, durch gentechnische Methoden den Anteil hochungesättigter Fettsäuren in Ölsaaten zu erhöhen, um so dem Öl eine höhere Qualität für die menschliche Ernährung zu verleihen. Bei Sojabohnen konnte so der Anteil zweifach ungesättigter Fettsäuren auf 30% erhöht werden.
Ernährungsphysiologen haben herausgefunden, dass hochungesättigte Fettsäuren (20:4, 20:5, 22:6), die nur in Ölen von Fischen vorkommen, für die menschliche Gesundheit besonders förderlich sind. Dabei sind relativ kleine Mengen in der Nahrung ausreichend. Inzwischen wurden transgene Rapssorten erzeugt, die in ihrem Öl die genannten hochungesättigten C20 und C22 Fettsäuren enthalten. Dies ist ein Beitrag der Gentechnik, um health food zu erzeugen.
Erucasäure (Abb. 15.24) ist ein wichtiger Industrierohstoff, beispielsweise für die Synthese von Kunstfasern und von Schaumbremsern bei Waschmitteln. Die Verwendung von Erucasäure wird aber derzeit dadurch begrenzt, dass selbst bei dem erucasäurehaltigen Raps die Erucasäure nur etwa 50% der Fettsäuren im Samenöl ausmacht. Die Kosten für die Abtrennung der Erucasäure und die Entsorgung der anderen Fettsäuren sind so hoch, dass sich für viele Zwecke eine industrielle Verwendung von Rapsöl nicht rechnet. Durch eine Überexpression von Genen für Elongasen und den gentechnischen Transfer von Enzymen, die den spezifischen Einbau von Erucasäure in die C2-Position der Triacylglycerine bewirken, wird derzeit versucht, den Erucasäuregehalt im Raps wesentlich zu erhöhen. Dies wäre ein Beitrag, um bisherige petrochemische Syntheseverfahren durch die Verwendung nachwachsender Rohstoffe zu ersetzen.

15.6 Die Mobilisierung des Kohlenstoffs aus den Speicherlipiden während der Samenkeimung erfolgt in den Glyoxisomen
Zu Beginn der Samenkeimung werden Speicherproteine (Kap. 14) in Aminosäuren zerlegt und aus diesen dann die zur Mobilisierung der Speicherlipide erforderlichen Enzyme synthetisiert. Zu diesen Enzymen gehören Lipasen, welche die Hydrolyse von Triacylglycerinen zu Glycerin und Fettsäuren katalysieren. Lipasen binden an die Oleosine der Ölkörper (Abschn. 15.2). Das bei der Fettspaltung gebildete Glycerin kann durch Phosphorylierung in Glycerin-3-phosphat und nachfolgende Oxidation zu Dihydroxyacetonphosphat in den Gluconeogeneseweg eingespeist werden (Kapitel 9). Die freigesetzten Fettsäuren werden zunächst als CoA-Thioester aktiviert und dann durch die ß-Oxidation in Acetyl-CoA-Moleküle zerlegt (Abb. 15.25). Dieser Prozess erfolgt in dafür spezialisierten Peroxisomen, die als Glyoxisomen bezeichnet werden . Man hat beobachtet, dass sich Ölkörper und Glyoxisomen zusammenlagern, wahrscheinlich damit der Transfer von Fettsäuren von den Ölkörpern in die Glyoxisomen stattfinden kann.
Die ß-Oxidation stellt zwar im Prinzip eine Umkehr der im Abbildung 15.8 gezeigten Fettsäuresynthese dar; es bestehen jedoch wesentliche Unterschiede, welche die jeweiligen hohen Flussraten dieser beiden in entgegengesetzter Richtung ablaufenden Stoffwechselwege ermöglichen. Die ß-Oxidation unterscheidet sich von der unmittelbaren Umkehr der Fettsäuresynthese unter anderem durch folgende Punkte:
•Bei der Dehydrogenierung des Acyl-CoA wird der Wasserstoff über eine FAD-abhängige Oxidase in irreversibler Reaktion auf O2 übertragen. Das toxische H2O2 wird am Ort der Entstehung von einer Katalase durch Spaltung in Wasser und Sauerstoff eliminiert (vgl. Abschn. 7.1). Allerdings kann es bei der Samenkeimung auch geschehen, dass durch eine sehr hohe Rate der ß-Oxidation so viel H2O2 gebildet wird, dass es aus den Glyoxisomen entweicht und zu Zellschädigungen führt.
• Bei der Hydratisierung des Enoyl-CoA wird ß-1-Hydroxyacyl-CoA gebildet, im Gegensatz zu dem entsprechenden D-Enantiomer bei der Synthese.
• Beim zweiten Dehydrogenierungsschritt wird der Wasserstoff auf NAD+ übertragen. In der Regel ist das NAD-System in der Zelle weitgehend oxidiert (Abschn. 7.3), so dass dadurch die Reaktion in Richtung Hydroxyacyl-CoA-Oxidation getrieben wird. Es ist nicht bekannt, durch welche Reaktionen das so in den Peroxisomen gebildete NADH wieder verbraucht wird.
• Das gebildete ß-Ketoacyl-CoA wird durch CoA-SH vermittelte Thiolyse in irreversibler Reaktion in ein Molekül Acetyl-CoA und ein um zwei C-Atome verkürztes Acyl-CoA gespalten.

Beim Abbau der ungesättigten Fettsäuren entstehen Zwischenprodukte, die durch die Reaktion der ß-Oxidation nicht metabolisiert werden können. So entsteht beim Abbau von Ölsäure Δ3-cis-Enoyl-CoA (Abb. 15.26). Durch eine Isomerase wird unter Verschiebung der Doppelbindung Δ2-trans-Enoyl-CoA gebildet, das ein Intermediat bei der ß-Oxidation ist. Bei der ß-Oxidation der Linol- oder Linolensäure ist die zweite Doppelbindung in dem entsprechenden Zwischenprodukt zwar an der richtigen Position, aber in cis-Konfiguration. Dies hat zur Folge, dass die Hydratisierung durch die Enoyl-CoA-Hydratase zur Bildung von ß-D-Hydroxyacyl-CoA führt. Letzteres wird durch eine Dehydratase zu Δ2-trans-Enoyl-CoA, einem Intermediat der ß-Oxidation, umgesetzt.


Über den Glyoxylatcyclus können Pflanzen aus Acetyl-CoA Hexosen synthetisieren
Tiere können aus Acetyl-CoA keine Glucose synthetisieren. Pflanzen sind dazu in der Lage, da sie den Enzymapparat des Glyoxylatcyclus besitzen (Abb. 15.27).

Dieser ist ebenso wie die ß-Oxidation in den Glyoxisomen lokalisiert, die nach diesem Cyclus benannt sind. Die beiden ersten Reaktionen des Cyclus gleichen denen des Citratcyclus (siehe Abb. 5.3). Acetyl-CoA kondensiert mit Oxalacetat durch die Citrat-Synthase zu Citrat und letzteres wird im Cytosol durch die Aconitase zu lsocitrat umgesetzt. Die weitere Reaktion des lsocitrats ist jedoch eine Besonderheit des Glyoxylatcyclus: Durch eine Isocitrat-Lyase wird Isocitrat in Succinat und Glyoxylat gespalten (Abb. 15.28).

Die Malat-Synthase, das zweite spezielle Enzym des Glyoxylatcyclus, bewirkt, dass das gebildete Glyoxylat durch Kondensation mit Acetyl-CoA sofort weiter zu Malat reagiert. Diese Reaktion ist wegen der Spaltung des CoA-Thioesters irreversibel. Malat wird wie im Citratcyclus durch eine Malat-Dehydrogenase zu Oxalacetat oxidiert, und damit schließt sich der Glyoxylatcyclus. Insgesamt wird so unter Verbrauch von zwei Molekülen Acetyl-CoA ein Molekül Succinat erzeugt. Das Succinat gelangt in die Mitochondrien und wird dort durch einen Teilabschnitt des Citratcyclus zu Oxalacetat umgesetzt. Das Oxalacetat wird durch den Oxalacetat-Translokator aus den Mitochondrien exportiert und im Cytosol durch die dort vorhandene Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (Abb. 8.10) in Phosphoenolpyruvat umgewandelt. Phosphoenolpyruvat ist Ausgangsprodukt für die Synthese von Hexosen durch den Gluconeogeneseweg und für andere Biosynthesen.

Reaktionen mit toxischen Zwischenprodukten laufen in den Peroxisomen ab
Die ß-Oxidation und der eng damit verbundene Glyoxylatcyclus finden in den Pflanzen in dafür spezialisierten Peroxisomen, den Glyoxisomen, statt. Dafür gibt es eine einfache Erklärung: Wie bei der Photorespiration, an der ebenfalls Peroxisomen beteiligt sind (Abschn. 7.1), entstehen auch bei der Umwandlung der Fettsäuren in Succinat die toxischen Substanzen H2O2 und Glyoxylat als Zwischenprodukte. Durch eine Kompartimentierung in den Peroxisomen wird vermieden, dass diese toxischen Substanzen in das Cytosol gelangen (Abschn. 7.4). Eine ß-Oxidation von Fettsäuren findet, allerdings in geringerem Maße, auch in den Blattperoxisomen statt. Die ß-Oxidation dient hier dem „Recycling" von nicht mehr benötigten oder geschädigten Fettsäuren. Dieses Recycling hat eine besondere Bedeutung bei der Seneszenz von Blättern; aus den Membranlipiden der seneszierenden Blätter werden Kohlenhydrate gewonnen, die dann durch das Phloem abgeleitet werden (Abschn. 19.7). Tatsächlich ist während der Seneszenz eine Differenzierung von Blatt-Peroxisomen zu Gerontosomen zu beobachten. Auch werden in den Peroxisomen die hydrophoben Aminosäuren Leucin und Valin abgebaut.
Glyoxisomen enthalten wie Blatt-Peroxisomen (Abschn. 7.1) in ihren Grenzmembranen Porine (Abschn. 1.8), welche den Austausch von Metaboliten zwischen dem glyoxisomalen und cytosolischen Kompartiment ermöglichen.

15.7 Lipoxygenasen sind an der Synthese von Aroma-, Abwehr- und Signalstoffen beteiligt sowie auch an der Mobilisierung von Speicherlipiden
Oxylipine, gebildet durch die Oxygenierung ungesättigter Fettsäuren, umfassen eine Vielfalt verschiedener Signalsubstanzen im Tier- und Pflanzenreich. In Tieren gehören dazu Prostaglandine, Leucotriene und Thromboxane, deren spezifische Funktion zu einem großen Teil aufgeklärt ist. Die Oxylipine in Pflanzen, meist unterschiedlich von denen in Tieren, sind u.a. als Bestandteile an Signalkaskaden von Abwehrreaktionen beteiligt, wirken aber auch als Fungizide, Bakterizide und Insektizide. Als volatile Signale locken sie Predatoren an, d.h. räuberische Insekten, welche sich von pflanzlichen Fraßfeinden ernähren. Darüber hinaus haben Oxylipine eine Rolle bei der Wundheilung, der Wachstumsregulation und der Seneszenz. Es gibt über die Funktion der Oxylipine noch viele ungelöste Fragen.
In Pflanzen werden Oxylipine in erster Linie durch Lipoxygenasen gebildet. Es handelt sich dabei um Dioxygenasen, welche den Einbau beider Atome des Sauerstoffmoleküls in ein Fettsäurernolekül katalysieren, im Gegensatz zu den Monooxigenasen (Abschn. 15.3) die nur ein 0-Atom in das Substrat einbauen. Lipoxygenasen bilden eine Familie von Enzymen, welche die Dioxygenierung mehrfach ungesättigter Fettsäuren wie Linol- und Linolensäure, die eine cis, cis-1,4-Pentadiensequenz (in Abb. 15.29 rot markiert) besitzen, katalysieren. Durch die Reaktion mit O2 wird am Ende dieser Sequenz eine Hydroperoxidgruppe eingefügt; dabei wird die benachbarte Doppelbindung um eine Position gegen die zweite Doppelbindung verschoben und nimmt eine trans-Konfiguration ein. Die Hydroperoxid-Lyase katalysiert die Spaltung der Hydroperoxylinolensäure in eine 12-0xosäure und 3-cis-Hexenal. Durch Verschiebung der Doppelbindung werden weitere Hexenale gebildet und durch deren Reduktion Hexenole (Abb. 15.29). In analoger Weise reagiert auch Hydroperoxylinolsäure, dabei entsteht Hexanal und durch dessen Reduktion Hexanol.

Hexanale, Hexenale, Hexanole und Hexenole sind flüchtige Aromastoffe; sie sind wichtige Komponenten des charakteristischen Geruchs und Geschmacks vieler Früchte und Gemüse. Ihr Aroma reicht von fruchtig, süßlich, würzig bis grasartig. Beispielsweise sind Hexenole eine wichtige Geschmackskomponente bei Tomaten. Um den Geschmack von Tomaten zu verbessern, wird daran gearbeitet, den Hexenolgehalt von Tomaten auf gentechnischem Wege zu erhöhen. Auch die Qualität des Olivenöls beruht auf dem Gehalt an Hexenalen und Hexenolen. Hexenale sind auch für das Aroma des schwarzen Tees verantwortlich. Bei der Prozessierung des grünen Tees zu schwarzem Tee durch Erhitzung kondensieren Hexenale zu aromatischen Verbindungen, die dem schwarzen Tee seinen typischen Geschmack verleihen. Hexenale und Hexenole werden in beträchtlichen Mengen industriell als Aromastoffe für die Nahrungsmittelindustrie und als Duftstoffe hergestellt.
Der starke Geruch von frisch geschnittenem Gras wird vor allem durch freigesetzte Hexenale und Hexenole verursacht. Man kann daraus erkennen, dass die Aktivitäten der Lipoxygenase und der Hydroperoxid-Lyase bei Verletzung einer Zelle sehr stark erhöht sind. Dies ist Teil von Abwehrreaktionen: Durch die Emission der oben genannten flüchtigen Substanzen nach Verletzung der Pflanze durch Insekten werden deren natürliche Feinde herbeigerufen. So werden nach der Verletzung von Mais- und auch von Baumwollpflanzen parasitische Wespen angelockt, die in die auf den Blättern befindliche Schmetterlingsraupen ihre Eier ablegen und sie so abtöten. Zudem ist 2-trans-Hexenal (in Abb. 15.29 rot markiert) ein starkes Bakterizid, Fungizid und Insektizid. 12-0xo-10-dodecensäure, das durch Verschiebung einer Doppelbindung aus dem Spaltungsprodukt der Hydroperoxy-Linolensäure gebildet wird, hat die Eigenschaften eines Wundhormons und wird daher als Traumatin bezeichnet. Traumatin löst in angrenzenden Zellen Zellteilungen aus. Eine dadurch verursachte Kallusbildung führt zum Wundverschluss. Unsere Kenntnisse über diese Abwehrvorgänge sind jedoch noch sehr lückenhaft.
Hydroperoxy-α-linolensäure wird durch eine Divinylether-Synthase in einen Divinylether (Abb. 15.30) überführt. Divinylether werden in Kartoffeln nach Infektion durch den Oomyceten Phytophtera infestans, den Erreger der Kartoffelfäule, als Fungizid in hoher Konzentration gebildet. Allenoxid-Synthase und -Cyclase katalysieren eine Cyclisierung der 13-Hydroperoxy-a-Linolensäure (Abb. 15.30).

Kettenverkürzung des gebildeten Produkts durch ß-Oxidation (Abb. 15.25) führt zur Bildung der Jasmonsäure. Jasmonsäure und ihr Methylester sind hormonähnliche Signalsubstanzen, die an vielen unterschiedlichen Reaktionen beteiligt sind. Jasmonsäure spielt auch eine Rolle bei der Abwehr gegen Pathogene und Insekten, bei der Bildung von Blüten, Früchten und Samen sowie bei Prozessen während der Seneszenz (Abschn. 19.9). Nach Abschätzungen regulieren Jasmonate die Expression mehrerer hundert Gene.
Es wurde gezeigt, dass Lipoxygenasen auch an der Mobilisierung von in Ölkörpern (Abb. 15.6) gelagerten Speicherlipiden beteiligt sind. Die die Ölkörper umgebende Lipideinfachschicht enthält auch Lipoxygenasen. Diese bewirken die Einfügung von Peroxidgruppen in mehrfach ungesättigte Fettsäuren, welche Bestandteil der Triglyceride einiger Ölsaaten, wie Sonnenblume oder Lein, sind (Abb. 15.31). Erst danach erfolgt eine Hydrolyse dieser Triglyceride durch eine an die Ölkörper gebundene Lipase. Nach anschließender Reduktion werden die gebildeten Hydroxyfettsäuren in den Glyoxysomen über ß-Oxidation (Abb. 15.25) zu Acetyl-CoA abgebaut. Dieser Abbauweg der Speicherlipide erfolgt parallel zu dem "klassischen" Weg, bei dem der Abbau mit der Spaltung der Triglyceride durch Lipasen beginnt. Der Anteil beider Wege an der Mobilisierung von Speicherlipiden ist offenbar Spezies-abhängig. Das gebildete Acetyl-CoA dient als Ausgangssubstrat für die Gluconeogenese über den Glyoxylatcyclus .

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16 Spezialmetabolite erfüllen in Pflanzen spezielle ökologische Funktionen
Im Gegensatz zu den so genannten primären Metaboliten, wie beispielsweise Aminosäuren, Fettsäuren, Cytochromen und Chlorophyllen, die in allen Pflanzen vorkommen und dort überall die gleichen Funktionen, zum Beispiel in Photosynthese, Atmung oder Lipidsynthese, haben, gibt es in Pflanzen eine sehr große Anzahl von Substanzen, die offenbar keine direkte Funktion im Primärstoffwechsel besitzen und daher Spezialmetabolite (Sekundärmetabolite) genannt werden. Das Vorkommen bestimmter Spezialmetabolite ist oft nur auf wenige Pflanzenspezies beschränkt und hat dort in den meisten Fällen spezifische ökologische Funktionen: beispielsweise die Anlockung von Insekten zur Übertragung von Pollen, oder von Tieren zum Verzehr von Früchten für die Ausbreitung der Samen oder zur Abwehr von Herbivoren und Pathogenen, so dass sie als natürliche Pestizide fungieren. Für einige Metabolite wurden inzwischen auch Funktionen in der pflanzlichen Entwicklung, sowohl im Wachstum als auch der Reproduktion (Pollenbildung), gefunden.

16.1 Spezialmetabolite dienen oft dem Schutz gegen pathogene Mikroorganismen und Herbivoren
Pflanzen sind für viele Tiere, beispielsweise Insekten, Schnecken und Wirbeltiere, wegen ihres Protein- und Kohlenhydratgehaltes eine gute Nahrungsquelle. Da Pflanzen vor Tieren nicht weglaufen können, können sie sich nur dadurch schützen, dass sie für Tiere ungenießbar oder giftig sind. Eine Reihe toxischer Pflanzenproteine, zum Beispiel Amylasehemmer, Ricin und Lectine, haben wir bereits in Abschnitt 14.4 kennengelernt. Im Folgenden werden wir eine Vielfalt von Spezialmetaboliten wie Alkaloide (dieses Kapitel), Isoprenoide (Kapitel 17) und Phenylpropanoide (Kapitel 18) diskutieren, die als natürliche Pestizide vor pflanzenfressenden Tieren (Herbivoren) schützen oder auch vor pathogenen Mikroorganismen. In manchen Pflanzen machen diese natürlichen Pestizide 10% der Trockenmasse aus.
Abwehrsubstanzen gegen Herbivoren gehören oft zur ständigen Ausrüstung der Pflanzen, d.h. sie sind konstitutiv vorhanden. In einigen Fällen müssen die Spezialmetabolite erst zu aktiven Substanzen umgewandelt werden, z.B. entstehen aus Glucosinolaten Isothiocyanatderivat (Abschn. 16.4), oder die Blausäure wird aus cyanogenen Glycosiden freigesetzt (Abschn. 16.3). Eine weitere Möglichkeit existiert, dass Substanzen erst nach tierischem Fraß gebildet werden (induzierte Abwehr), z.B. werden in Akazien nach tierischem Fraß vermehrt Tannine gebildet, welche die Blätter ungenießbar machen (Abschnitt 18.7), oder Pflanzen senden nach Verletzung durch Fraßfeinde oder deren Eiablage Geruchsstoffe aus, die Raubinsekten (Predatoren), wie z.B. Schlupfwespen, anlocken, um die Fraßfeinde oder deren Eier abzutöten (indirekte Abwehr). Letzteres Beipiel zeigt, dass nicht nur feste oder gelöste sondern auch flüchtige Spezialmetabolite in diesem Zusammenhang betrachtet werden müssen.

Mikroben als Krankheitserreger
Bestimmte Pilze und Bakterien infizieren Pflanzen, um deren Ressourcen für die eigene Nahrungsversorgung zu nutzen. Da sie dadurch oft Krankheiten bei Pflanzen auslösen, bezeichnet man sie als Pathogene. Um Pflanzen wirksam zu infizieren, produzieren pathogene Mikroben Angriffssubstanzen wie zum Beispiel Enzyme, welche die pflanzlichen Zellwände angreifen, oder Toxine, welche Pflanzen schädigen. Ein Beispiel hierfür ist das durch den Pilz Fusicoccum amygdalis gebildete Fusicoccin (Abschn. 10.3). Die Bildung der Angriffssubstanzen setzt das Vorhandensein spezifischer Angriffsgene (Virulenzgene) bei den Pathogenen voraus.
Pflanzen wehren sich gegen Pathogene durch die Bildung von Abwehrsubstanzen. Hierzu benötigen sie spezifische Verteidigungsgene, die für Rezeptoren kodieren, die Angriffssubstanzen oder Elicitoren erkennen und daraufhin die Transkription der eigentlichen Abwehrgene (codieren z.B. für Biosyntheseenzyme von Abwehrsubstanzen) einschalten können. Das Wechselspiel dieser Gene entscheidet über den Erfolg von Angriff und Verteidigung.
Ist eine Pflanze suszeptibel (empfindlich, reizbar) und das Pathogen aggressiv, bezeichnet man das Pathogen als virulent. Man spricht dann von einer kompatiblen Reaktion. Wenn hingegen das zunächst infizierende Pathogen abgetötet oder zumindest in seinem Wachstum stark gehemmt wird, bezeichnet man dies als inkompatible Interaktion, die Pflanze ist resistent.

Phytoalexine werden von der Pflanze als Antwort auf eine Mikrobeninfektion gebildet
Abwehrsubstanzen gegen Mikroorganismen, insbesondere Pilze, werden oft erst als Antwort auf eine Infektion gebildet (induzierte Abwehr), ihre Synthese erfolgt dann innerhalb weniger Stunden. Man bezeichnet diese induzierbaren Abwehrsubstanzen als Phytoalexine (griech. alekein „abwehren"). Phytoalexine umfassen eine große Anzahl von Substanzen sehr unterschiedlicher Stoffklassen, vor allem Isoprenoide, Flavonoide und Stilbene, die eine antibiotische Wirkung gegen ein breites Spektrum pathogener Pilze und Bakterien besitzen. Im Gegensatz dazu werden Abwehrstoffe, die bereits vor der Infektion in der Pflanze vorhanden sind als präformierte Abwehrstoffe, oder Phytoantizipine bezeichnet. Zu diesen Substanzen gehören viele Sekundärmetabolite, die nach Befall durch Pathogene erst enzymatisch aktiviert werden müssen, z.B. die cyanogenen Glucoside und die Glucosinolate (siehe Abschn. 16.3 und 16.4). Auch pflanzliche Wurzelexsudate enthalten bakteriostatisch wirkende Metabolite, wie z.B. Cumarinsäuren, 3-Indolpropansäure, und Methyl-p-hydroxybenzoat, die Pathogenresistenz hervorrufen können. Als Abwehrsubstanzen werden von der Pflanze auch Enzyme gebildet, welche die Zellwand von Bakterien und Pilzen schädigen, wie ß-Glucanasen, Chitinasen und Proteinasen, sowie auch reaktive Sauerstoffverbindungen wie Superoxidradikal •O2 und H2O2 sowie Stickstoffmonoxid (NO) (Abschn. 19.9). Auch die Emission flüchtiger Metabolite wird als Antwort nach Pathogenbefall induziert, die wiederum direkt oder indirekt Abwehrmechanismen in anderen Blättern der eigenen Pflanze oder anderer Pflanzen in Nachbarschaft induzieren. Auslöser für die Synthese dieser verschiedenen Abwehrsubstanzen sind jeweils sehr unterschiedliche Signalmoleküle, die man als Elicitoren bezeichnet. Als Elicitoren wirken Proteine, die von den Pathogenen sezerniert werden. Es wirken aber auch Polysaccharidfragmente der eigenen Zellwand, die durch die Infektion entstanden sind, als Elicitoren oder auch Fragmente aus der Zellwand der Angreifer, die durch pflanzliche Abwehrenzyme freigesetzt wurden. Diese verschiedenen Elicitoren werden an jeweils spezifische Rezeptoren an der Außenseite der Plasmamembran der Pflanzenzellen gebunden. Die Bindung führt zur Auslösung von Signalkaskaden, an denen Proteinkinasen (Abschn. 19.1) und Signalsubstanzen wie Salicylsäure (Abschn. 18.2) und Jasmonsäure (Abschn. 15.7) beteiligt sind und die schließlich im Zellkern die Transkription von Genen für die Synthese von Phytoalexinen, reaktiven Sauerstoffverbindungen und Abwehrenzymen auslösen (Abschn. 19.9).
Elicitoren können auch eine infizierte Zelle dazu veranlassen, abzusterben, wobei die umliegenden Zellen ebenfalls absterben. In anderen Worten: Die Zelle begeht Selbstmord und reißt benachbarte Zellen mit in den Tod. Dies geschieht, indem die befallene Zelle Phenole produziert, um sich und ihre Umgebung zu vergiften. Dieser als hypersensitive Reaktion bezeichnete Zelltod dient dem Schutz der Pflanze, denn um das nekrotische Gewebe werden durch vermehrte Ligninsynthese die Zellwände verstärkt und die Pflanze schottet sich so gegen eine weitere Ausbreitung der Infektion ab. Diese Abwehrstrategie funktioniert bei biotrophen Pathogenen, also solchen, die lebendes Pflanzengewebe zur Ernährung benötigen.

Pflanzliche Abwehrstoffe können auch für den Menschen ein Risiko darstellen
Was für Tiere giftig ist, ist zumeist für den Menschen auch gesundheitsschädlich. Bei unseren Kulturpflanzen sind die giftigen Spezialmetabolite meist durch Züchtung vermindert oder entfernt worden. Aus diesem Grund sind Kulturpflanzen aber in der Regel anfälliger gegen Schädlinge als Wildpflanzen; ihr Anbau erfordert deshalb oft eine externe Schädlingsbekämpfung. Deshalb werden durch Einkreuzen von Wildpflanzen resistente Kulturpflanzen gezüchtet. Dies kann jedoch zu Problemen führen: Eine neu eingeführte Sorte einer insektenresistenten Kartoffel musste wieder vom Markt genommen werden, da die hohen Gehalte an toxischem Solanin (einem Alkaloid, siehe folgender Abschnitt) diese Kartoffeln für den menschlichen Verzehr ungeeignet machten. In einer in den USA verbreiteten Neuzüchtung von insektenresistentem Sellerie verursachte die zehnfache Erhöhung von Psoralen (Abschn. 18.2) schwere Hautschäden bei Gartenarbeitern. Man erkennt hieraus, dass auch eine natürliche Schädlingsbekämpfung Risiken in sich birgt. Eine Reibe der für den Menschen schädlichen pflanzlichen Inhaltsstoffe, zum Beispiel Proteine oder die im Folgenden behandelten cyanogenen Glucoside und Glucosinolate, werden durch Kochen zerstört. Letzteres läßt sich auch dadurch erklären, dass durch das Kochen die Thioglucosidase (Myrosinase), die die toxischen Isothiocyanate bildet, inaktiviert wird. Ein großer Teil der pflanzlichen Spezialmetabolite sind jedoch stabil und haben in höheren Konzentrationen eine cancerogene (krebserregende) Wirkung. Es gibt Schätzungen, dass mehr als 99% aller cancerogenen Substanzen, welche die Menschen in Industrieländern normalerweise mit der Nahrung aufnehmen, als pflanzliche Spezialmetabolite natürliche Bestandteile der Nahrung sind. Die Erfahrung zeigt aber auch, dass sich der Mensch gegen diese Schadstoffe recht gut schützen kann. Wie im Folgenden gezeigt, enthalten Pflanzen aber auch viele Wirkstoffe, die als Pharmazeutika zur Bekämpfung von Krankheiten eingesetzt werden können, oder einige Isothiocyanate, z.B. aus Kohlsorten, sind auch für die menschliche Gesundheit von Vorteil, da sie gegen bestimmte Krebsarten wirken.

16.2 Die Stoffklasse der Alkaloide umfasst eine Vielfalt heterocyclischer Spezialmetabolite
Als Alkaloide bezeichnet man alkalische Spezialmetabolite, die ein oder mehrere N-Atome als Bestandteil von Heterocyclen enthalten und häufig eine ausgeprägte pharmakologische Wirkung haben. Sie werden aus Aminosäuren gebildet. Sehr viele dieser Alkaloide dienen der Abwehr gegen Tiere und Mikroorganismen. Sie werden zumeist in der Vakuole gespeichert. Wegen des dort vorherrschenden sauren Milieus liegen sie in protonierter Form vor. Alkaloide werden seit alters her von den Menschen als Gifte, Genuss- und Rauschmittel und, vor allem auch in Form von Pflanzenauszügen, als Arzneien genutzt. Bereits 1806 isolierte der Apothekergehilfe Friedrich Wilhelm Sertürner aus dem Schlafmohn Morphin. Die Struktur des Morphins konnte aber erst 1952 endgültig aufgeklärt werden. Inzwischen sind mehr als 10000 Alkaloide bekannt, die sehr unterschiedliche Strukturen besitzen. Auf die Synthesewege, die ohnehin zum größten Teil noch unbekannt sind, kann hier nicht eingegangen werden.
Abbildung 16.1 zeigt eine kleine Auswahl wichtiger Alkaloide. Es ist üblich, Alkaloide nach den in ihnen enthaltenen Heterocyclen einzuteilen. Coniin, ein Piperidinalkaloid, ist als sehr starkes Gift im Schierling enthalten. Sokrates starb an diesem Gift, nachdem er den Schierlingsbecher trinken musste. Nicotin, ebenfalls sehr toxisch, enthält sowohl einen Pyridin- als auch einen Pyrrolidinring. Es wird in den Wurzeln von Tabakpflanzen gebildet und mit dem Xylemsaft in die Stängel und Blätter transportiert. Nicotinsulfat, ein Nebenprodukt der Tabakindustrie, wird als sehr effektives Insektizid, zum Beispiel zum Ausräuchern von Gewächshäusern benutzt. Man kennt kaum Insekten, die gegen Nicotin resistent wären. Tabakpflanzen, die durch genetische Manipulation nur noch 3-4 % des normalen Nicotingehaltes enthalten, weil dessen Enzyme Nicotin abbauen können, werden deutlich bevorzugt durch die Raupe Manduca sexta befallen. Das Rauschgift Cocain enthält als Heterocyclus Tropan, bei dem das N-Atom gleichzeitig der Bestandteil zweier Ringe ist. Ein weiteres bekanntes Tropanalkaloid ist Atropin (Formel nicht gezeigt), das unter anderem als Gift in der Tollkirsche (Atropa belladonna) vorkommt. In kleinen Dosen führt es zur Erweiterung der Pupillen und wird aus diesem Grund in der Medizin für Untersuchungen am Auge verwendet. Angeblich soll auch Kleopatra atropinhaltige Extrakte zu sich genommen haben, um schöne Augen zu bekommen. Der Konsum von höheren Dosen hingegen führt zu übermäßiger Heiterkeit bis hin zur Raserei und Tobsuchtsanfällen; daher der Name Tollkirsche. Die Substanz Chinin, ein Chinolinalkaloid aus dem in Südamerika vorkommenden Chinarindenbaum, war bereits den spanischen Eroberern als Anti-Malariamittel bekannt. Das Isochinolinalkaloid Morphin ist ein wichtiges Schmerzmittel und zugleich auch Ausgangssubstanz für die Synthese von Heroin. Coffein, das Stimulans des Kaffees, enthält als Heterocyclus ein Purin. Aus drei Lysinmolekülen werden Chinolizidin-Alkaloide gebildet, z.B. Lupinin und Lupanin, die vornehmlich in Lupinenarten vorkommen. Die Toxizität zeigt sich darin, dass im Herbst immer wieder Schafe sterben, die zu viel Lupinensaat gefressen haben. Pyrrolizidin-Alkaloide wie z.B. das Senecionin (Formel nicht gezeigt), von Pflanzen als Abwehrsubstanz gegen Herbivoren gebildet, sind jedoch für speziell adaptierte Herbivoren unschädlich und werden von diesen sogar akkumuliert. So nutzen diese Herbivoren pflanzliche Gifte als eigene Schutzmaßnahme gegen Predatoren, Parasitoide und Pathogene. Jedoch sind Pyrrolizidin-Alkaloide für den Menschen toxisch, weil sie in der Leber zu giftigen Metaboliten umgewandelt werden.

Auf der Suche nach neuen Heilmitteln werden Pflanzen in großem Maße auf ihre Inhaltsstoffe hin untersucht. Als Ergebnis systematischer Suche wird das aus der Eibe isolierte Alkaloid Paclitaxel (Handelsname Taxol) zur Krebstherapie genutzt. Derivate des Alkaloids Camptothezin aus dem Chinesischen „Happy Tree" Camptotheca acuminata sind derzeit als Krebstherapeutikum in der klinischen Erprobung. Man sucht nach neuen Mitteln gegen die Bekämpfung von Malaria und gegen Viren. Da pharmakologisch interessante Wirkstoffe oft nicht in großen Mengen aus Pflanzen gewonnen werden können, versucht man mit gentechnischen Methoden, entweder die Produktion in den betreffenden Pflanzen zu erhöhen oder die Pflanzengene in Mikroorganismen einzuschleusen, um die Synthese von diesen durchführen zu lassen.

16.3 Pflanzen setzen Blausäure frei, wenn sie von Tieren verletzt werden
Blausäure (HCN) hemmt die Cytochrom-Oxidase und ist daher ein sehr starkes Atmungsgift. Man schätzt, dass etwa 10 % aller Pflanzen sich mit diesem Gift gegen tierischen Fraß verteidigen. Daher kann beispielsweise der Verzehr der Kerne von Pfirsichen und anderem Steinobst oder von bitteren Mandeln für den Menschen tödlich sein. Damit Pflanzen, die ja ebenfalls eine mitochondriale Atmungskette besitzen, sich nicht selbst vergiften, enthalten sie die Blausäure in gebundener Form als so genanntes cyanogenes Glucosid. Ein Beispiel hierfür ist das unter anderem in den Kernen und Wurzeln des Pfirsich vorkommende Amygdalin (Abb. 16.2). Die cyanogenen Glucoside werden als stabile Verbindung in den Vakuolen gelagert. Die für die Spaltung des Glucosids erforderliche Glucosidase ist in einem anderen Kompartiment vorhanden. Wenn bei einer Verletzung der Zelle durch Fraß die Kompartimentierung aufgehoben wird, kommt die Glucosidase mit dem cyanogenen Glucosid in Kontakt. Das nach Abspalten des Zuckerrestes verbleibende Cyanhydrin ist sehr instabil und zerfällt spontan in Blausäure und einen Aldehyd. Eine Hydroxynitril-Lyase beschleunigt diese Reaktion. Zur Entgiftung in den cyanogenen Pflanzen kann das HCN auf die Aminosäure Cystein übertragen werden, dadurch entsteht Cyanoalanin. Letzeres kann entweder durch eine Nitrilase oder eine Hydratase zu einem unschädlichen Metaboliten (Asparaginsäure oder Asparagin) umgewandelt werden. Auch die entstehenden Aldehyde sind oft sehr toxisch. Häufig ist für ein fressendes Tier die Entgiftung dieser Aldehyde schwieriger als die Entgiftung der Blausäure. Die Bildung zweier verschiedener toxischer Substanzen macht die cyanogenen Glucoside zu einem besonders wirksamen Abwehrsystem.

16.4 Einige Pflanzen setzen bei Verletzung flüchtige Senföle frei
Eine ähnliche Schutzfunktion gegen Fraß bieten Glucosinolate, die auch als Senfölglucoside bezeichnet werden. Man findet Glucosinolate zum Beispiel im Rettich, verschiedenen Kohlarten, Kapuzinerkresse und im Senf. Abbildung 16.3 zeigt als Beispiel das im Kohl enthaltene Glucobrassicin, das aus Tryptophan gebildet wird. Nach Abspaltung des Glucoserestes durch eine Thioglucosidase entsteht ein sehr instabiles Produkt, aus dem nach Abspaltung des Sulfatrestes und Umlagerung spontan ein Isothiocyanat, das Senföl, entsteht. Andere Senfölprodukte wie Nitrile, Thiocyanat und Oxazolidin-2-thion werden bei unterschiedlichen zellulären pH-Werten und durch spezifische Proteine (engl. specifier proteins) gebildet. Bei Anwesenheit eines Nitrilspezifizierenden Proteins wird vor allem das entsprechende Nitril gebildet. Ist ein thiocyanatbildendes Protein vorhanden, entstehen bevorzugt Thiocyanate. Schließlich ist für die Entstehung von Epithionitrilen ein epithiospezifizierendes Protein notwendig. Es ist interessant, dass diese Strategie auch von einigen angepassten Insekten genutzt wird, da sie selbst solche spezifizierenden Proteine besitzen um die Konzentration der giftigen lsothiocyanate zu reduzieren. In einigen wurde auch eine Thioglucosidase zur Metabolisierung der Glucosinolate gefunden. Senföle sind in höheren Konzentrationen Gifte. Auch hier sind Glucosinolat und Thioglucosidase im Pflanzengewebe räumlich voneinander getrennt. Das Enzym kann erst nach Verletzung mit seinem Substrat in Kontakt treten.

Die Bildung von Senföl ist nach der Zerstörung der Pflanzenzellen am scharfen Geruch zu erkennen. Ein Beispiel hierfür ist frisch geschnittener Rettich. Bei früheren Rapssorten minderte ein hoher Glucosinolatanteil die Verwendung der ausgepressten Rapskörner als Viehfutter. Durch Züchtung ist es gelungen, glucosinolatfreie Rapssorten zu erzeugen, die heute angebaut werden.
Die Biosynthese der Glucosinolate ist aufgeklärt. Der wichtigste Baustein der Glucosinolate sind Aminosäuren, bevorzugt Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin, Isoleucin, Leucin, Valin und Methionin. Die Seitenketten (R) der Aminosäuren, insbesondere von Methionin, können verlängert werden, bevor die Aminogruppe sulfatiert wird und die Carboxylgruppe nach Einführung einer Thioalkoholgruppe mit einer Hydroxylgruppe eines Zuckers reagiert.

16.5 Pflanzen schützen sich vor Herbivoren durch ungewöhnliche Aminosäuren
Viele Pflanzen enthalten ungewöhnliche Aminosäuren, die in ihrer Struktur den proteinogenen Aminosäuren sehr ähnlich sind. Als ein Beispiel zeigt Abbildung 16.4 Canavanin, ein Strukturanalogon des Arginins aus Canavalia ensiformis (Schwertbohne). Herbivoren nehmen Canavanin mit der Nahrung auf. Die Arginin-Transfer-RNA von Tieren kann bei der Proteinbiosynthese nicht zwischen Arginin und Canavanin unterscheiden: Sie baut Canavanin statt Arginin in Proteine ein. Durch diesen Austausch ändert sich die räumliche Struktur des neu synthetisierten Proteins; das fehlerhafte Protein besitzt keine oder nur verringerte biologische Funktion. Canavanin ist daher für Herbivoren toxisch. Für Pflanzen, deren Arginin-Transfer-RNA Canavanin nicht bindet, ist Canavanin daher ungiftig. Einige Insekten, die sich von canavaninhaltigen Pflanzen ernähren, sind in gleicher Weise gegen Canavanin resistent.

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17 Eine große Vielfalt von Isoprenoiden erfüllt sehr unterschiedliche Funktionen im Pflanzenstoffwechsel
Isoprenoide kommen zwar in allen lebenden Organismen vor, sind aber insbesondere in Pflanzen in einer ungewöhnlichen Vielfalt enthalten. Mehr als 40 000 verschiedene pflanzliche Isoprenoide sind bekannt und es werden ständig neue Substanzen identifiziert. Diese Isoprenoide haben sehr viele verschiedene Funktionen (Tab. 17.1). Im primären Stoffwechsel fungieren sie als Bausteine von Membranen, als Photosynthesepigmente, Elektronentransportüberträger, Wuchsstoffe und Pflanzenhormone. Sie wirken als Glycosylüberträger bei Glycosylierungsreaktionen und sind an der Regulation des Zellwachstums beteiligt. Dazu haben sie als Spezialmetabolite ökologische Funktionen: Die Mehrzahl der verschiedenen Pflanzenisoprenoide dient als Bestandteil von Harzen, Milchsaft, Wachsen und Ölen, durch die Pflanzen giftig oder ungenießbar gemacht werden, der Abwehr gegen tierischen Fraß. Sie wirken als Antibiotika bei der Abwehr gegen pathogene Mikroorganismen. Viele Isoprenoide werden erst als Antwort auf eine Bakterien- oder Pilzinfektion gebildet (induzierte Abwehr). Manche Pflanzen bilden Isoprenoide, welche die Keimung und Entwicklung konkurrierender Pflanzen hemmen. Andere Isoprenoide locken als Pigment- oder Duftstoffe von Blüten oder Früchten Insekten zur Pollenübertragung oder zur Ausbreitung der Samen an.
Pflanzliche Isoprenoide (auch Terpenoide genannt) haben eine große wirtschaftliche Bedeutung, beispielsweise als Aromastoffe für Nahrungsmittel, Getränke und Kosmetika, als Vitamine (A, D, E), als natürliche Insektizide (z.B. Pyrethrin), als Lösungsmittel (z.B. Terpentin), als Kautschuk und Guttapercha. Zu den pflanzlichen Isoprenoiden zählen auch wichtige Naturstoffe, die als Pharmaka oder Vorstufen von Pharmaka genutzt werden. Man bemüht sich daher, die Fähigkeit der Pflanzen zur Synthese dieser Isoprenoide für biotechnische Verfahren zu nutzen.

Pflanzliche etherische Öle haben früh das Interesse der Naturstoffchemiker erregt. Man hatte aus Terpentinöl eine Reihe verschiedener Substanzen isoliert, die größtenteils cyclisch sind und 10, 15, 20 oder entsprechend mehr C-Atome besitzen. Man fand in vielen Pflanzen ähnliche Substanzen von gleicher Größe und bezeichnete sie als Terpene. Als Beispiel für ein Terpen wird in Abbildung 17.1 Limonen, ein Duftstoff aus dem Zitronenöl, gezeigt. Als Terpen mit 10 C-Atomen wird es als Monoterpen bezeichnet, und mit 40 C-Atomen als Tetraterpen.

Kautschuk zum Beispiel, ist ein Polyterpen mit über 1500 C-Atomen. Es wird aus dem Latex des Gummibaums (Hevea brasiliensis) gewonnen. Otto Wallach (Bonn, Göttingen), der für seine grundlegenden Untersuchungen der Terpene 1910 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet wurde, erkannte, dass Isopren der Grundbaustein der Terpene ist (Abb. 17.1). Aufbauend auf den Arbeiten von Wallach fand Leopold Ruzicka (Zürich), dass Isopren ein universeller Baustein für die Synthese sehr vieler Naturstoffe ist, darunter auch der Steroide. Er erhielt dafür 1939 den Nobelpreis für Chemie. Er postulierte eine biogenetische Isoprenregel nach der alle Terpenoide aus einer hypothetischen Vorstufe, die er "aktives Isopren" nannte, synthetisiert werden. Tatsächlich konnte Feodor Lynen in München (Nobelpreis für Medizin 1964) Isopentenylpyrophosphat als das gesuchte "aktive Isopren" identifizieren.

17.1 Für die Bildung von Isoprenoiden gibt es in höheren Pflanzen zwei verschiedene Synthesewege
Vorstufe für die Isoprenoidsynthese ist Isopentenylpyrophosphat. Die Synthese von Isopentenylpyrophosphat erfolgt in höheren Pflanzen und einigen Algengruppen im Cytosol und in den Plastiden auf jeweils unterschiedlichen Wegen.

Ausgangssubstanz für die Synthese von Isopentenylpyrophosphat im Cytosol ist Acetyl-CoA
Die Grundlage für die Aufklärung dieses Biosyntheseweges der Isoprenoide war die Entdeckung von Konrad Bloch (USA, der ebenfalls 1964 den Nobelpreis für Medizin erhielt), dass Acetyl-CoA Ausgangssubstanz für die Biosynthese von Steroiden ist. Abbildung 17.2 zeigt die Synthese des Zwischenproduktes Isopentenylpyrophosphat: Zwei Moleküle Acetyl-CoA reagieren zu Acetoacetyl-CoA und dann mit einem weiteren Acetyl-CoA zu ß-Hydroxy-ß-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA). In Hefen und in Tieren werden die beiden Reaktionen durch zwei verschiedene Enzyme katalysiert, in Pflanzen dagegen nur durch ein einziges Enzym, die HMG-CoA-Synthase. Die veresterte Carboxygruppe des HMG-CoA wird durch zwei Moleküle NADPH zur Hydroxygruppe reduziert. Durch die gleichzeitige Spaltung der energiereichen Thioesterbindung entsteht so in irreversibler Reaktion Mevalonat. Bei Tieren ist die Bildung von Mevalonat aus HMG-CoA eine wichtige Regulationsstelle der Isoprenoidsynthese. Ob dies auch für Pflanzen zutrifft, ist noch nicht geklärt. Durch zwei aufeinanderfolgende Phosphorylierungsschritte, die durch zwei verschiedene Kinasen katalysiert werden, entsteht ein Pyrophosphatester. Unter Verbrauch von einem dritten Molekül ATP wird nach einer intermediären Bildung eines Phosphatesters und nachfolgender Abspaltung dieses Phosphats eine Kohlenstoffdoppelbindung geknüpft und gleichzeitig die verbliebene Carboxygruppe decarboxyliert. Das so gebildete Isopentenylpyrophosphat ist der Grundbaustein für die Bildung von Isoprenoidketten.

Ausgangssubstanzen für die Synthese von lsopentenylpyrophosphat in den Plastiden sind Pyruvat und D-Glycerinaldehyd-3-phosphat
Die in Abbildung 17.2 gezeigte Synthese von Isopentenylpyrophosphat aus Acetat über Mevalonat als Zwischenprodukt, auch als Acetat-Mevalonat-Weg bezeichnet, wird durch Mevilonin, einem hoch spezifischen Inhibitor der HMG-CoA-Reduktase, geblockt. Untersuchungen an Pflanzen ergaben, dass durch Mevilonin zwar die Isoprenoidsynthese im Cytosol, nicht aber die in den Plastiden gehemmt wird. Es wurde gezeigt, dass die Synthese von Isopentenylpyrophosphat in den Plastiden auf einem anderen Wege verläuft als im Cytosol (Abb. 17.3). Ausgangsprodukte für den plastidären Syntheseweg sind Pyruvat und D-Glycerinaldehyd-3-phosphat.

Unter Beteiligung von Thiaminpyrophosphat (TPP) wird wie bei der Pyruvatdehydrogenase-Reaktion (Abb. 5.4) das Pyruvat decarboxyliert und dann wie bei der Transketolase-Reaktion (Abb. 6.17) auf D-Glycerinaldehyd-3-phosphat übertragen; dabei wird 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat (DOXP) gebildet. Über eine Folge von Reaktionen, wird durch Umlagerung und Reduktion zu 2-Methyl-D-Erythriol-4-Phosphat (MEP), und durch sich daran anschließende zwei weitere Reduktionsschritte sowie Wasserabspaltung und einem Phosphorylierungsschritt Isopentenylpyrophosphat gebildet. Bei dieser Reaktionsfolge wird MEP durch Reaktion mit CTP in CDP-Methylerythriol überführt und dadurch aktiviert. Den MEP-Weg für Isoprenoide gibt es in einigen Bakterien, Algen und Pflanzen, nicht jedoch in tierischen Organismen. Über den in den Plastiden lokalisierten MEP-Weg wird ein sehr großer Teil der pflanzlichen Isoprenoide, darunter das Hemiterpen Isopren, Monoterpene wie beispielsweise Pinen und Limonen, Diterpene (z.B. Phytolketten, Gibbereline, Harzsäuren) sowie Tetraterpene (Carotinoide), synthetisiert. Hingegen werden nach heutiger Kenntnis Sesquiterpene und Triterpene im Cytosol über den Mevalonat-Weg gebildet (Abb. 17.2).

Prenyltransferasen katalysieren die Verknüpfung der Isopreneinheiten
Der Akzeptor für eine sukzessive Übertragung von Isopentenylresten ist Dimethylallylpyrophosphat (Abb. 17.4). Dieses entsteht durch eine Isomerisierung des Isopentenylpyrophosphats, dabei wird eine Doppelbindung verschoben. Unter Abspaltung des Pyrophosphatrestes (PP) kondensiert Dimethylallyl-PP mit Isopentenyl-PP zu Geranyl-PP. Auf analoge Weise findet durch weitere Kopf-an-Schwanz-Kondensation mit Isopentenyl-PP eine Kettenverlängerung statt. Nacheinander werden so Farnesyl-PP und Geranylgeranyl-PP gebildet. Die Übertragung des Isopentenylrestes wird durch Prenyltransferasen katalysiert. Man bezeichnet Isopren- oder Polyisoprenreste als Prenylreste.

Für die Bildung jedes der genannten Prenylpyrophosphate ist eine spezielle Prenyltransferase erforderlich. Eine als Geranyl-PP-Synthase bezeichnete Prenyltransferase katalysiert lediglich die Synthese von Geranyl-PP. Eine Farnesyl-PP-Synthase bildet Farnesyl-PP in zwei diskreten Schritten: Aus Dimethylallyl-PP und Isopentenyl-PP wird zunächst Geranyl-PP gebildet, dieses Zwischenprodukt bleibt jedoch am Enzym gebunden und reagiert mit Isopentenyl-PP weiter zu Farnesyl-PP. Analog katalysiert eine Geranylgeranyl-PP-Synthase alle drei Schritte zur Bildung des Geranylgeranyl-PP. Tabelle 17.1 zeigt, dass jedes der Prenylpyrophosphate Ausgangssubstanz für die Synthese jeweils in Struktur und Funktion bestimmter Isoprenoide ist, die in Hemiterpene, Monoterpene, Sesquiterpene u.s.w. eingeteilt werden. Da diese Prenylpyrophosphate durch verschiedene Enzyme synthetisiert werden, ermöglicht eine Induktion oder Repression eines jeweiligen Enzyms die Regulation der Synthese eines bestimmten Prenylpyrophosphats. Nach bisherigen Ergebnissen gibt es einen Syntheseweg vom Isopentenylpyrophosphat zum Geranylgeranylpyrophosphat sowohl im Cytosol wie auch in den Plastiden, wobei bestehende Unterschiede zwischen den beiden Wegen im Detail noch nicht geklärt sind.
Die C-C-Verknüpfung zwischen zwei Isoprenen wird durch nucleophile Substitution gebildet (Abb. 17.5):

Ein an die Prenyltransferase gebundenes Mg2+-Ion fördert die Abspaltung des Pyrophosphatrestes vom Akzeptormolekül, wobei am endständigen C-Atom (C-1) eine positive Ladung entsteht, die durch die benachbarte Doppelbindung stabilisiert wird. Es entsteht also ein Allyl-Kation, daran greift die endständige Doppelbindung des Donormoleküls an, und die neue C-C-Bindung wird geknüpft. Die Abspaltung eines Protons vervollständigt die Reaktion. Nach dem selben Reaktionsmechanismus werden nicht nur Isoprenketten, sondern auch Ringschlüsse erzeugt, sodass dadurch am Ende die ungewöhnliche Vielfalt der Isoprenoide entsteht. Manche Pflanzen emittieren Isopren in die Luft
Das Hemiterpen Isopren wird durch eine in zahlreichen Pflanzen vorhandene Isopren-Synthase nach Abspaltung von Pyrophosphat aus Dimethylallyl-PP gebildet (Abb. 17.6).

Isopren hat einen Siedepunkt von 33°C und entweicht aus der Pflanze als Gas. Man beobachtet eine Isoprenemission insbesondere bei Eichen, Weiden, Platanen und Pappeln. Diese Pflanzen bilden Isopren nur im Licht und bei Temperaturen von 30-40°C. Bei diesen hohen Temperaturen kann in Eichenblättern von dem durch Photosynthese fixierten Kohlenstoff bis zu 5% als Isopren emittiert werden. Beim Kudzu-Wein, einer rankenden Pflanze, die in Asien als Futterpflanze genutzt wird, hat man sogar Isoprenemissionen von 20% des Photoassimilats beobachtet. Zusammen mit Monoterpenen und anderen Substraten ist die Isoprenemission für den blauen Dunstschleier verantwortlich, der bei Hitze über Wäldern beobachtet werden kann.
Die Isoprensynthese erfolgt in den Chloroplasten aus Dimethylallylpyrophosphat, welches über den MEP-Weg gebildet wird (Abb. 17.3). Die Isopren-Synthase wird bei hohen Temperaturen induziert. Die physiologische Funktion der Isoprenbildung ist bis heute nicht geklärt. Es gibt Hinweise darauf, dass durch Einlagerung geringer Isoprenmengen Photosynthesemembranen gegenüber dem Einfluss hoher Temperaturen stabilisiert werden. Global gesehen ist die Isoprenernission durch Pflanzen beträchtlich, sie liegt um mehrere Größenordnungen über der anthropogenen Kohlenwasserstoffemission und wird als etwa gleich hoch wie die globale Methanemission eingeschätzt. Allerdings wird Isopren in der Atmosphäre sehr viel schneller abgebaut als Methan.

17.2 Vom Geranylpyrophosphat leiten sich viele Geruchsstoffe ab
Die Klasse der Monoterpene umfasst eine große Anzahl von offenkettigen und cyclischen Isoprenoiden, von denen viele wegen ihrer hohen Flüchtigkeit und ihres Lipidcharakters zu den etherischen Ölen gezählt werden. Sie haben in der Regel einen charakteristischen, oft angenehmen Geruch und sind beispielsweise für den typischen Geruch von Fichtennadeln, Thymian, Lavendel, Rosen und Maiglöckchen verantwortlich. Als Blütenduftstoff dienen sie zur Anlockung von Bestäubern. Ihre Funktion liegt jedoch auch darin, Insekten und andere Tiere fernzuhalten, um Pflanzenteile vor Fraß zu schützen. Die Hydrolyse des Geranyl-PP führt zur Bildung des Alkohols Geraniol (Abb. 17.7), dieser ist Hauptbestandteil des Rosenöls. Geraniol riecht nach frischgeschnittenen Geranien.

Geranylpyrophosphat ist die Ausgangssubstanz für die Bildung der Monoterpene, die durch Monoterpen-Synthasen gebildet werden. Diese Enzyme, die alle ein sehr ähnliches aktives Zentrum besitzen und zu einer gemeinsamen Enzymfamilie gehören, bilden sehr unterschiedliche Produkte. In Abb. 17.8 sind die Produkte von zwei sehr eng verwandten Monoterpen-Synthasen gezeigt. Während die Linalool-Synthase aus Nicotiana alata als einziges Produkt Linalool liefert, führt die Katalyse der Cineol-Synthase aus Nicotiana suaveolens zur Bildung von acht verschiedenen Produkten (Multiproduktenzym) (60% Cineol, je 10% Myrcen, Limonen und Sabinen und je 2% ß-Ocimen und Terpineol sowie α- und ß-Pinen) (Abb.17.8). Der prozentuale Anteil der Produkte variiert bei Enzymen nahverwandter Pflanzenspezies und lässt sich auf wenige Aminosäureunterschiede in den Proteinsequenzen zurückführen.

So kann bereits durch ein Enzym eine Vielfalt von Substanzen erzeugt werden. Neben den anlockenden Monoterpenen der Blüten werden in vielen Pflanzen Monoterpene mit abstoßenden Eigenschaften gebildet. So sind Limonen, Myrcen, α- und ß-Pinen Hauptbestandteile des Harzes (Oleoresin) von Nadelbäumen. Sie sind für viele Insekten toxisch und verhindern den Fraß durch Tiere. Nadelbäume reagieren auf den Befall durch Borkenkäfer mit einer starken Erhöhung der Cyclaseaktivität und eine dadurch bewirkte vermehrte Harzbildung. Limonen kommt auch in den Blättern und Schalen von Zitronen vor. Ein weiteres Monoterpen ist Menthol, der Hauptbestandteil des Pfefferminzöls (Abb. 17.7). Es dient der Pflanze als Insektenrepellent. Es gibt zudem viele Monoterpene, die Carbonylgruppen und Carboxylgruppen enthalten, auf die hier aber nicht eingegangen werden kann.

17.3 Farnesylpyrophosphat ist Ausgangsverbindung für die Bildung von Sesquiterpenen
Die Produktbildung aus Farnesylpyrophosphat, die wiederum nach gleichen Mechnismus verläuft wie bei den Monoterpensynthasen, ist noch umfangreicher. Dies illustriert Abbildung 17.9. Bereits die Reaktion des intermediär gebildeten Carbenium-Ions mit den beiden Doppelbindungen des Moleküls kann zu vier verschiedenen Produkten führen.

Durch gleichzeitige Umlagerung wird die Zahl der möglichen Produkte vervielfacht. Sesquiterpene bilden die größte Gruppe der Isoprenoide, sie umfasst allein über 200 verschiedene Kohlenstoffgerüste. Zu den Sesquiterpenen zählen viele Geruchsstoffe, zum Beispiel das Valencen der Orangen, das Caryophyllen der Nelken sowie mehrere Inhaltsstoffe des Hopfens und des Eukalyptusöls. Zu den Sesquiterpenen gehört aber auch Capsidiol (Abb. 17.10), ein in Pfeffer und Tabak gebildetes Phytoalexin (Abschn. 16.1).


Aus Farnesylpyrophosphat werden Steroide gebildet
Aus zwei Molekülen Farnesyl-PP wird durch eine reduktive Kopf-Kopf-Kondensation unter Verbrauch von NADPH das Triterpen Squalen gebildet (Abb. 17.11). Squalen ist Ausgangsprodukt für Membranbausteine wie Cholesterol und Sitosterol, deren Funktionen in Abschnitt 15.1 besprochen wurden, sowie für die als Phytohormon wirkenden Brassinosteroide (Abschn. 19.8).

Eine Klasse glycosylierter Steroide, die wegen ihres Seifencharakters als Saponine bezeichnet werden, wirkt in der Pflanze als Fraßgift und Abwehrsubstanz gegen Pilze (Abb. 17.12). Der Glycosylrest der Saponine besteht aus einem verzweigten Oligosaccharid, das aus Glucose, Galactose, Xylose und anderen Hexosen auf gebaut ist. Die hydrophile Polysaccharidkette und das hydrophobe Steroid machen die Saponine zu einem Detergens, einer grenzflächenaktiven Substanz. Die Toxizität der Saponine beruht auf ihrer membranschädigenden Wirkung, bei Pilzen lösen sie die Plasmamembran auf, bei Tieren führen sie zur Hämolyse der roten Blutkörperchen. Einige Gräser enthalten Saponine und sind daher für das Weidevieh giftig. Yamonin, ein Saponin aus der Yampflanze, diente in der pharmazeutischen Industrie als Ausgangssubstrat für die Synthese von Progesteronen, die u. a. Bestandteile von Antibabypillen sind.

Zu den Saponinen gehören auch eine Anzahl sehr toxischer glycolisierter Steroide, die als Cardenolide bezeichnet werden, welche die in Tieren vorkommende Na+/K+-Pumpe hemmen. Ein bekannter Vertreter dieser Stoffklasse ist das Digitoxigenin, ein Gift aus dem Fingerhut. Es gibt Raupen, die Cardenolide fressen können, ohne dass sie dadurch vergiftet werden: Sie speichern diese Substanzen und sind dadurch ihrerseits für Vögel giftig. In geringen Dosen werden Cardenolide als Medikament gegen Herzinsuffizienz benutzt. Abwehrstoffe sind auch die Phytoecdysone, eine Gruppe von Steroiden mit einer ähnlichen Struktur wie das Insektenhormon Ecdyson. Ecdyson reguliert die Häutung der Larven. Wenn Insekten diese Phytoecdysone mit der Nahrung aufnehmen, wird der Häutungsprozess gestört, und die Insektenlarven sterben.

17.4 Geranylgeranylpyrophosphat ist Ausgangssubstanz für Abwehrsubstanzen, Phytohormone und Carotinoide
Die Cyclisierung von Geranylgeranyl-PP führt unter anderem zur Bildung des Diterpens Casben (Abb. 17.13) . Casben wird als Phytoalexin (Abschn. 16.1) in Ricinus communis gebildet. Das Diterpen Phorbol ist als Ester im Milchsaft von Wolfsmilchgewächsen enthalten. Bei Verzehr der Pflanzen wirkt Phorbol als Gift, bereits der Kontakt mit der Haut löst schwere Entzündungen aus. Wir sehen hier ein weiteres Beispiel dafür, wie sich die Pflanze vor Fraß schützt. Die Phorbolester haben in der medizinischen Forschung wegen ihrer tumorauslösenden Wirkung Bedeutung erlangt. Ebenfalls vom Geranylgeranyl-PP leiten sich die Gibberelline ab, eine Gruppe von Phytohormonen (Abschn. 19.4).


Oleoresine schützen Bäume vor Schädlingsbefall
Coniferen (Nadelhölzer) haben in gemäßigten Zonen eine weite Verbreitung als Waldbäume und erreichen zudem oft ein hohes Alter, manche Spezies können weit über 1000 Jahre alt werden. Dies wird möglich, weil sich Coniferen sehr wirksam gegen Fraßfeinde schützen können. Die größte Bedrohung stellen Borkenkäfer dar, die nicht nur selbst Schäden anrichten, sondern auch Pilzinfektion an den Verletzungsstellen der Rinde nach sich ziehen. Gegen diese Feinde schützen sich die Bäume an den Verletzungsstellen durch das Ausscheiden von Oleoresinen (Baumharzen), wodurch Insekten und Pilze getötet und die Verletzungsstellen versiegelt werden. Oleoresine der Coniferen bestehen aus einer sehr komplexen Mischung von Terpenoiden, etwa zu der Hälfte aus einer flüchtigen Terpentinfraktion (Monoterpene und z.T. auch Sesquiterpene) und zur anderen Hälfte aus einer nichtflüchtigen Rosin-Fraktion (Diterpene). Die Terpentin-Fraktion enthält eine Reihe von Substanzen, die für Insekten und Pilze toxisch sind, wie beispielsweise Limonen (Abb. 17.5). Die Rosin-Fraktion enthält Harzsäuren, wobei Abietinsäure (Abb. 17.13) der Hauptvertreter ist. Bei Verletzung wird das in den Harzkanälen gespeicherte Oleoresin ausgeschüttet oder auch am Ort des Befalles synthetisiert. Die toxischen Eigenschaften der einzelnen Komponenten der Oleoresine auf bestimmte Insekten und Pilze werden derzeit intensiv untersucht und man hofft aus diesen Kenntnissen durch gentechnische Methoden die Schädlingsresistenz von in großflächigen Forsten angebauten Bäumen zu erhöhen.

Die Carotinsynthese liefert Pigmente für die Pflanze und ein wichtiges Vitamin für den Menschen
Die Funktion der Carotinoide bei der Photosynthese wurde in den Kapiteln 2 und 3 ausführlich behandelt. Außerdem haben Carotinoide auch eine Bedeutung als Farbstoff, zum Beispiel in Blüten und Früchten. Die Synthese von Carotin erfordert zwei Moleküle Geranylgeranyl-PP, die ähnlich wie bei der Bildung von Squalen durch Kopf-Kopf-Kondensation verknüpft werden (Abb. 17.14A). Durch Abspaltung des ersten Pyrophosphats entsteht zunächst das Zwischenprodukt Prä-Phytoenpyrophosphat, die Abspaltung des zweiten Pyrophosphats führt dann zur Bildung des Phytoens . Hier sind die beiden Prenylreste durch eine Kohlenstoffdoppelbindung miteinander verknüpft. Durch zwei verschiedene Desaturasen erfolgt die Umwandlung zum Lycopin. Nach neueren Ergebnissen verlaufen diese Desaturierungen über Dehydrogenierungen, wobei der abgespaltene Wasserstoff über FAD auf O2 übertragen wird. Zwei endständige Cyclisierungen des Lycopins führen dann zur Bildung von ß-Carotin, eine andere Cyclase erzeugt α-Carotin. Die Hydroxylierung von ß-Carotin führt zum Xanthophyll Zeaxanthin. Die Bildung des Xanthophylls Violaxanthin aus Zeaxanthin ist in Abbildung 3.41 gezeigt.

ß-Carotin ist die Ausgangssubstanz für die Synthese des Sehpigments Rhodopsin und daher als Provitamin A ein essenzieller Bestandteil der menschlichen Ernährung. Hunderte von Millionen Menschen, vor allem in Asien, die sich hauptsächlich von Reis ernähren, welcher kein ß-Carotin enthält, leiden unter gravierendem Provitamin A-Mangel; viele Kinder erblinden dadurch. Es ist kürzlich gelungen, in transgenen Reispflanzen alle Enzyme des Synthesewegs vom Geranylgeranylpyrophosphat zum ß-Carotin in das Endosperm der Reiskörner einzubringen. Diese Reislinien liefern ß-Carotin-haltigen Reis, der dadurch eine gelbliche Farbe hat. Daher rührt auch die Bezeichnung "Golden Rice". Die durch Non-Profit-Organisationen bereitgestellten transgenen Reislinien werden derzeit von Züchtungsinstituten in einer Reihe von asiatischen Ländern in lokale Reissorten eingekreuzt. Man hofft, dass es durch den Anbau von „Golden Rice" gelingt, dem gravierenden Provitamin A-Mangel weiter Bevölkerungskreise abzuhelfen.
ß-Carotin ist auch Ausgangssubstanz für Strigolactone. Diese Naturstoffe wurden bereits 1966 aus Wurzeln der Baumwolle isoliert und die chemische Struktur von 5-Deoxystrigol ist seit 1972 bekannt. 5-Deoxystrigol ist ein wichtiges Intermediat wovon sich viele verschiedene natürlich vorkommende Derivate ableiten lassen (Abb. l7.14B).

Striga-Spezies (Sommerwurzgewächse) sind parasitische Pflanzen (,Witchweed'), die für enorme Mais- und Reis-Ernteeinbußen in Afrika verantwortlich sind. Strigolactone werden von den Wurzeln der Wirtspflanzen gebildet und in den Boden abgegeben und führen zu unterschiedlichen Phänomenen, z.B. zur Verringerung der Sprossverzweigung der Wirtspflanze, Förderung der Keimung des Striga-Parasiten und Erhöhung der symbiotischen Assoziation mit arbuskulären Mycorrhiza-Pilzen.

17.5 Viele Substanzen sind aufgrund einer Prenylkette in Membranen löslich
Ubichinon (Abb. 3.5), Plastochinon (Abb. 3.19) und Cytochrom-a (Abb. 3.24) werden durch Isoprenoidketten unterschiedlicher Länge in Membranen verankert. Bei der Biosynthese dieser Elektronenüberträger erfolgt der Einbau der Prenylkette durch eine Prenyltransferase über ein Prenylpyrophosphat als Zwischenstufe. Chlorophyll (Abb. 2.4), Tocopherole und Phyllochinon (Abb. 3.32) besitzen hingegen Phytolseitenketten. Diese werden über eine Reduktion durch NADPH (Abb. 17.15) aus Geranylgeranyl-PP gebildet und entsprechend eingebaut.


Durch Prenylierung können Proteine in einer Membran verankert werden
In Hefen und Tieren kommen eine große Anzahl von Proteinen vor, die durch spezifische Prenyltransferasen an einen Cysteinrest nahe am C-Terminus über eine Thioetherbindung mit einem Farnesyl- oder Geranylrest verknüpft werden (Abb. 17.16). In vielen Fällen werden nach der Prenylierung die endständigen Aminosäuren von dem Cysteinrest durch eine Peptidase abgespalten, und die Carboxygruppe des Cysteins wird methyliert. Durch diese Modifikationen wird das Protein lipidlöslich und kann in einer Membran verankert werden. Diese Prenylierung von Proteinen spielt auch in Pflanzen eine wichtige Rolle.


Dolichol vermittelt die Glycosylierung von Proteinen
Dolichole (Abb. 17.17) sind sehr langkettige Isoprenoide, die in den Membranen des endoplasmatischen Reticulums und des Golgi-Apparates vorkommen. Sie haben als membranlösliche Überträger von Oligosacchariden eine wichtige Funktion.

Viele Membranproteine und sekretorische Proteine sind durch verzweigte Oligosaccharidketten N-glycosyliert. Diese Glycosylierung erfolgt im endoplasmatischen Reticulum unter Vermittlung des membrangebundenen Dolichols (Abb. 17.18). Dabei wird das gesamte Oligosaccharidgerüst zunächst am Dolichol zusammengesetzt und erst nach der Fertigstellung auf einen Asparaginrest des zu glycosylierenden Proteins übertragen. Durch eine nachfolgende Modifizierung im Golgi-Apparat, bei der einzelne Zuckerreste abgespalten und dafür andere gebunden werden, wird eine sehr große Vielfalt von Oligosaccharidgerüsten erzeugt.

17.6 Die Regulation der Isoprenoidsynthese
In einer Pflanze werden die Isoprenoide je nach Bedarf an verschiedenen Orten synthetisiert. Wenn größere Mengen an hydrophoben Isoprenoiden synthetisiert werden, erfolgt dies meist in spezialisierten Geweben, wie den Drüsenzellen von Blättern, den Osmophoren der Blütenblätter oder in Epidermiszellen. Der Enzymapparat zur Synthese der Isoprenoide in einer Zelle ist in den Plastiden, dem Cytosol, und auch den Mitochondrien vorhanden. Dadurch kann jedes dieser subzellulären Kompartimente seinen Isoprenoidbedarf größtenteils selbst decken. Manche Isoprenoide werden auch von den Plastiden synthetisiert und dann der Zelle zur Verfügung gestellt, wie z.B. das Phytohormon Gibberellinsäure. Die Prenylpyrophosphate, von denen sich die anderen Isoprenoide ableiten, werden zudem durch unterschiedliche Enzyme gebildet (Abschn. 17.2).
Diese räumliche Trennung der Synthesewege ermöglicht es, dass trotz der sehr großen Vielfalt der Substanzen, die über einen gemeinsamen Syntheseweg gebildet werden, eine effiziente individuelle Kontrolle der Syntheseraten über eine Regulation der Enzymmenge an den verschiedenen Orten durch unterschiedliche Genexpression möglich ist. Bisherige Ergebnisse sprechen dafür, dass die Synthese der verschiedenen Isoprenoide in erster Linie auf der Ebene der Genexpression reguliert wird. Dies ist besonders auffallig bei Infektionen oder Verwundungen, bei denen durch elicitorgesteuerte Genexpression ein sehr schnelles Umschalten des Isoprenstoffwechsels erfolgt (Abschn. 16.1). Dabei können Konkurrenzsituationen auftreten: So führt die durch einen Pilzelicitor in Tabakzellen ausgelöste Phytoalexinsynthese dort zu einem Stillstand der Steroidsynthese. Die Zelle konzentriert dann ihre Isoprenoidsynthesekapazität auf die Abwehr.

Isoprenoide sind sehr stabile Substanzen
Über einen Katabolismus der Isoprenoide in Pflanzen ist wenig bekannt. Biologisch aktive Derivate wie Phytohormone werden durch die Einführung weiterer Hydroxygruppen und vor allem durch Glycosylierungen in inaktive Substanzen umgewandelt und zumeist in der Vakuole endgelagert. Es ist fraglich, ob Isoprenoide in der Pflanze durch Abbau wieder verwertet werden können. Manche Isoprenoide sind bemerkenswert lange haltbar. Fossile Isoprenoide findet man in größeren Mengen in praktisch allen Sedimentgesteinen sowie auch im Erdöl. In Archaebakterien enthalten die Plasmamembranen anstatt Fettsäureglycerinestern Glycerinether mit Isoprenoidketten. Es ist deshalb zu vermuten, dass lsoprenoide zu den Bausteinen sehr früher Lebensformen gehörten.nach oben zum Kapitelanfang

18 Die Phenylpropanoide umfassen eine Vielfalt pflanzlicher Spezialmetabolite und Zellwandbestandteile
Pflanzen enthalten eine sehr große Anzahl phenolischer Substanzen. Neben einfachen Phenolen gehören dazu unter anderem die Flavonoide, Stilbene, Tannine, Lignane und Lignin (Abb. 18.1). Zusammen mit langkettigen Carbonsäuren sind Phenole außerdem im Suberin und Cutin enthalten.

Diese recht unterschiedlichen Substanzen erfüllen wichtige Funktionen: als Antibiotika, natürliche Pestizide, Signalsubstanzen zur Bildung von Symbiosen mit Bakterien und Pilzen, Lockmittel für Bestäuber, Schutz gegen ultraviolettes Licht, Isoliermaterial, um Zellwände gas- und wasserundurchlässig zu machen, und als Gerüstmaterial, um Pflanzen Stabilität zu verleihen (Tab. 18.1). Alle diese Substanzen werden aus Phenylalanin (in manchen Pflanzen auch aus Tyrosin) synthetisiert.

Phenylalanin und Tyrosin werden durch den in Abschnitt 10.4 besprochenen Shikimatweg gebildet. Da die aus beiden Aminosäuren abgeleiteten Phenole einen Benzolring mit einer C3-Seitenkette enthalten, fasst man sie unter der Sammelbezeichnung Phenylpropanoide zusammen. Die Flavonoide, zu denen beispielsweise Flavone, Isoflavone und Anthocyanidine zählen, enthalten neben dem Phenylpropangerüst einen zweiten aromatischen Ring, der aus drei Molekülen Malonyl-CoA gebildet wird (Abb. 18.1). Dies trifft auch für die Synthese der Stilbene zu. Hier wird allerdings bei der Einfügung des zweiten aromatischen Ringes ein C-Atom des Phenylpropans abgespalten.

18.1 Die Phenylalanin-Ammoniak-Lyase und Monooxygenasen sind wichtige Enzyme des Phenylpropanstoffwechsels
Die Pheny1a1anin-Ammoniak-Lyase, abgekürzt PAL, katalysiert eine Desaminierung des Phenylalanins (Abb. 18.2): Durch Abspaltung von NH3 wird eine Kohlenstoffdoppelbindung gebildet, es entsteht trans-Zimtsäure. In einigen Gräsern wird in analoger Weise durch die Tyrosin-Ammoniak-Lyase Tyrosin zu 4-Hydroxyzimtsäure umgesetzt. Das freigesetzte NH3 wird wahrscheinlich durch die Glutamin-Synthetase (Abschn. 10.1) wieder fixiert.

PAL ist eines der bestuntersuchten Enzyme des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels. Das Enzym besteht aus einem Tetramer mit Untereinheiten von 77 bis 83 kDa. Die Bildung von Phenylpropanoidphytoalexinen nach einer Pilzinfektion beinhaltet eine sehr schnelle Induktion der PAL. PAL wird durch ihr Produkt trans-Zimtsäure gehemmt. Ein sehr starker Hemmer ist auch das Phenylalaninanalogon Aminoxyphenylpropionsäure (Abb. 18.3); es hemmt die PAL bereits in mikromolaren Konzentrationen.

Die Einführung der Hydroxygruppen in den Phenylring der Zimtsäure (Hydroxylierung) (Abb. 18.4) erfolgt durch eine Mooooxygenase mit Cytochrom-P450 als O2-Bindungsstelle nach dem Reaktionstyp:

Bei dieser Reaktion werden Elektronen von NADPH über FAD (Abb. 5.16) auf Cytochrom-P450 (Pigment mit Absorptionsmaximum von 450 nm) übertragen, und von dort weiter auf Sauerstoff. Von dem O2-Molekül erscheint nur ein O-Atom in der Hydroxylgruppe, das andere wird zu Wasser reduziert. Daher die Bezeichnung Mooooxigenase. Ebenso wie Cytochrom-a3, welches O2 bindet, (Abschn. 5.5) wird auch Cytochrom-P450 durch Bindung von CO blockiert. Daher werden P450-Monooxigenasen durch CO gehemmt.

P450-Monooxigenasen sind in der Tier-und Pflanzenwelt sehr weit verbreitet. Genomanalysen zeigen, dass es in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana etwa 300 verschiedene Gene gibt, die P450-Proteine kodieren. Möglicherweise handelt es sich dabei um die größte Genfamilie in Pflanzen überhaupt. Die Mehrzahl dieser Proteine dürfte an Hydroxylierungsreaktionen bei der Synthese von Spezialmetaboliten und Pflanzenhormonen beteiligt sein, sie spielen zudem auch eine wichtige Rolle bei Entgiftungsreaktionen, zum Beispiel der Detoxifizierung von Herbiziden (Abschn. 3.6). Wie alle P450-Monooxigenasen ist auch die Zimtsäurehydroxylase membrangebunden, und zwar an die Membranen des endoplasmatischen Reticulums. Unter Verbrauch von NADPH wird ein O-Atom des O2-Moleküls zu H2O reduziert und das andere auf den Phenylring übertragen. Die gebildete p-Cumarsäure wird über Hydroxylasen, ebenfalls vom P450-Monooxigenase Typ, vorzugsweise in Position 3 und 5 weiter hydroxyliert; die so gebildeten OH-Gruppen werden zumeist durch O-Methyl-Transferasen unter Verwendung von S-Adenosylmethionin als Methyldonor methyliert. Es werden so Ferula- und Sinapinsäure gebildet, die zusammen mit p-Cumarsäure Ausgangssubstanzen für die Synthese von Lignin sind (Abschn. 18.3).
Durch Abspaltung eines C2-Fragments werden aus Phenylpropanen Benzoesäurederivate gebildet, darunter die Salizylsäure, und auch der sich von der Benzoesäure ableitende Benzaldehyd Vanillin, der Aromastoff der Vanille (Abb. 18.5).Ein alternativer Biosyntheseweg für Salizylsäure zweigt schon früher im Shikimat-Weg bei der Chorisminsäure ab. Diese wird durch Isochorismat-Synthase zu Isochorisminsäure umgewandelt, woraus dann in einem weiteren enzymatischen Schritt die Salizylsäure entsteht (Abb. 18.5).

Die Bezeichnung Salizylsäure leitet sich von Salix (lat. für "Weide") ab, da sie in der Rinde dieses Baumes in besonders großen Mengen vorkommt und daraus erstmalig isoliert wurde. Wegen des Salizylsäuregehaltes ist Weidenrinde und ihre Extrakte seit alters her sowohl in der alten als auch der neuen Welt als Arzneimittel benutzt worden. Es ist bekannt, dass Hippokrates im 4. Jahrhundert vor Christi Frauen als schmerzlinderndes Mittel beim Gebären Weidenrinde kauen ließ. Auch nordamerikanische Indianer benutzten Extrakte aus Weidenrinde als Schmerzstiller.
Der Acetylester der Salizylsäure ist seit 100 Jahren unter dem Namen Aspirin als Medikament gegen Schmerz und Fieber im Handel. Dieses bislang weltweit meistproduzierte Medikament wirkt aber auch auf Pflanzen. So wurde in Tabakpflanzen nach Gabe von Aspirin oder Salizylsäure eine erhöhte Resistenz gegen Pathogene, wie das Tabakmosaik-Virus, beobachtet. Tatsächlich findet man in vielen Pflanzen nach Pilz-, Bakterien- oder Virusinfektion, aber auch nach UV-Bestrahlung oder Ozonbelastung einen hohen Anstieg des Salizylsäure-Gehalts. Salizylsäure ist eine wichtige Signalsubstanz zur Auslösung von Abwehrreaktionen. Mutanten von Arabidopsis (Abb. 20.1), die die Fähigkeit zur Salizylsäure-Bildung verloren haben, zeigen eine hohe Anfälligkeit gegen Infektionen. Die Wirkung der Salizylsäure beruht auf der Aktivierung der Expression vieler Proteine, die an Abwehrreaktionen gegen Viren, Bakterien und Pilzen beteiligt sind, wobei Salizylsäure über die Auslösung einer Signalkette wirkt (Abschn. 16.1, 19.9). Wie anfangs schon besprochen, kann auch die Gabe von Salizylsäure einer Pflanze einen höheren Schutz gegen Pathogene verleihen. Dieses Prinzip wird neuerdings kommerziell genutzt. Ein Salizylsäure-Analog mit dem Handelsnamen Bion(Syngenta) ist als Sprühmittel für eine vorbeugende Bekämpfung von Mehltau-Infektionen bei Weizen im Handel.
Jedoch beschränkt sich die Wirkung von Salizylsäure nicht nur auf Abwehrreaktionen. Salizylsäure ist bei manchen Pflanzen an der Blühinduktion beteiligt, und löst auch die Wärmeproduktion im Blütenkolben der nach Aas riechenden Vodoo-Lilie durch Stimulierung der mitochondrialen alternativen Oxidase (Abschn. 5.7) aus. In diesem Fall wird die Salizylsäure auch als Calorigen bezeichnet.
Durch Hydroxylierung und die Bildung eines inneren Esters (eines Lactons) entsteht aus p-Cumarsäure 7-Hydroxycumarin, als Umbelliferon bezeichnet (Abb. 18.6).

Durch Einführung einer C2-Gruppe wird aus Umbelliferon Psoralen, ein Furanocumarin, gebildet. Psoralen wird erst durch Belichtung zu einer toxischen Substanz. Es geht durch die UV-Strahlung des Sonnenlichtes in den angeregten Zustand über und reagiert dann mit den Pyrimidinbasen der DNA. Dies führt über eine Blockierung der Transkription und der DNA-Reparaturmechanismen schließlich zum Zelltod. Wie bereits in Abschnitt 16.1 erwähnt, ist Psoralen in manchen Selleriesorten in besonders hohen Konzentrationen enthalten und hat bei Gartenarbeitern zu schweren Hautentzündungen geführt. Es gibt viele Furanocumarine mit antibiotischen Eigenschaften. Sie bilden in manchen Fällen als Phytoantizipin einen konstitutiven Bestandteil der Pflanzen; in anderen Fällen werden sie erst nach Infektion oder Verwundung als Phytoalexin gebildet.

18.2 Phenylpropane polymerisieren zu Makromolekülen
Es wurde bereits im Abschnitt 1.1 erwähnt, dass Lignin nach Cellulose der zweithäufigste Naturstoff auf der Erde ist. Bausteine für die Ligninsynthese sind p-Cumaryl-, Sinapyl- und Coniferylalkohol; diese haben die Sammelbezeichnung Monolignole (Abb. 18.7). Die Synthese der Monolignole erfordert eine Reduktion der Carboxygruppe zum Alkohol. Diese erfolgt in zwei Schritten: Wir haben bei der Besprechung der Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase (Abschn. 6.3) gesehen, dass eine Carboxygruppe erst dann durch NADPH zur Aldehydgruppe reduziert werden kann, wenn sie zuvor durch die Bildung eines Thioesters aktiviert wird. Für die Reduktion der p-Cumarsäure (Abb. 18.7) wird der erforderliche Thioester aus CoA gebildet.

Dabei wird entsprechend der Fettsäureaktivierung ATP verbraucht (Abschn. 15.6). Die Spaltung der energiereichen Thioesterbindung treibt die Reduktion zum Aldehyd. Dessen weitere Reduktion zum Alkohol erfolgt ebenfalls durch NADPH. Die Bildung von Sinapyl- und Coniferylalkohol aus Sinapin- und Ferulasäure erfolgt nach dem gleichen Prinzip, jedoch sind in Pflanzen spezifische Enzyme dafür verantwortlich. Alternativ können Coniferyl- und Sinapylalkohol aber auch durch Hydroxylierung und anschließende Methylierung (Abb. 18.4) aus p-Cumarylalkohol gebildet werden.

Lignane wirken als Abwehrsubstanzen
Die Dimerisierung von Monolignolen führt zur Bildung von Lignanen (Abb. 18.8). Zumeist erfolgt dies durch eine reduktive Verknüpfung der Seitenketten zu einer 8'-8'-Verbindung, mitunter aber auch durch eine Kondensation der beiden Phenolringe. Der Mechanismus der Lignanbildung verläuft möglicherweise über Radikalbildung und wird durch eine Laccase katalysiert (Abb. 18.9).

Neben Dimeren gibt es bei den Lignanen auch höhere Oligomere. Lignane sind im Pflanzenreich als Abwehrsubstanzen weit verbreitet. Pinoresinol ist ein Bestandteil des Harzes, der in Forsythien bei Verwundung gebildet wird. Seine Toxizität beruht auf einer Hemmung der cAMP-Phosphodiesterase. Pinoresinol hebt damit die Regulationswirkung von cAMP auf, welches in den meisten Organismen, (ob auch in Pflanzen ist noch nicht eindeutig geklärt (Abschn. 19.1) als Botenstoff wirkt. Malognol hemmt ebenfalls das Wachstum von Bakterien und Pilzen.
Manche Lignane haben interessante pharmakologische Wirkungen: Podophyllotoxin, aus Podophyllum, einer in Amerika vorkommenden Berberidaceae, ist ein Mitosegift. Derivate des Podophyllotoxins werden zur Krebsbekämpfung eingesetzt. Arctigenin und Tracheologin (aus tropischen Kletterpflanzen) haben antivirale Eigenschaften; es gibt Versuche, sie zur AIDS-Bekämpfung einzusetzen.

Durch radikalische Polymerisation von Phenylpropanen entsteht Lignin
Lignin entsteht durch Polymerisation der Monolignole. Dabei kommen in Angiospermen hauptsächlich Sinapyl- und Coniferylalkohol, in Gymnospermen hauptsächlich Coniferylalkohol und in Gräsern alle drei Monolignole vor. Die Synthese der Lignine erfolgt außerhalb der Zellen. Dazu werden die Monolignole aus der Zelle exportiert, wobei der Mechanismus des Exports noch nicht bekannt ist. Es gibt Befunde, dass die Monolignole als Glucoside ausgeschleust werden und dann außerhalb der Zelle durch Glucosidasen wieder freigesetzt werden. Dies ist jedoch umstritten. Auch der Mechanismus der Ligninbildung ist in vielem noch unklar. An der Verknüpfung sind sowohl Laccase als auch Peroxidasen beteiligt. Die Laccase ist eine Monophenoloxidase, welche eine Phenolgruppe zu einem Radikal oxidiert und dabei den Wasserstoff unter Vermittlung von einem enzymgebundenen Cu++-Ion auf molekularen Sauerstoff überträgt. Der Name rührt daher, dass das Enzym erstmalig aus dem in Japan beheimateten Lac-Baum (Rhus vernicifera) isoliert wurde. Bei den Peroxidasen wirkt H2O2 als Oxidationsmittel. H2O2 könnte im Zellwandraum durch die Plasmamembran-lokalisierte NADPH-Oxidase gebildet werden. Dieses Enzym spielt auch beim Zelltod nach Pathogenbefall (siehe Abschn 16.1) eine wichtige Rolle. Wie in Abbildung 18.9A gezeigt, entsteht vermutlich durch Oxidation eines Phenols durch H2O2 ein resonanzstabilisiertes Phenolradikal.

Diese Phenolradikale können nichtenzymatisch dimerisieren und schließlich polymerisieren (Abb. 18.9B); dabei gibt es - ausgehend von verschiedenen Resonanzstrukturen - sehr viele Kombinationsmöglichkeiten. Meist geht ein Phenylpropan mehrere C-C- oder C-O-C-Verknüpfungen ein. Es bildet sich so ein stark vernetztes Phenylpropanpolymer. Nur in wenigen Seitenketten des Lignins gibt es freie Hydroxygruppen. Mitunter sind diese zu Aldehyd- und Carboxygruppen oxidiert.
Heute ist die Synthese der Primärstruktur von Ligninen, d.h. die Verknüpfungsmöglichkeiten noch nicht in allen Einzelheiten aufgeklärt, jedoch ist erkennbar, dass selbst in diskreten Bereichen der Zellwand einer Zelle Lignine unterschiedlicher Struktur gebildet werden. Es wurde postuliert, dass an der Polymerisation der Monolignol-Radikale extrazelluläre Glykoproteine, als Dirigenten-Proteine bezeichnet, die Polymerisation so lenken, dass definierte Vernetzungen erfolgen und so spezifische Lignine gebildet werden. Es ist jedoch noch umstritten, in welchem Maße die Ligninbildung nach dem Zufallsprinzip und in spezifischer Weise durch Dirigenten-Proteine gelenkt wird.
Die Zusammensetzung des Lignins ist in verschiedenen Pflanzen sehr unterschiedlich. So hat beispielsweise das Lignin der Nadelhölzer einen hohen Coniferylanteil, während im Stroh von Getreiden der Cumarylanteil überwiegt. In den Zellwänden ist Lignin kovalent mit Cellulose verknüpft. Man hat lignifizierte Zellwände mit Stahlbeton verglichen, wobei die Cellulosefibrillen den Stahl und das Lignin den Beton darstellen. Neben dieser Funktion zum Aufbau mechanisch robuster Pflanzenteile, wie Stängel und Zweige oder als Festigkeitselemente für die Leitgefäße des Xylems, hat Lignin noch eine weitere Schutzfunktion: Durch seine Festigkeit macht es Pflanzengewebe für Herbivoren, Bakterien und Pilze schwer verdaulich. Bei Verrottung von Bäumen erfolgt der Ligninabbau in erster Linie durch Waldfäulepilze. Lignin hemmt das Eindringen pathogener Mikroorganismen. In vielen Pflanzen wird Lignin als Antwort auf eine Verwundung gebildet.
Trockenes Holz besteht oft zu einem Drittel aus Lignin. Bei der Zellstoff und Papierherstellung verursacht die Abtrennung des Lignins hohe Kosten und erhebliche Umweltbelastungen. Es wird daher mit gentechnischen Methoden versucht, die Ligninbildung in Holzgewebe von Bäumen zu reduzieren. Mit Antisense-Konstrukten (Abschn. 22.5) von Enzymen der Ligninbiosynthese konnte der zugängliche Zuckeranteil erhöht werden, was die Möglichkeiten der Verwendung von Holz zur Gewinnung von Biotreibstoffen verbessert.

Suberine bilden eine gas- und wasserundurchlässige Isolierschicht
Suberin ist ein Polymer aus Phenylpropanen, langkettigen Fettsäuren und Fettalkoholen (C18-C30) sowie Hydroxyfettsäuren und Dicarbonsäuren (C14-C20) (Abb. 18.10). Im Suberin sind die Phenylpropane teils wie im Lignin direkt miteinander verbunden. Die 9'-0H-Gruppen sind jedoch meist an dieser Verknüpfung nicht beteiligt und bilden statt dessen mit den genannten Fettsäuren Ester. Oft sind zwei Phenylpropane durch Esterbildung mit einer Dicarbonsäure miteinander verknüpft, auch bilden Fettsäuren und Hydroxyfettsäuren miteinander Ester. Wenngleich der Mechanismus der Suberinpolymerisation zu dem dreidimensionalen Netzwerk noch weitgehend unbekannt ist, so gibt es doch Hinweise, dass auch hier Peroxidasen beteiligt sind.

Suberin ist ein Zellwandbestandteil und bildet gas- und wasserundurchlässige Schichten. Es ist wahrscheinlich im Caspary-Streifen der Wurzel-Endodermis enthalten und wirkt dort als eine Diffusionsbarriere zwischen dem Apoplasten der Wurzelrinde und dem Zentralzylinder. In vielen C4-Pflanzen befindet sich zwischen den Bündelscheiden- und den Mesophyllzellen Suberin als Isolationsschicht. Einen besonders hohen Gehalt an Suberin hat Korkgewebe. Dieses besteht aus abgestorbenen Zellen, die abwechselnd von Schichten aus Suberin und Wachs (Kapitel 15) umgeben sind. Verkorkte Zellen findet man im sekundären Abschlussgewebe und auch in der Borke. Die suberinhaltigen Korkschichten bieten Schutz vor Wasserverlust, gegen die Infektion durch Mikroorganismen und wirken als Wärmeschutz, wodurch manche Pflanzen sogar kurzfristige Feuereinwirkungen bei Waldbränden überleben können, um danach wieder auszutreiben.

Cutin ist isolierender Bestandteil der Cuticula
Die Epidermis von Blättern und anderen Sprossorganen ist von einer gas- und wasserundurchlässigen Cuticula umgeben (Kapitel 8). Die Cuticula besteht aus einer durch Cutin imprägnierten Zellwand, die von außen zusätzlich von einer Wachsschicht bedeckt ist. Cutin ist ein dem Suberin ähnliches Polymer, das allerdings einen vergleichsweise geringen Anteil an Phenylpropanen und Dicarbonsäuren besitzt und hauptsächlich aus veresterten Hydroxyfettsäuren (C16-C18) zusammengesetzt ist. Die Biosynthese der Cutin-Monomere ist, insbesondere auch durch Untersuchungen an der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, bereits recht gut verstanden.

18.3 Für die Bildung von Flavonoiden und Stilbenen wird ein zweiter aromatischer Ring aus Acetatresten gebildet
Die wohl umfangreichste Gruppe der Phenylpropanoide sind die Flavonoide, bei denen ein weiterer aromatischer Ring mit dem 9'C-Atom des Phenylpropans verknüpft ist. Ausgangsprodukt für die Synthese der Flavonoide ist Chalcon (Abb. 18.11). Seine Bildung erfolgt durch die Chalcon-Synthase (CHS) aus p-Cumaroyl-CoA sowie drei Molekülen Malonyl-CoA, die unter CO2-Abspaltung ein dreiwertiges Phenol bilden. Man bezeichnet diese Reaktion auch als Malonatweg.

Durch die Abspaltung der drei CO2 und der vier CoA-Moleküle ist die Synthese des Chalcons ein irreversibler Prozess. Letztlich wird der neue aromatische Ring aus Acetatresten gebildet. Als Startenzym der Flavonoidbiosynthese ist die CHS besonders intensiv untersucht worden. In manchen Pflanzen wurden nur ein bis zwei verschiedene Isoenzyme gefunden, in anderen neun. Mengenmäßig ist die CHS das häufigste Enzym des Phenylpropanoidstoffwechsels. Dies ist wahrscheinlich auf die niedrige katalytische Aktivität dieses Enzyms zurückzuführen. Ähnlich wie die Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (Abschn. 18.1) unterliegt die de-novo-Synthese der CHS einer vielfältigen Kontrolle der Genexpression durch interne und externe Faktoren, darunter auch durch Elicitoren.

Zu den Stilbenen zählen sehr wirksame natürliche Fungizide
Manche Pflanzen, dazu gehören z.B. Kiefer, Weinrebe und Erdnuss, besitzen eine Stilben-Synthase, durch die ebenfalls p-Cumaroyl-CoA mit drei Molekülen Malonyl-CoA reagiert, wobei im Gegensatz zur CHS zusätzlich das 9'C-Atom des Phenylpropans als CO2 abgespalten wird (Abb. 18.11). Das so gebildete Resyeratrol ist ein Phytoalexin und gehört zur Stoffklasse der Stilbene. Zur Gruppe der Stilbene gehören eine Reihe sehr wirksamer pflanzlicher Fungizide, darunter das von der Weinrebe gebildete Viniferin (Abb. 18.12). Die Erforschung der Stilbensynthese eröffnet neue Möglichkeiten der Pilzbekämpfung. So wurde ein Gen zur Bildung von Resveratrol aus der Weinrebe durch molekulargenetische Transformation in Tabak exprimiert; die daraus entstandenen, transgenen Tabakpflanzen sind gegen den pathogenen Pilz Botrytis cinerea geschützt.


Flavonoide haben in der Pflanze vielfältige Funktionen
Durch die Chalcon-Isomerase wird Chalcon in Flavanon umgewandelt (Abb. 18.13). Der Ringschluss erfolgt durch die Addition einer phenolischen Hydroxygruppe an die Doppelbindung der C-Kette, welche die beiden Phenole verbindet.

Flavanon ist Ausgangssubstanz für eine Vielfalt von Flavonoiden, auf deren Synthesewege hier nicht eingegangen werden kann. Als Schlüsselenzym der Flavonoidsynthese unterliegt die Synthese der Chalcon-Isomerase einer strengen Kontrolle. Sie wird wie PAL und CHS durch Elicitoren induziert.
Zu den Flavonoiden gehören viele Phytoalexine und Fraßgifte. Beispiele hierfür sind das Fraßgift Rotenon (Abschn. 5.5), ein Isoflavon-Dimer, sowie das Phytoalexin Medicarpin, ein Isoflavon aus der Luzerne (Abb. 18.14).

Flavonoide dienen auch als Signale der Pflanze für Wechselbeziehungen mit Symbionten. So werden Flavone und Flavonole als Signalsubstanzen von Leguminosenwurzeln ausgesendet, um Rhizobien chemotaktisch anzulocken und in diesen die Genexpression der Nod-Faktoren auszulösen (Abschn. 11.1). Es mehren sich auch Befunde, dass Flavonoide direkt oder indirekt in die pflanzliche Entwicklung eingebunden sein könnten. So zeigen einige Pflanzenarten mit verändertem Flavonoidmuster eine abnorme Pollenentwicklung. Indirekt können einige Flavonoide über die Beeinflussung des Transportes des Wachstumshormons Auxin in die pflanzliche Entwicklung eingreifen.
Flavone und Flavonole haben ihr Absorptionsmaximum im ultravioletten Bereich. Sie schützen als Schirmpigmente Pflanzen vor den schädigenden Auswirkungen ultravioletter Strahlung. Die Bestrahlung von Blättern mit UV-Licht löst eine stark vermehrte Flavonoidsynthese aus. Mutanten von Arabidopsis thaliana (siehe Abschn. 20.1), die wegen eines Defektes der Chalcon-Synthase oder der Chalcon-Isomerase kein Flavon synthetisieren können, zeigen eine hohe Überempfindlichkeit gegenüber der Bestrahlung mit UV-Licht. In manchen Pflanzen wirken auch Fettsäureester der Sinapinsäure (Abschn. 18.2) als Schirmpigmente gegen UV-Licht.
Viele Flavonoide wirken als Antioxidantien, indem sie als Radikalfänger für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) fungieren, und damit z.B. die Peroxidation von Lipiden verhindern. Bei der menschlichen Ernährung wird einigen Flavonoiden, z. B. Quercetin, eine krebshemmende Wirkung zugeschrieben. Daraus wird abgeleitet, dass Flavonoidhaltige Nahrungsmittel, wie grüner Tee und Rotwein, eine positiven Einfluss auf die Gesundheit haben.
Eine besondere Beachtung haben Isoflavone gefunden, die in erster Linie von Leguminosen gebildet werden. Man hatte beobachtet, dass Schafe, die auf bestimmten Kleesorten grasten, unfruchtbar wurden. Bei näherer Untersuchung zeigte sich, dass die betreffendem Futterpflanzen Isoflavonoide enthalten, die in Tieren ähnlich wie das Hormon Östrogen wirken. Eine starke Östrogenwirkung hat das in Abbildung 18.13 gezeigte Isoflavon Genistein. Einige Isoflavonoide werden als "Phytoöstrogene" für therapeutische Zwecke eingesetzt.

Anthocyane sind Blütenfarbstoffe und dienen dem Lichtschutz von Pflanzen
Als gelbe und orangefarbene Blütenpigmente wurden bereits Carotinoide beschrieben (Abschn. 17.6). Weitverbreitete gelbe Blütenpigmente sind Chalcone; hellgelbe Blütenpigmente sind Flavone . Anthocyane bilden eine große Anzahl roter und blauer Blütenpigmente. Anthocyane sind Glucoside von Anthocyanidinen (Abb. 18.15), wobei die Zuckerkomponente, die aus einem oder mehreren Hexosen besteht, zumeist mit einer OH-Gruppe des Pyrryliumringes verknüpft ist. Anthocyane werden als Glutathionkonjugat über den Glutathion-Translokator (Abschn.12.2) in die Vakuole aufgenommen und dort gelagert. Das in der Abbildung gezeigte Anthocyan Pelargonin besitzt als farbgebende Komponente Pelargonidin. Die Einführung von zwei OH-Gruppen in 3'- und 5'-Position des Phenylrestes durch Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenasen (Abschn. 18.2) und anschließende Methylierung ergibt fünf weitere Blütenpigmente jeweils unterschiedlicher Färbung. Hydroxylierungen an anderen Positionen führen zu zusätzlichen Pigmenten. Änderungen des pH-Wertes in der Vakuole führen zu Farbverschiebungen, was zum Teil die Farbänderungen beim Verblühen erklärt. Dazu wird die Farbe der Pigmente durch eine Komplexbildung mit Metall-Ionen verändert. So wechselt bei einer Komplexierung mit Al3+ oder Fe3+ die Farbe von Pelargonin von orangerot nach blau. Diese vielen Pigmente und deren Mischung ergeben die Farbnuancen der Blüten. Mit Ausnahme von Pelargonidin findet man die in Abbildung 18.15 aufgelisteten Pigmente alle in der Petunie. Es wurden in Petunien bislang insgesamt 35 Gene charakterisiert, die an der Ausprägung der Blütenfarben beteiligt sind.

Anthocyane umfassen nicht nur Blütenfarbstoffe zur Anlockung von pollenübertragenden Insekten, sie wirken auch als Schirmpigmente zur Beschattung von Mesophyllzellen. Daher zeigen Pflanzen, bei denen das Wachstum durch Stressfaktoren verringert ist - beispielsweise durch Mangel an Phosphat, Kälte, Hitze oder Versalzung des Bodens - oft eine rote Blattfärbung, die in erster Linie auf die Akkumulation von Anthocyanen zurückzuführen ist. Stressbedingungen reduzieren in der Regel den Verbrauch des durch die Lichtreaktion der Photosynthese bereitgestellten NADPH und ATP. Eine Beschattung der Mesophyllzellen durch Anthocyane drosselt die Lichtreaktion und vermindert so eine Über-Energetisierung und Über-Reduktion des photosynthetischen Elektronentransports.

18.4 Tannine binden fest an Proteine und haben dadurch Abwehrfunktionen
Als Tannine (engl. to tan „gerben") bezeichnet man pflanzliche Polyphenole, die als Gerbstoffe verwendet werden. Tannine sind in Pflanzen weit verbreitet, sie kommen in besonders hohen Konzentrationen in den Borken bestimmter Bäume (z.B. Eichen) und in Gallen vor. Man unterscheidet dabei zwischen den kondensierten und den hydrolysierbaren Tanninen (Abb. 18.16). Die kondensierten Tannine (A) sind Flavonoidpolymerisate und daher Produkte des Phenylpropanoidstoffwechsels. Über den genauen Syntheseweg ist jedoch wenig bekannt. Wahrscheinlich ist eine Dihydroflavonol-Reduktase an der Polymerisation beteiligt, die über Radikalbildung verläuft. Die hydrolysierbaren Tannine bestehen aus glycosylierten Gallussäuren (B), wobei meist viele Gallussäuren an ein Hexosemolekül gebunden sind. Die Gallussäure wird in Pflanzen hauptsächlich aus Shikimat (Abb. 10.19) gebildet.

Über Wasserstoflbrücken zwischen den Phenolgruppen und -NH-Gruppen sind Phenole an Proteine so fest gebunden, dass die Bindung durch Verdauungsenzyme nicht gespalten werden kann. Beim Gerben bindet Tannin an das Kollagen der Tierhäute und erzeugt so Leder, das von Mikroorganismen nicht angegriffen werden kann. Tannine haben einen scharfen, unangenehmen Geschmack. Die Bindung der Tannine an die Proteine der Schleimhäute und des Speichels "zieht den Mund zusammen". Auf diese Weise wird Tieren der Genuss tanninhaltiger Pflanzen im wahrsten Sinne des Wortes vergällt. Aber es ist nicht nur der schlechte Geschmack, der Herbivoren abschreckt. Beim Verzehr von Pflanzenteilen kommt es zu einer Bindung des Tannins an die pflanzlichen Proteine. Diese werden dadurch unverdaulich und so als Nahrung unbrauchbar. Auch reagieren Tannine möglicherweise mit den Verdauungsenzymen des Magen-Darm-Traktes der Herbivoren. Tannine sind auf diese Weise ein wirksamer Fraßschutz. Ein Beispiel soll dies erläutern: In der südafrikanischen Savanne bilden Akazienblätter die Hauptnahrung der Kudu, einer Antilopenart. Diese Blätter enthalten Tannin, aber in so geringen Mengen, dass es sich auf die Nahrungsqualität nicht auswirkt. Durch Fraß verletzte Bäume emittieren das gasförmige Ethylen (Abschn. 19.5), das auch in den benachbarten Akazien innerhalb von 30 Minuten die Synthese von Tannin in den Blättern auslöst. Nach stärkerem Fraß steigt der Tanningehalt in den Blättern der Akazien so stark an, dass die Kudu an ihrem Verzehr zugrunde gehen können. Über ein gemeinsames Warnsystem schützen sich so die Akazien durch Tannin vor Kahlfraß.
Tannine schützen Pflanzen auch gegen den Befall durch Mikroorganismen. Der Angriff von Mikroorganismen auf Pflanzenzellen wird oft durch eine Sezernierung hydrolytischer Enzyme zum Aufbrechen der pflanzlichen Zellwände eingeleitet. Durch Bindung an Tannin werden diese Enzyme inaktiv. Tannin ist somit für die Pflanze ein wirksames Verteidigungsmittel gegen mikrobielle Angriffe.nach oben zum Kapitelanfang

19 Vielfältige Signale koordinieren Wachstum und Entwicklung verschiedener Pflanzenorgane und bewirken deren Anpassung an unterschiedliche Umweltbedingungen
In komplexen Vielzellern, wie höheren Pflanzen und Tieren, werden Metabolismus, Wachstum und Entwicklung der verschiedenen Organe durch die Aussendung von Signalsubstanzen aufeinander abgestimmt. In Tieren erfolgt dies durch Hormone, die von bestimmten Zellen sezerniert werden. Man unterscheidet dabei parakrine Hormone, welche eine Signalwirkung auf benachbarte Zellen ausüben, und endokrine Hormone, die zu entfernten Zellen gesendet werden, beispielsweise über den Blutkreislauf. Auch in Pflanzen werden in bestimmten Organen Signalsubstanzen gebildet, die oft Signale auf benachbarte Zellen übertragen, aber auch durch Xylem oder Phloem auf entfernte Organe verteilt werden, um dort ihre Signale zu übermitteln. Alle diese pflanzlichen Signalsubstanzen werden als Phytohormone bezeichnet. Es gibt Phytohormone, die in ihrer Struktur den tierischen Hormonen ähneln, wie zum Beispiel die Brassinosteroide, aber auch viele, die gänzlich andere Strukturen besitzen. Ebenso wie die tierischen Hormone haben auch die Phytohormone sehr viele unterschiedliche Signalfunktionen. So bewirken sie eine Anpassung des Pflanzenstoffwechsels an Umweltbedingungen, wie Wasserversorgung, Temperatur und Tageslänge, und steuern die Entwicklung. Die Steuerfunktion der Lichtqualität auf den Pflanzenstoffwechsel erfolgt über spezifische Lichtsensoren. Bekannte Sensoren für die Erkennung von rotem und dunkelrotem Licht sind Phytochrome, und von blauem Licht Cryptochrome sowie Phototropin und UVR8 (Ultraviolet-Resistance-8) und UV-B (280-315 nm).
Während für tierische Hormone die Signalketten zwischen der Bindung des Hormons an den betreffenden Rezeptor und der Wirkung auf spezifische Parameter, wie die Transkription von Genen oder die Aktivität von Enzymen, in sehr vielen Fällen als auf geklärt betrachtet werden können, sind die Kenntnisse über die Signalketten für Phytohormone und pflanzliche Lichtsensoren bislang lückenhaft. Wie auch im tierischen Stoffwechsel wirken in der Pflanze die Phytohormone und Sensoren offenbar als Multikomponenten-System, in dem die Abfolge der Reaktionen in einzelnen Signalketten zu einem Netzwerk verwoben sind. Diese grundsätzliche Ähnlichkeit der Signal-Netzwerke der Pflanzen und Tiere ist das beste Argument dafür, dass Phytohormone ebenfalls als Hormone bezeichnet werden können, was lange Zeit als fraglich erschien.

19.1 Signalketten und Netzwerke starten mit Rezeptoren
Moleküle mit Signalcharakter müssen von solchen, die kein Signal darstellen, unterschieden werden können. Dies kann ein Rezeptor, indem er ein Signalmolekül besonders stark bzw. spezifisch bindet und so von anderen Molekülen unterscheiden kann. Die Bindung des Signalstoffes löst dann z.B. eine Konformations-Änderung im Rezeptor aus. Dies konnte für Phytochrom und Phototropin nachgewiesen werden. Der Rezeptor führt anschließend eine Reaktion aus, die z.B. die Aktivität eines oder mehrerer Enzyme ändert. Auch dieses Enzym kann dann einen oder mehrere Vorgänge oder Enzyme beeinflussen, so dass nach wenigen Schritten ein verzweigtes Netzwerk von Signalreaktionen entsteht, was auch zu einer Signalverstärkung führt. Die Bindung des Signalmoleküls an den Rezeptor verbraucht keine Energie, jedoch sind die Folgereaktionen oft energieverbrauchend. Gegen-Reaktionen sind unbedingt notwendig, um auf diese Weise schwache oder vorrübergehende Signale zu unterdrücken bzw. nach Wegfall des Signalmoleküls die Reaktionen wieder auszuschalten.
Aufgrund der vielen bekannten Pflanzen-Genome wissen wir, dass in höheren Pflanzen ganz andere Genfamilien für Rezeptoren häufig sind als in Tieren und dass sie auch einige Genfamilien für Rezeptoren besitzen, die in Tieren nicht vorkommen (Tab. 19.1).

Dies sind z.B. die Lichtsensoren (Phytochrome, Phototropine, Cryptochrome und UVR8) oder die sogenannten Zwei-Komponenten-Rezeptoren. Aber auch die Anzahl der Gene der Rezeptor-Genfamilien ist ganz unterschiedlich bei Pflanzen und Tieren. Mit 500 - 1200 Genen sind die Rezeptorkinasen (RLK = receptor-like kinase) die häufigsten Rezeptoren in Pflanzengenomen (Abb. 19.1). Sie bestehen aus drei Domänen, der extracytoplasmatischen Rezeptordomäne, einer Transmembran-Helix und einer cytoplasmatischen Proteinkinase. Nur von wenigen wissen wir die zugehörigen Liganden. Beispiele sind das Steroid-Hormon Brassinolid und etliche verschiedene Peptide mit sehr unterschiedlichen Funktionen. In Tieren ist der Insulin-Rezeptor die bekannteste Rezeptorkinase.

Es gibt cytosolische (lösliche) Rezeptoren und Membranprotein-Rezeptoren. Die Lichtsensoren, aber auch die Hormon-Rezeptoren TIRl/AFB und SKP2A für Auxin, COI1 für Isoleucin-Jasmonat, GIDl für GA und die PYR-Rezeptoren für ABA sind cytosolische Rezeptoren. Auxin besitzt einen zweiten Rezeptor, ABP 1, der außen an der Plasmamembran und vermutlich an eine RLK bindet, das das Signal in das Cytoplasma übermitteln kann. Die Zwei-Komponenten-Rezeptoren für Cytokinin in der Plasmamembran und Ethylen im ER sind oberflächlich den receptor-like Kinasen (RLKs) ähnlich und haben auf der extracytoplasmatischen Seite der Membran eine Liganden-Bindungsdomäne, eine Transmembrandomäne und eine Histidin/Aspartat-Kinase auf der cytosolischen Seite. Die zweite Komponente ist beim Cytokinin- Rezeptor ein separates Histidin-Transferprotein, das das Phosphat vom Rezeptor erhält und an Transkriptionsfaktoren weitergibt und diese dadurch aktiviert. Auch die Bindung des Hormons an den Ethylen-Rezeptor führt über wenige Schritte ohne sekundäre Botenstoffe zu Transkriptionsfaktoren.
Allen Rezeptoren ist gemeinsam, dass sie nach der Aktivierung durch Liganden oder bei Lichtsensoren durch Photonen Enzymreaktionen aktivieren oder inaktivieren, damit nach einigen oder vielen Stationen Transkriptionsfaktoren aktiviert oder inaktiviert werden, die die Genexpression steuern. Letztendlich benötigt die Ausführung einer physiologischen Änderung der Zelle oder des Organismus nach einiger Zeit praktisch immer eine geänderte Protein- bzw. Enzym-Zusammensetzung. Dabei werden oft (aber nicht immer) niedermolekulare Stoffe im Cytosol (z.B. cGMP, cAMP) entweder durch Enzyme gebildet oder auch Ionen-Konzentrationen im Cytosol durch Ionen-Kanal-Steuerung erhöht (Ca2+, H+), die man als sekundäre Botenstoffe bezeichnet. Der primäre Botenstoff ist das Hormon oder ein anderer Ligand, die sekundären Botenstoffe der Pflanzen sind meist die gleichen wie bei den Tieren (Tab. 19.2). Primäre und sekundäre Botenstoffe werden wieder abgebaut oder die ursprünglichen Ionenkonzentrationen wiederhergestellt. Nicht alle Enzyme, die die sekundären Botenstoffe der Pflanzen herstellen, sind molekular identifiziert. Ebenso unbekannt sind häufig die exakten Mechanismen der Aktivierung dieser Enzyme.

Die Rezeptorkinasen liegen als Monomere in der Membran vor. Die Liganden befinden sich im Kompartiment der Zellwand (Abb 19.1) . Durch die Ligandenbindung auf dieser extracytoplasmatischen Seite der Membran bilden sich Rezeptor-Dimere, die nahezu gleichzeitig damit auch eine Konformationsänderung eingehen. Das aktiviert die Proteinkinase-Domäne im Cytosol und diese Kinase-Domänen phosphorylieren sich unter ATP-Verbrauch gegenseitig. Danach können die Kinase-Domänen auch andere Proteine phosphorylieren. In Pflanzen werden mehr als 500 Kinasen vermutet. Für die Mehrheit der Rezeptoren sind die Substrat-Proteine und die dann folgenden weiter ausgelösten Reaktionen nicht bekannt.

Kleine G-Proteine haben verschiedene regulative Funktionen
Alle Eukaryoten besitzen kleine G-Proteine, welche nur aus einer Untereinheit bestehen, und größere trimere G-Proteine bestehen aus α -, ß- und y-Untereinheiten, deren α-Untereinheit verwandt mit den kleinen G-Proteinen sind. Der häufigste Rezeptortyp der Tiere ist der sogenannte G-Protein-gekoppelte Rezeptor, der sieben Transmembran-Helices besitzt und sehr verschiedene Hormone binden kann und mit mehr als 2000 Genen in Säugetieren vertreten ist (Abb. 19.2). Der cytosolische Bindungspartner für diesen Rezeptortyp, das trimere G-Protein, ist in Säugetieren mit ca. 20 Genen für die α-Untereinheit vertreten. In Pflanzen ist nur ein trimeres G-Protein und bisher kein zugehöriger Transmembran-Rezeptor gefunden worden. Man vermutet, dass das trimere G-Protein in der Sensorik des Status des Zuckerstoffwechsels eine wichtige Rolle spielt, also eine sehr allgemeine Funktion hat. Bei Pflanzen ist Zucker ein Signalstoff mit hormonähnlichem Charakter, der mit anderen Hormonen interagiert und auch die Genexpression steuert. Ein Rezeptor für Zucker in Pflanzen ist noch nicht eindeutig gefunden worden. Wenn ein Ligand am Rezeptor bindet, erfolgt ein GDP-GTP-Austausch und der trimere Komplex dissoziert. Daraufhin bindet die α-Untereinheit an ein Enzym, z.B. GMP-Cyclase (Abb. 19.2B) und aktiviert dieses.

Alle G-Proteine gehören zu einer Superfamilie, die als ras-Superfamilie bezeichnet wird. Kleine G-Proteine haben sehr unterschiedliche Funktionen, sie sind u. a. beteiligt an der Regulation von Abwehrreaktionen, dem Vesikeltransport, der Zellpolarität und dem polaren Wachstum von Pollenschläuchen und Haaren. Die Kenntnisse über die kleinen G-Proteine in Pflanzen sind noch lückenhaft. In Abb. 19.1 ist dargestellt, dass zunächst die Rezeptorkinase z.B. einen Austauschfaktor (G-Protein-Exchange-Factor, GEF) phosphoryliert und aktiviert, der den Austausch von GDP zu GTP an einem kleinen (monomeren) G-Protein (ca. 80 im Pflanzengenom) katalysiert, so dass das G-Protein in den aktiven Zustand versetzt wird. Das aktivierte G-Protein bindet an weitere Proteine, die durch diese Bindung aktiviert werden, z.B. an Cytoskelett-Proteine. Gleichzeitig ist jedes G-Protein eine langsame GTPase, die GTP zu GDP und Phosphat hydrolysiert, dazu aber Minuten braucht. Das bedeutet, dass das einzelne G-Protein über diesen Zeitraum aktiv bleibt und danach automatisch wieder abgeschaltet wird. Das System ist typisch für Signaltransduktion, weil Energie verbraucht wird und so durch mehrere G-Proteine Signalverstärkung auch möglich wird. Gleichzeitig ist das Abschalten vorgesehen, wenn das Signal wegfällt.

Ca2+ wirkt als Botenstoff bei der Signaltransduktion
Sowohl in tierischen als auch in pflanzlichen Zellen ist normalerweise die cytosolische Konzentration des freien Ca2+ kleiner als l0-6 M. Für diese niedrigen Ca2+-Konzentrationen sind ATP-abhängige Pumpen (Ca2+-P-ATPasen, (Abschn. 8.2) verantwortlich, die Ca2+ im Lumen des endoplasmatischen Reticulums und in Pflanzen auch in der Vakuole akkumulieren oder Ca2+ über die Plasmamembran exportieren (Abb. 19.3).

Alternativ können Ca2+-Ionen in die Mitochondrien über einen H+/Ca2+-Antiporter aufgenommen werden. Eine kurzzeitige Öffnung von Ca2+-Kanälen der Plasmamembran, der Vakuole oder des ER, die durch Signale (z.B. Salz, ABA, Trockenheit und Kälte) ausgelöst wird, führt zu einem raschen Anstieg der cytosolischen Konzentration an freiem Ca2+. Dies führt in fast allen Zelltypen zu einer Stimulierung bestimmter Enzyme, darunter auch regulatorischer Enzyme wie Proteinkinasen, die somit für die Umsetzung des Ca2+-Signals in der Zelle verantwortlich sind. Je nach den durch ein Signal angesteuerten Kanälen unterscheidet man externe Ca2+-Quellen (Plasmamembran-Kanäle) oder interne Ca2+-Quellen (Vakuole, ER). Außerdem kann Ca2+ auch in Mitochondrien und Chloroplasten gespeichert werden und ins Cytosol entlassen werden. Die molekulare Identität der pflanzlichen Ca2+-Kanäle ist noch unklar, da ihre Sequenzen offensichtlich nicht homolog zu den tierischen Kanälen sind.

Der Phosphoinositolweg steuert die Öffnung von Ca2+-Kanälen
Eine Möglichkeit zur Steuerung von Ca2+-Kanälen bietet die bei Tieren entdeckte Phosphoinositol-Signaltransduktions-Kaskade (Abb. 19.4), die grundsätzlich auch bei Pflanzen nachgewiesen wurde. Phosphatidylinositol ist Bestandteil von Zellmembranen. Durch eine Kinase wird der Inositolrest in den 4' - und 5'-Positionen phosphoryliert. Eine in Pflanzen durch Ca2+ stimulierte Phospholipase C spaltet dann das Lipid zu Inositol-1',4',5'-triphosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG).

Die tierische Phospholipase C wird durch die α-Untereinheit eines G-Proteins stimuliert. IP3 in Tieren oder bei Pflanzen und das höher phosphorylierte IP6 bewirken einen Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration aus dem ER oder der Vakuole, und Diacylglycerin stimuliert in Tieren eine Ca2+-abhängige Proteinkinase. Wahrscheinlich hat im pflanzlichen Stoffwechsel Diacylglycerin als solches keine Signalfunktion, wohl aber die durch dessen Phosphorylierung gebildete Phosphatidsäure (Abb. 15.5). Diese wirkt auch auf Proteinkinasen und Ionenkanäle. In tierischen Zellen führt die Bindung von drei IP3-Molekülen an einen Ca2+-Kanal der ER-Membran zu dessen Öffnung. Die Ausschüttung des Ca2+ in das Cytosol wird durch die kurze Lebensdauer von IP3 (in Tieren z.T. weniger als 1s) begrenzt. Der Abbau von IP3 erfolgt entweder über eine weitere Phosphorylierung des Inositols oder eine hydrolytische Abspaltung der Phosphatgruppen durch eine Phosphatase und dürfte für IP6 analog verlaufen. Die kurze Lebenszeit ermöglicht eine zeitliche Begrenzung des Signals. In Pflanzen spielt die Phosphoinositol-Kaskade eine wichtige Rolle bei der Übermittlung von Signalen durch Stressoren auf das Zellgeschehen, wie bei der Regulation der Öffnung der Schließzellen oder bei Pathogenbefall. Die Signalperzeption beginnt häufig an der Plasmamembran und der Ca2+-Influx stimuliert die Phospholipase C, die über IP3IP6 den Ca2+-Efflux aus dem ER oder der Vakuole auslöst. Durch patch clamp-Untersuchungen wurde an Pflanzenvakuolen eine Öffnung von Ca2+-Kanälen durch IP3 oder IP6 gezeigt. Insgesamt ist die Regulation des cytosolischen Calciums hochkomplex und Calcium scheint viele Signalwege beeinflussen zu können. Calcium wirkt sehr schnell am Entstehungsort in der Zelle und wird von Proteinen gebunden um dort ganz lokal Aktivierungen/Inaktivierungen in Gang zu setzen. Vermutlich wirkt Calcium von externen und internen Quellen unterschiedlich auf die Zelle.

Calmodulin vermittelt die Botenstoffwirkung von Ca2+ -Ionen
Ca2+ wirkt als Botenstoff oft nicht direkt, sondern über die Bindung an Calmodulin. Calmodulin ist ein in Tieren und Pflanzen vorkommendes hochkonserviertes Protein: Die Identität der Aminosäuresequenzen zwischen dem Calmodulin in Weizen und in Rindern beträgt 91%. Calmodulin ist ein lösliches Protein (Molekularmasse 17 kDa), das in erster Linie im Cytosol vorkommt. Es besteht aus einer flexiblen Helix, die zu beiden Seiten je zwei Schleifen hat, wo bei jede dieser Schleifen eine Bindungsstelle für ein Ca2+-Ion besitzt. Da diese Schleifen auch Glutamat (E) und Phenylalanin (F) enthalten, nennt man sie EF-Hände (Abb. 19.5).

Die Besetzung aller vier EF-Hände mit Ca2+ führt zu einer Konformationsänderung des Calmodulins, dadurch wird eine hydrophobe Domäne exponiert. Diese Domäne aktiviert bestimmte Proteinkinasen (Calmodulin-bindende Kinasen (CBK)). Bei der Proteinkinase CaM II wird dabei zunächst die Kinase durch sich selbst phosphoryliert (Autophosphorylierung) und erreicht erst damit die volle Aktivität, und behält sie auch noch nach Ablösung des Calmodulins solange, bis der Phosphatrest wieder hydrolytisch abgespalten wird. Calmodulin bindet auch an andere Proteine und verändert so deren Aktivität. Es ist dadurch ein wichtiges Glied in Signalketten. Es gibt in Pflanzen eine Familie von Proteinkinasen, die wie Calmodulin, Ca2+-bindende EF-Hände in ihrer Proteinkette enthalten. Man bezeichnet sie als Calmodulin-Domäne-ähnliche-Proteinkinasen (CDPK). Es handelt sich hierbei um Proteinkinasen sehr unterschiedlicher Funktion, die direkt durch Bindung von Ca2+ reguliert werden. In Arabidopsis hat man inzwischen mehr als 40 verschiedene Gene der CDPK-Familie gefunden, wobei man von den meisten dieser Kinasen die Funktion noch nicht kennt. Möglicherweise ist eine CDP-Kinase für die Phosphorylierung der Saccharosephosphat-Synthase (Abb. 9.18) und der Nitratreduktase (Abb. 10.9) verantwortlich. Daneben gibt es noch andere Proteine mit Calmodulin-Domänen, so genannte Calmodulin-related-proteins, deren Funktionen meist noch nicht bekannt sind.

Phosphorylierte Proteine bilden Elemente der Signaltransduktion
Proteinkinasen, von denen einige schon im vorigen Abschnitt erwähnt wurden, und Protein-Phosphatasen, von denen wir bereits mehrere Beispiele kennengelernt haben, sind wichtige Elemente für die Regulation intrazellulärer Prozesse. Da Proteine durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung zwischen zwei Zuständen unterschiedlicher Aktivität wechseln und auch viele Proteinkinasen durch Phosphorylierung ein- beziehungsweise ausgeschaltet werden, bilden Proteinkinasen in der Zelle ein Netzwerk von Ein/Aus-Schaltelementen - vergleichbar mit denen eines Computer-Chips - durch die Wachstum, Differenzierung, Metabolismus, Abwehr gegen Feinde und andere Zellprozesse gesteuert werden. Man schätzt, dass in Eukaryonten 1 bis 3% der funktionellen Gene für Proteinkinasen codieren, in Pflanzen kommen ca. 2000 Proteinkinase-Gene einschließlich der Rezeptor-Kinasen vor. Proteinkinasen wurden zunächst hauptsächlich in Hefen und Tieren untersucht.
Jedoch ist bislang erst von einem kleinen Teil die physiologischen Funktionen bekannt. Wir stehen noch ganz am Anfang eines gewiss sehr wichtigen Forschungsgebietes. Der weitaus überwiegende Anteil der Proteinkinasen in Eukaryonten, ob in Pilzen, Tieren oder Pflanzen, enthält 12 konservierte Regionen. Diese Proteinkinasen phosphorylieren zumeist die OH-Gruppe von Serin und/oder Threonin und in manchen Fällen auch von Tyrosin. Da alle diese Proteinkinasen zueinander homolog sind, spricht man hier von einer Superfamilie eukaryontischer Proteinkinasen zu denen auch die Kinase-Domäne der Rezeptorkinasen gehört. Nicht zu dieser Superfamilie gehören Proteinkinasen der Zwei-Komponenten-Rezeptoren, die Histidin- oder Aspartatreste von Proteinen phosphorylieren, wie z.B. der Cytokinin-Rezeptor oder der Ethylen-Rezeptor. Tabelle 19.3. zeigt einige Verteter der Proteinkinase-Superfamilie. Die Proteinkinasen-A, -G, und -C der Tiere werden durch die Modulatoren cAMP, cGMP beziehungsweise Ca2+ aktiviert. Es gibt Hinweise, dass cAMP und cGMP auch in höheren Pflanzen eine Rolle spielen, aber eindeutig nachgewiesen worden ist nur, dass sie Ionenkanäle regulieren. Mitglieder der Proteinkinase-Superfamilie sind auch die schon besprochenen Calmodulin bindende Kinase (CBK) und die Calmodulin-Domäne-ähnlichen-Proteinkinasen (CDPK). Eine weitere Klasse der Superfamilie sind die receptor like Proteinkinasen (RLK), eine weitere die Cyclin-abhängigen Proteinkinasen (CDK) (cyclin-dependent protein kinase). Cyclin ist ein in allen Eukaryontenzellen vorhandenes Protein, das eine wichtige Funktion bei der Kontrolle der Mitose und damit des Zellzyklus ausübt.

Cyclin-abhängige Proteinkinasen aktivieren eine große Anzahl von Proteinen, welche an der Mitose beteiligt sind. Teil der Proteinkinase-Superfamilie sind zudem die Mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK). Mitogen ist ein Sammelbegriff für eine Vielzahl unterschiedlicher Substanzen, welche die Mitose und damit die Zellteilung stimulieren und deren Struktur zum großen Teil noch nicht bekannt ist. Als Mitogene können beispielsweise G-Proteine und Phytohormone wirken. Man kennt inzwischen bei Arabidopsis über 20 verschiedene MAPK-Gene. Ein über das ganze Eukaryontenreich hochkonserviertes System von Proteinkinasen ist die Kaskade zur Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (die MAP-Kinase-Kaskade) (Abb. 19.1). In dieser Signalkaskade wird - etwa durch eine Rezeptorkinase - eine MAP-Kinase-Kinase-Kinase (MAPKKK) aktiviert, die durch Phosphorylierung eine MAP-Kinase-Kinase (MAPKK) aktiviert, und letztere eine MAP-Kinase (MAPK). Die MAP-Kinase ihrerseits phosphoryliert eine Reihe von Transkriptionsfaktoren (Abschn. 20.2) und reguliert so die Expression verschiedener Gene. MAPK-Signalkaskaden haben eine Schlüsselfunktion bei Hormon-Antworten, der Zellentwicklung und Zelldifferenzierung. Darüber hinaus sind MAP-Kinasen Bestandteil der Signalkaskaden bei durch Elicitoren ausgelösten Pathogenabwehrreaktionen (Abschn. 16.1) und bei Antworten auf abiotischen Stress (z.B. Schwermetall, Kälte, Salz, Trockenheit, Verwundung, (heftige) Berührung). In einer Pflanze können mehrere MAPK-Signalkaskaden mit unterschiedlichen Zielproteinen nebeneinander ablaufen, oder Teile verschiedener MAP-Kinase-Wege überlappen, da diese Kinasen Komplexe bilden, so dass die Interaktionen in einem Netzwerk verlaufen. Für diese vielfältige Ausprägung des MAP-Kinase-Systems enthält das Arabidopsis-Genom Gene für 20 MAPKs, 10 MAPKKS und 60 MAPKKKs zur Verfügung. Auch für Proteinphosphatasen gibt es in Eukaryonten eine Superfamilie, die sich aufgliedert in die Serin- und Threonin-Phosphatasen und die Tyrosin-Phospbatasen. Viele dieser Phosphatasen werden ähnlich wie Proteinkinasen reguliert, zum Beispiel durch die Bindung von Ca2+-Calmodulin, und spielen dadurch eine aktive Rolle in Signaltransduktions-Kaskaden. Die Untersuchung der Funktionen der einzelnen Proteinphosphatasen für den Stoffwechsel und das Wachstum von Pflanzen befindet sich noch in den Anfängen.

19.2 Phytohormone umfassen eine Vielfalt unterschiedlicher Substanzen
Die Phytohormone (Abb. 19.6) umfassen organische Substanzen von sehr unterschiedlicher Struktur und Wirkung, die in geringen Konzentrationen wirksam sind (kleiner als 10-6 M). Die „klassischen" Hormone sind Indolessigsäure (engl. IAA), Auxin, Gibberelline, Cytokinine , Abscisinsäure (ABA), Ethylen, Jasmonäure und die Derivate Methyl-Jasmonat und Isoleucin-Jasmonat. Brassinosteroide und Strigolactone (Abschn. 17.6), sowie Salizylsäure sind als Hormone in der letzten Zeit dazugekommen. Hinzu kommen Peptidhormone, von denen eine große Vielfalt in Pflanzen eine wichtige Rollen spielen. Sie regulieren die Pflanzenentwicklung durch Meristem-Differenzierung und sind zusätzlich zu der Wirkung von Salizylsäure und Jasmonsäure an der Pathogenabwehr beteiligt. In vielen Fällen haben Phytohormone antagonistische Wirkungen. So induziert Abscisinsäure die Samen-Dormanz, während Gibberellinsäure diese beendet. Auxin induziert (Seiten)-Wurzelbildung, Cytokinin unterdrückt sie und fördert Spross-Entwicklung.


Auxin stimuliert das Streckungswachstum im Spross
Die Krümmung wachsender Pflanzenkeimlinge nach dem Sonnenlicht hat schon Charles Darwin zusammen mit seinem Sohn Francis 1880 beschäftigt. Sie fanden, dass die Krümmung eines im Dunkeln gewachsenen Graskeimlings durch die Belichtung der Spitze ausgelöst wurde. Da die Wachstumszone von der Spitze einige Millimeter entfernt ist, forderten sie, dass von der Spitze ein Signal in die Wachstumszone ausgesendet wird. Der holländische Forscher Frits Went isolierte 1926 aus Sprossspitzen von Haferkeimlingen eine wachstumsfördernde Substanz, die er Auxin nannte, und die später als Indolessigsäure (IAA, engl. Indole acetic acid) identifiziert wurde. Neben IAA haben noch andere Substanzen wie z.B. Phenylessigsäure (Abb.19.8) Auxinwirkung oder Indolylbuttersäure (IBA), die eine um 2 C-Atome verlängerte Seitenkette hat. Die Synthese der IAA erfolgt nicht nur in jungen, oberirdischen Pflanzenorganen, sondern auch in der Wurzel. Unterschiedliche Biosynthesewege werden in verschiedenen Pflanzen genutzt, Abb. 19.7 zeigt drei dieser Wege.

Es gibt sehr viele, nicht natürliche Chemikalien, die Auxinwirkung haben. Das synthetische Auxin 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) (Abb. 19.8) wird als Herbizid verwendet. Seine Wirkung beruht nicht auf einer unmittelbaren Toxizität, sondern darauf, dass es sich um ein zu starkes Auxin handelt, das zu einer ungeordneten Morphogenese und einer erhöhten Synthese von Ethylen führt und dadurch eine verfrühte Seneszenz auslöst. Als „Agent Orange" wurde es im Vietnamkrieg zur Entlaubung der Wälder eingesetzt.

2,4-D ist ein selektives Herbizid, es wirkt sehr stark gegen Dikotyledonen. Hingegen sind Monokotyledonen unempfindlich, da diese das Herbizid durch Abbau unschädlich machen. Man verwendet daher 2,4-D, um Unkräuter in Getreidefeldern zu bekämpfen.
Auxin hat ein weites Wirkungsspektrum, es beeinflusst die Embryogenese, alle Typen der Organogenese (Blattinduktion, Seitenwurzelinduktion), Differenzierung von vaskulärem Gewebe, Spross- und Wurzelstreckenwachstum, Streckung des Hypokotyl-Hakens, apikale Dominanz, Fruchtbildung sowie Wachstumsantworten wie Phototropismus und Gravitropismus. Über viele Jahrzehnte war unklar, wie Auxin alle diese z.T. sehr unterschiedlichen Veränderungen in der Pflanze hervorrufen kann. Eine Schlüsselantwort liegt im speziellen polaren Transport des Auxins zwischen verschiedenen Zellen. Dieser führt zu lokalen oder asymmetrischen Akkumulationen des Auxins in Geweben und Zellen. Auxin wird vor allem in den Sprossspitzen und jungen Blättern gebildet und durch die Pflanze über das Phloem oder durch einen Carrier-gesteuerten Prozess von Zelle zu Zelle transportiert. Die transportaktiven Zellen liegen hauptsächlich um die Bündelscheiden, in der Epidermis und in Meristemen.
Durch einen Konzentrations- oder pH-Gradienten energetisierten lnflux-Carrier (AUXI) wird die protonierte Form der IAA (IAAH) in die Zellen transportiert und dort deprotoniert. IAA wird so in der Zelle gefangen. Der Efflux von IAA erfolgt über spezielle Carrier (PIN) und ABC-Transportproteine, die kooperativ wirken. Die PIN-Proteine sind meist polar, z.B. am unteren Ende der Zelle angeordnet, wodurch die Richtung des polaren Transports nach unten zustande kommt. Durch eine rasche und reversible Umlagerung z.B. zu einer seitlichen Zellmembran der Zelle kann es zu einer asymmetrischen Verteilung des Auxins kommen. Das ist z.B. bei Tropismen der Fall.
Auxin besitzt zwei wichtige und einen spezialisierten dritten Rezeptor SKP2A, der als einzige bisher bekannte Funktion hat, die Zellteilung zu aktivieren. Der erste isolierte Rezeptor ist das AUXIN-BINDING-PROTEINl (ABPl), der für schnelle Wirkungen zuständig ist. ABPl ist ein kleines Glykoprotein ohne erkennbare enzymatische Aktivität, das außen an der Plasmamembran an einen Rezeptor des Typs RLK bindet. Die Wirkung des Auxins in der Zelle beginnt im Experiment schon wenige Minuten nach IAA-Zugabe, so dass das Signal über die Membran übermittelt werden muss. Man beobachtet u.a. eine Hyperpolarisierung der Zelle und eine Erhöhung der Aktivität einer Phospholipase A, die vorübergehende Öffnung von Ca2+-Kanälen, die Phosphorylierung und Aktivierung der H+-ATPase und weitere Reaktionen (Abschn. 19.1). Die Aktivierung von H+-P-ATPasen (Abschn. 8.2) führt zu einer Ansäuerung der Zellwandregion und dadurch zur Lockerung der Zellwand. Nach 10 min beginnt die Elongation und nach 15-30 min erfolgt auch die Synthese von Proteinen und Xyloglucanen, so dass unterstützt durch Zellwandsynthese das Elongationswachstum beginnt.
Der zweite Auxin-Rezeptor ist TIRl (TRANSPORT-INSENSITIVE-RESPONSEl). TIRl bindet ein Auxinmolekül zusammen mit einem AUX/IAA-Transkriptionsfaktor (Abschn. 20.2) und katalysiert dabei den Transfer eines kleinen Proteins (Ubiquitin), an IAA-Proteine. Somit ist TIRl eine hormonaktivierte E3-Ligase-Untereinheit in einem Komplex mit weiteren Untereinheiten. Die AUX/IAA-Transkriptionsfaktoren hemmen durch ihre Bindung aktivierende Transkriptionsfaktoren (ARF). Nach der Ubiquitinylierung werden die AUX/IAA Transkriptionsfaktoren im Proteasom abgebaut Abschn. 21.4) woraufhin die ARF-Transkriptioosfaktoren nun die Expression von Auxin-induzierten Genen steuern. Erhöhte Auxinkonzentrationen führen zu stärkerer Derepression und zur vermehrten Bildung von Auxin-induzierten Proteinen. AUX/IAA-Transkriptionsfaktoren sind sehr labile Proteine eignen sich deshalb besonders gut als ,Sehalterproteine'. Sowohl TIRl- als auch AUX/IAA-und ARF-Gene kommen als Genfamilien in der Pflanze vor, so dass mit dieser Vielfalt auch das große Repertoir an Auxineffekten erklärbar ist. Eine noch zu lösende Frage ist die Koordination der beiden wichtigsten Auxin-Rezeptoren ABPl und TIRl.
In verschiedenen Geweben hat IAA recht unterschiedliche Wirkungen. So stimuliert IAA auch die Zellteilung im Kambium, fördert die apikale Dominanz durch Unterdrückung des Wachstums der Seitenknospen und steuert die Embryonalentwicklung. Dazu verhindert IAA die Bildung von Trennungsgewebe zum Abwerfen von Blättern oder Früchten und ist damit ein Gegenspieler zum Ethylen (Abschn. 19.7). Andererseits können erhöhte IAA-Konzentrationen die Synthese von Ethylen auslösen. Auxin regt zudem die Bildung von Früchten an. Normalerweise produzieren erst die reifenden Samen IAA. Von Auberginen wurden auf gentechnischem Wege Transformanten erzeugt, welche ein bakterielles Enzym der IAA-Synthese in den Samenanlagen exprimieren. Durch das so gebildete IAA beginnen die Auberginenfrüchte ihr Wachstum, ehe es zu einer Befruchtung und damit zu einer Samenbildung kommt. Als Ergebnis wurden kernlose Auberginen von normaler Konsistenz erhalten, die zudem viermal größer waren als üblich. Dieses Beispiel demonstriert in eindrucksvoller Weise die Bedeutung des Auxins für das Wachstum von Früchten und die Möglichkeiten einer gentechnischen Veränderung einer Gemüsepflanze.

Gibberelline regulieren das Längenwachstum von Stängeln
Die Entdeckung der Gibberelline geht auf eine Pflanzenkrankheit zurück. Der Befall von Reis durch den Pilz Gibberella fujikuroi führt zu einem extremen Längenwachstum; die so gebildeten „verrückten Reispflanzen" kippen um und tragen keine Früchte. Eiichi Kurozawa und Mitarbeiter isolierten in Japan 1926 aus diesem Pilz eine Substanz, welche dieses unnatürliche Wachstum auslöst. Sie wurde als Gibberellin bezeichnet. Erst nach dem zweiten Weltkrieg wurden diese Ergebnisse in der westlichen Welt bekannt. Strukturaufklärungen zeigten, dass Gibberellin ein Gemisch verschiedener ähnlicher Substanzen ist, die auch in Pflanzen vorkommen und dort als Phytohormone wirken.
Gibberelline leiten sich von dem Grundkörper ent-Gibberellan (Abb. 19.9) ab.

Man kennt inzwischen in Pflanzen mehr als 150 Gibberelline, die nach der Reihenfolge ihrer Identifizierung numeriert wurden. Bei vielen dieser Gibberelline handelt es sich um Zwischen- und Nebenprodukte der Biosynthese, nur einige zeigen bekannte Phytohormonwirkungen. Nur 4-5 Gibberelline haben eine physiologische Wirkung. Wichtigste Gibberelline sind GA1 (Abb. 19.10A) und GA4 (nicht gezeigt). Gibberelline leiten sich von den in Kapitel 17 behandelten Isoprenoiden ab. Die Synthese erfolgt in drei Kompartimenten. Im ersten Synthese-Abschnitt, der in den Plastiden abläuft, wird aus Geranylgeranylpyrophosphat ent-Kauren als Zwischenprodukt gebildet. Der zweite Abschnitt, katalysiert durch Cyt-P450-Monooxygenasen erfolgt am Endoplasmatischen Reticulum (Abschn. 18.2) und führt zu der Vorstufe GA12-Aldehyd. Der 3. Abschnitt der Synthese wird durch 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen (GA-Oxidasen) im Cytosol katalysiert. Eine unterschiedliche Expression der GA-Oxidasen in verschiedenen Geweben und Entwicklungsstadien führt dort zu einer differenzierten GA-Biosynthese. Ähnlich wie IAA stimulieren Gibberelline das Streckungswachstum, insbesondere in den Internodien. Ein markanter Gibberellin-Effekt ist das Auslösen des Schossens bei Rosettenpflanzen (z.B. Spinat oder Salat) zur Bildung von Blütenständen. Dazu haben Gibberelline eine Fülle weiterer Funktionen, wie die Anlage von Früchten und die Förderung von deren Wachstum. Gibberellin beendet die Samenruhe (Dormanz), wahrscheinlich durch die Aufweichung der Samenhülle. Auch die Auslösung der Samenkeimung durch die Expression von Genen für daran beteiligte Enzyme, zum Beispiel Amylasen, wird durch Gibberelline angestoßen.

Wirtschaftliche Bedeutung hat die Verwendung von Gibberellinen bei der Produktion von länglichen, kernlosen Weintrauben. In diesen Trauben bewirkt GA nicht nur eine Streckung der Zellen, sondern auch Parthenokarpie (Fruchtbildung als Folge von Jungfernzeugung). Gibberelline werden auch bei der Mälzung von Brauereigerste (Induktion der a-Amylase) verwendet. Allerdings ist dies nicht mit dem deutschen Reinheitsgebot der Bierherstellung vereinbar. Für die genannten Zwecke wird zumeist das von dem bereits erwähnten Pilz Gibberella fujikuroi produzierte GA3 verwendet. Hemmstoffe der Gibberellinsynthese werden als Retardantien (Wachstumsverzögerer) kommerziell genutzt. Eine Reihe von Substanzen, welche die Synthese der Gibberellinvorstufe ent-Kauren hemmen, wie Chlorethyltrimethylamrnoniumchlorid (Handelsname Cycocel, BASF) (Abb. 19.10B), wurden auf Getreidefeldern versprüht, um das Wachstum der Halme zu verringern. Dadurch wird die Standfestigkeit des Getreides und zugleich auch der Anteil der Körnersubstanz an der Gesamttrockensubstanz der Sprosse (Ernteindex) erhöht. Dieses Verfahren wurde inzwischen durch neue Züchtungen von Pflanzen, die weniger sensitiv auf Gibberellin reagieren und deswegen kürzer bleiben, ersetzt. Gibberellinsynthese-Hemmstoffe werden nur noch im Gartenbau verwendet, um Topfpflanzen klein zu halten.
Die Wirkung der Gibberelline liegt in einer Beeinflussung der Genexpression. An der Aufklärung der Signalkette der Gibberellin-Wirkung wird derzeit weltweit mit großer Intensität geforscht. Als GA-Rezeptor wurde ein lösliches Protein (GID1), das entfernte Ähnlichkeit zu einer Hormon-sensitiven Lipase hat, identifiziert. Arabidopsis besitzt 3 Gene für GIDl-Proteine. GA bindet an den Rezeptor und induziert die Interaktion mit negativ wirkenden, sogenannten DELLA-Transkriptionsfaktoren, die das Pflanzenwachstum unterdrücken. Der bei höherer GA-Konzentration gebildete Triple-Komplex GIDl-GA-DELLA bindet an die E3-Ligase SLY, so dass DELLAs nach Ubiquitinylierung durch SLY durch das 26S-Proteasom (Abschn. 23.4) hydrolysiert werden, wodurch die Repression der GA-Antwort aufgehoben wird. Über diese Aufhebung einer Beschränkung fördert GA das Streckenwachstum der Pflanze. An dem molekularen Wirkungsmechanismus der Gibberelline sind auch Transkriptionsfaktoren beteiligt, die sich als sehr bedeutsam für die Landwirtschaft erwiesen haben. Die große Ertragsteigerung beim Getreideanbau nach 1950 - man spricht hier oft von einer grünen Revolution - beruht zu einem erheblichen Teil darauf, dass es gelang, Weizensorten zu züchten, bei denen das Halmwachstum stark verkürzt ist. Dadurch gelangt ein höherer Anteil der gebildeten Biomasse in das Korn, der Ernte-Index ist somit erhöht. Es stellte sich später heraus, dass das verringerte Halmwachstum auf die Mutation von Genen zurückzuführen ist, welche Transkriptionsfaktoren der Gibberellin-Signalkette kodieren. In Weizen wurden die mutierten Gene mit RHT (reduced height) bezeichnet.

Cytokinine stimulieren die Zellteilung
Cytokinine sind prenylierte Derivate des Adenins. Bei dem Hauptvertreter Zeatin, ist die Aminogruppe des Adenins mit einem hydroxylierten Isoprenrest in trans-Stellung verknüpft (Abb. 19.11). Neben der Prenylierung des Adenins können z.B. Benzylderivate an die Aminogruppe, oder Zucker und Zuckerphosphate an den Adeninring gekoppelt sein. Cytokinine fördern das Pflanzenwachstum über eine Stimulierung der Zellteilung. Sie stimulieren z.B. das Austreiben von Seitenknospen und sind in dieser Hinsicht beim Brechen der apikalen Dominanz Gegenspieler des Auxins IAA. Außerdem verzögern sie die Seneszenz (Abschn. 19.7) und wirken so dem später behandelten Phytohormon Ethylen entgegen. Die Raupen mancher Schmetterlinge (z.B. die Buchen befallenden Stigmella) nutzen dieses Prinzip für ihre Ernährung. Sie sondern aus ihren Speicheldrüsen Cytokinin ab, wodurch in den von ihnen befallenen Blattteilen die Seneszenz verhindert wird. Es verbleiben so in vergilbenden Herbstblättern grüne Inseln von intaktem Blattgewebe, die den Raupen über die eigentliche Vegetationsperiode hinaus so viel Futter bieten, wie sie zum Verpuppen benötigen. Ausgewachsene, differenzierte Pflanzenzellen teilen sich in der Regel nicht mehr.

Durch den Zusatz von Cytokininen zusammen mit Auxin können diese ausdifferenzierten Zellen dazu stimuliert werden, sich wieder zu teilen. Gibt man ein Blattstück auf einen Nährboden, der - neben den erforderlichen Nährstoffen - Auxin und Cytokinin enthält, so werden einzelne Pflanzenzellen zu unkontrolliertem Wachstum stimuliert; es bildet sich so ein Kallus, der durch Teilung in Zellkultur vermehrt werden kann. Bei einem bestimmten relativ hohen Cytokinin/Auxin-Verhältnis kann aus einzelnen Zellen dieses Kallus ein neuer vollständiger Spross entstehen. In einem zweiten Schritt werden mit einem niedrigen Verhältnis (d.h. mit hohen Auxin-Konzentrationen) Wurzeln induziert, um eine komplette Pflanze zu regenerieren (siehe Abschn. 22.16). Viele Gehölze und Monokotyledonen z.B. Gräser sind aber noch immer schwierig zu regenerieren. Die Verwendung derartiger Zellkulturen für die Herstellung transgener Pflanzen wird in Abschnitt 22.3 beschrieben. Manche Bakterien und Pilze produzieren selbst Auxin und Cytokinin, um dadurch Pflanzenzellen zum Teilungswachstum anzuregen. Die durch Agrobacterium tumefaciens ausgelöste Bildung der Wurzelhalsgalle (siehe Abschn. 22.2) wird durch die Produktion von Cytokinin und Auxin stimuliert. Das Bakterium produziert diese Phytohormone nicht selbst, sondern überträgt die Gene für die Biosynthese von Cytokinin und Auxin vom Ti-Plasmid des Bakteriums in das pflanzliche Genom. Zeatin wird aus AMP und Dimethylallylpyrophosphat gebildet (Abb. 19.11). Durch die Cytokinin-Synthase, eine Prenyltransferase (siehe Abschn. 17.2), wird der Isoprenrest auf die Aminogruppe des AMP übertragen und anschließend hydroxyliert. Die Cytokininsynthese erfolgt vor allem im Meristemgewebe. Man hat transgene Tabakpflanzen erzeugt, in deren Blättern die Aktivität der Cytokinin-Synthase erhöht ist und die dadurch mehr Cytokinin synthetisieren. Diese Blätter haben eine viel längere Lebensdauer als normale Blätter, da durch das gebildete Cytokinin die Seneszenz unterdrückt wird.
Auch Cytokinin übt seine Wirkung hauptsächlich durch eine Beeinflussung der Genexpression über nur wenige Zwischenglieder aus. Cytokinin-Rezeptoren, ebenso wie die Rezeptoren für Ethylen, sind dimere Histidinkinasen. Sie sind in der Plasmamembran lokalisiert, wobei der Rezeptor für das Cytokinin zum extrazellulären Kompartiment gerichtet ist, und die Kinase zum Cytosol. Die Kinase-Domänen des Dimers enthalten zwei Histidin- und zwei Aspartyl-Reste. Die Bindung des Cytokinins an den Rezeptor bewirkt, dass an beiden Histidinkinasen die beiden Histidinreste reziprok phosphoryliert werden (Autophosphorylierung). Anschließend werden die beiden Phosphatgruppen auf Histidin- oder Aspartyl-Reste von Transmitter-Proteinen übertragen. Die Transmitter-Proteine gelangen in den Kern, wo sie Transkriptionsfaktoren phosphorylieren und so die Expression vieler Gene regulieren.

Abscisinsäure kontrolliert den Wasserhaushalt der Pflanze
Bei der Suche nach Substanzen, die das Abwerfen von Blättern und Früchten bewirken, wurde Abscisinsäure (ABA, Abb. 19.12) als ein auslösender Faktor nachgewiesen und entsprechend bezeichnet.

Später zeigte sich dann allerdings, dass die Bildung der Trennschicht für die Abstoßung von Blättern und Früchten weniger durch Abscisinsäure, sondern in erster Linie durch das im folgenden Abschnitt besprochene Ethylen ausgelöst wird. Eine wichtige Wirkung des Phytohormons Abscisinsäure ist die Auslösung der Dormanz ( endogene Ruhe) von Samen und Knospen. Dazu hat Abscisinsäure eine wichtige Funktion im Wasserhaushalt der Pflanzen, da es, wie in Abschnitt 8.2 beschrieben wurde, das Schließen der Spaltöffnungen bei Wassermangel auslöst. ABA ist auch wichtig für reifende Samen, um ein Auskeimen des Embryos vor der Samenreife (Viviparie) zu verhindern. Man hat bei Tomaten Mutanten gefunden, die einen ABA-Mangel aufweisen und wegen der daraus resultierenden Störung des Wasserhaushalts durch offene Stomata welke Blätter und Früchte tragen. In diesen so genannten wilty-Mutanten keimen die unreifen Samen bereits auf der Mutterpflanze in den Tomatenfrüchten.
ABA ist ein Derivat des Isoprenoidstoffwechsels. Die Synthese der Abscisinsäure verläuft auf zwei verschiedenen Wegen über die Oxidation des Violaxanthins, eines Xanthophylls (Abb. 19.12, siehe auch Abb. 17.13). Sie erfolgt in Blättern und auch in den Wurzeln, dort wo sich ein Wassermangel unmittelbar bemerkbar macht. Über den Transpirationsstrom durch die Xylemgefäße kann Abscisinsäure in die Blätter transportiert werden und löst dort ein Schließen der Spaltöffnungen aus. Als einziges Hormon neben Auxin ist für ABA ein spezifisches Transportprotein vom ABC-Typ identifiziert worden. Wenn es fehlt, können die Stomata nicht so schnell geschlossen werden, so dass sich daraus Wachstumsminderungen bei Stress ergeben. ABA bewirkt somit einen schnellen Stomaschluß durch Steuerung von Ionenkanälen und damit des Turgors.
Als Rezeptoren für ABA sind die Mitglieder einer Genfamilie identifiziert worden, die die cytosolischen PYR-Proteine (auch PYL, PCAR genannt) codieren. Ist die Hormonbindung an PYRl erfolgt, bindet der Rezeptor an die Proteinphosphatase PP2C und hemmt so die Aktivität der Proteinkinase SnRK2 (Abb. 19.13).

Wenn sie nicht gehemmt wird, phosphoryliert SnRK2 die AREB/ AFB-Proteine, eine ABA-spezifischen Transkriptionsfaktorengruppe. Sekundäre Botenstoffe, die im Zuge der Wirkung von ABA eingesetzt werden sind Calcium, H2O2 und NO. Die Abfolge oder Verknüpfung dieser sekundären Botenstoffe ist nicht vollständig geklärt. ABA bewirkt auch Änderungen des Stoffwechsels durch Beeinflussung der Genexpression, so dass Abhärtung bei Trockenheit und Kälte erfolgen kann.

Ethylen lässt Früchte reifen
Ethylen ist an der Auslösung der Seneszenz beteiligt, welche in Blättern einen Abbau der Blattsubstanz bewirkt. So werden beispielsweise Proteine zu Aminosäuren abgebaut und diese zusammen mit bestimmten Ionen, wie Mg2+, durch das Phloem zur Wiederverwertung abtransportiert. Bei mehrjährigen Pflanzen erfolgt die Lagerung im Stamm oder in den Wurzeln und bei einjährigen Pflanzen hauptsächlich in den Samen. Ethylen bewirkt auch die Abtrennung von Früchten, aber dies ist nur ein Teil seiner allgemeinen Wirkung auf die Fruchtreife. Der Einfluss des Ethylens lässt sich eindrucksvoll zeigen, wenn sich ein reifer Apfel und eine grüne Tomate zusammen in einer Plastiktüte befinden. Das durch den Apfel produzierte gasförmige Ethylen lässt die Tomate schneller reifen. Dieser reifungsfördernde Effekt wird zum Beispiel bei der Lagerung von Bananen ausgenützt: Bananen werden grün gepflückt und unter Bedingungen, die die endogene Ethylensynthese unterdrücken (tiefe Temperatur, CO2-Atmosphäre) rund um die halbe Welt transportiert. Sie werden erst kurz vor dem Verkauf durch Begasung mit Ethylen gereift. Auch Tomaten werden häufig entsprechend behandelt. Ethylen löst auch Abwehrreaktionen nach Pilzbefall oder Fraßschäden aus. Als ein Beispiel hierfür wurde in Abschnitt 18.4 die Wirkung von Ethylen bei der Induktion der Synthese von Tanninen nach Fraß von Akazienblättern durch Antilopen besprochen.
Ausgangssubstanz für die Synthese von Ethylen (Abb. 19.14) ist das in Kapitel 12 behandelte S-Adenosylmethionin (Abb. 12.10). Aktiviert durch die positive Ladung des Schwefelatoms, wird das Molekül gespalten, und es bildet sich ein Cyclopropan. Das Enzym, das diese Reaktion katalysiert, ist die Aminocyclopropan-Carboxylat-Synthase, abgekürzt ACC-Synthase. Es ist das geschwindigkeitsbestimmende Enzym dieses Biosyntheseweges.Seine Bedeutung wird dadurch illustriert, dass es im Arabidopsis-Genom acht Gene für dieses Enzym gibt. Die Enzymmenge und -stabilität (20 min - 2h Halbwertzeit) wird durch MAPK- und CDPK-Phosphorylierung (Abschnitt 19.1) reguliert. Durch eine ACC-Oxidase wird das Cyclopropan oxidativ zu Ethylen, CO2, Blausäure und Wasser gespalten. Die gebildete Blausäure wird sofort im Anschluss durch Weiterreaktion zu ß-Cyanoalanin (Reaktion nicht gezeigt) entgiftet.

Durch gentechnische Methoden ist es gelungen, die Ethylensynthese in etlichen Nutzarten und Arabidopsis gezielt zu unterdrücken. So wurden in Tomaten entweder durch Antisense-Technik (Abschn. 22.5) die Aktivitäten der ACC-Synthase und ACC-Oxidase vermindert, oder es wurde durch Einführung des bakteriellen Gens für die ACC-Desaminase, welches das gebildete ACC in Tomatenfrüchten zu α-Ketoglutarat und NH3 so schnell umwandelt, dass ACC nicht mehr zu Ethylen weiterreagieren kann. Bei einer derartigen Verminderung der Ethylenbildung reifen die Früchte am Stock, während bei geernteten Früchten die Reifung so verlangsamt ist, dass reife Tomaten über mehrere Tage transportiert werden können, ohne dass sie dabei verderben. Ziel dieser gentechnischen Veränderung sind Tomaten, die am Stock natürlich gereift sind und dabei ihren typischen Geschmack entwickeln können und nicht künstlich durch Ethylenbegasung nachgereift werden müssen. Es sei hier der Vollständigkeit halber erwähnt, dass auch transgene Tomatenpflanzen erzeugt wurden, bei denen die Haltbarkeit der reifen Früchte durch eine Antisense-Unterdrückung des zellwandauflösenden Enzyms Polygalacturonidase verlängert ist. Diese Früchte gab es in den USA unter einer speziellen Handelsmarke (Flav'r Sav'r, Calgene) zu kaufen. An diesem Beispiel wird deutlich, was technisch machbar ist, jedoch setzten sich diese transgenen Tomaten wegen geringer ausgeprägtem Aroma nicht am Markt durch. Alternativ wird ein neuer Ethylen-Inhibitor, das Methyl-Cyclo-Propen (MCP) eingesetzt. MCP ist in den geringen Dosen, in denen es verwendet wird, ungiftig. Es bindet sehr fest über Stunden an den Rezeptor und blockiert ihn so. Es kann erfolgreich für die Reifeverzögerung von Tomaten und Schnittblumen eingesetzt werden. Verlängerte Lagerung von Gemüse und Obst hat eine große wirtschaftliche Bedeutung.
Die Wirkung des Ethylens beruht auf einer Änderung der Genexpression. Da Ethylen in sehr geringen Konzentrationen (10-9 M) wirkt, muss der Ethylenrezeptor eine sehr hohe Affinität aufweisen. Der Ethylenrezeptor besteht aus einem Dimer von Proteinkinasen, die Histidin- und Aspartatreste phosphorylieren. Diese so genannten Histidinkinasen besitzen aber auch selbst einen Histidinrest. Ohne Ethylen phosphorylieren die beiden Histidinkinasen gegenseitig ihre Histidinreste. Durch die Bindung des Ethylens über einen Kupfer-Cofaktor an den Rezeptor wird diese Autophosphorylierung unterbunden. Die folgende Komponente (CTRl) ist eine Serin-Kinase, die das EIN2-Protein phosphoryliert, wodurch dieses inaktiv bleibt. Bei Ethylenbindung am Rezeptor wird von dem nicht phosphorylierten EIN2 ein N-terrninales Peptide durch Hydrolyse frei, das in den Kern wandert, wo es durch Bindung an die Transkriptionsfaktoren EIN3/EIL1 diese gegen proteolytischen Abbau stabilisiert und so die Ethylen-abhängige Genexpression stimuliert. Diese Schritte werden noch an mehreren Stellen durch Proteasom-abhängige Hydrolyse von Schlüsselproteinen fein reguliert. Insgesamt ist ähnlich wie beim Histidin-Rezeptor ein sehr schneller und direkter Weg zur Steuerung der Genexpression kennzeichnend. Die hydrolytische Abspaltung des N-terminalen Peptids von EIN2 und seine Funktion als eine Art "Botenstoff" ist bisher einzigartig.
In Abhängigkeit vom Phosphorylierungszustand des dimeren Ethylenrezeptors werden über eine MAPKKK-Kaskade (Abschn. 19.1), Transkriptionsfaktoren beeinflusst, die die Expression bestimmter Gene kontrollieren. Es sei in diesem Zusammenhang erwähnt, dass es Histidinkinasen in Pflanzen, Hefen und Bakterien, nicht aber in Tieren gibt.

Jasmonat ist nicht nur ein Duftstoff, sondern auch ein Hormon
Pflanzen, wie auch andere Organismen nutzen Membranen nicht nur zur Abtrennung von Kompartimenten, sondern die Fettsäuren der Phospholipide sind auch Vorstufen für die Biosynthese eines Pflanzenhormons. Über mehrere enzymatische Schritte wird aus Linolensäure die Jasmonsäure gebildet (Abschn. 15.7, Abb 15.30). Methyljasmonat und cis-Jasmon sind wichtige Komponenten des Blütendufts von Jasmin (Jasminum grandiflorum) und essentiell für die Parfümindustrie. 1971 wurde Jasmonsäure als Pflanzenwachstumsinhibitor aus dem Kulturfiltrat eines Pilzes isoliert. Beide Stereoisomere, (-)-Jasmonat und (+)-7-Isojasmonat als auch ihre methylierten Derivate sind biologisch aktive Substanzen, jedoch ist das (+)-Isomer relativ instabil, sodass (-)-Jasmonat vorherrscht und für Untersuchungen verwendet wurde. Die Effekte der Jasmonsäure sind vielfältig, sie inhibiert Saat- und Pollenkeimung, verhindert das Wurzelwachstum, reguliert die Akkumulation von Speicherproteinen, induziert Fruchtreifung und Pigmentbildung, spielt eine wichtige Rolle in der Resistenz gegenüber Insekten und anderen Pathogenen und bei Verwundung, und regelt die Genexpression vieler Gene über Aktivierung von Signalketten und Transkriptionsfaktoren.

Strigolactone sind eine neue Hormongruppe bei Pflanzen
Strigolactone sind aufgrund von ganz verschiedenen Eigenschaften isoliert worden. Die Bildung von Strigolactonen in der Wurzel führt zu einer besseren Besiedlung mit Mycorrhiza-Pilzen, so dass dann als sekundärer Effekt die Pflanze besser mit Phosphat versorgt wird. Außerdem führt die Abgabe der Strigolactone in den Boden dazu, dass sie von den winzigen Samen der parasitischen ohne Blattgrün lebende Striga-Pflanzen (heimische Spezies: Orobranche) wahrgenommen werden. Dies wirkt als Keimungsreiz und die Wurzeln dieser Parasiten finden so den Wirt und bohren dessen Xylem und Phloem an, um sich so auf dem Wirt anzusiedeln. Als Lockstoff wurde Strigolacton isoliert. Mit einem chemischen Analogon, GR34, kann man die Parasiten veranlassen zu keimen, ohne dass ein Wirt vorhanden ist. Unabhängig von diesen Befunden hat man erkannt, dass es ein Anti-Verzweigungs-Hormon geben muss, das aus der Wurzel nach oben steigt und das Austreiben von Seitentrieben hemmt. Dies Funktion wird auch durch Strigolacton vermittelt. Im Zuge der Aufklärung dieses Phänomens wurden Mutanten isoliert, die es ermöglichten, den Biosyntheseweg aufzuklären (Abb. 19.15) und ß-Carotin wurde als Vorstufe für die Synthese von Strigolactonen erkannt (Abschn. 17.6).


Brassinosteroide sind pflanzliche Steroidhormone und kontrollieren das Zellwachstum
Im Tierreich ist seit langem eine sehr große Anzahl von Steroidhormonen mit einer Vielfalt von Wirkungen bekannt. Erst später zeigte sich, dass Steroidhormone auch in Pflanzen vorkommen. Eine Klasse von Steroiden, die Brassinosteroide , haben in Pflanzen essenzielle Funktionen als Phytohormone. Der bekannteste Vertreter dieser Phytohonnonklasse ist Brassinolid (Abb. 19 .16), aber inzwischen sind in Pflanzen 40 weitere polyhydroxylierte Steroide identifiziert worden, von denen 2-3 als Hormone wirksam sind. Brassinosteroide werden über die Isoprenoidbiosynthese mit dem Membranlipid Campesterol (Abb. 15.3) als Zwischenprodukt synthetisiert.

Brassinosteroide wurden zuerst aus Pollen isoliert. Es war seit den 1930er Jahren bekannt, dass Pollen pflanzliche Wachstumsfaktoren enthalten. John Mitchell und Mitarbeiter vom US. Department of Agriculture isolierten 1979 aus 230 kg von Bienen gesammelten Raps-Pollen 10 mg einer Substanz, die sie als Brassinolid identifizierten. Mit Hilfe sehr empfindlicher Analysentechniken wurden später Brassinolid und andere Brassinosteroide in den meisten untersuchten Pflanzen nachgewiesen. Die Funktion der Brassinosteroide als essenzielle Phytohormone wurde durch das Studium von Mangelmutanten von Arabidopsis aufgeklärt. Diese Mutanten zeigten erkennbare Entwicklungsstörungen wie Zwergwuchs, reduzierte apikale Dominanz und verringerte Fertilität. Die Suche nach den entsprechenden defekten Genen ergab, dass derartige Mutationen Enzyme des Brassinolid-Syntheseweges - der sehr große Ähnlichkeit mit dem Syntheseweg tierischer Steroidhormone aufweist - betrafen. Diese Entwicklungsdefekte ließen sich nicht durch die Zugabe von "klassischen" Phytohormonen beheben, wohl aber durch eine Injektion einer nanomolaren Menge von Brassinolid, wie sie auch in Pflanzen enthalten ist. Diese Ergebnisse belegen eindeutig die essenzielle Funktion der Brassinosteroide für die Steuerung des Zellwachstums einer Pflanze.
Brassinosteroide kommen in allen Pflanzenorganen vor und regulieren die Pflanzenentwicklung auf vielfältige Weise: Sie stimulieren unter anderem das Sprosswachstum, den Gravitropismus, die Differenzierung des Xylems und hemmen Phloementwicklung und das Wurzelwachstum; auch hemmen sie die Anthocyanbildung. Interessant ist, dass Brassinolid eine positive Wirkung auf Wachstum unter abiotischem Stress, vor allem bei Trockenheit, hat. Brassinolid ist ein Hormon mit einem gut erforschten Rezeptor in der Plasmamembran, einer LRR-RLK (leucin-rich repeat receptor-like kinase) BRI1, die mit einer zweiten receptor-like kinase, BAKl, einen heterodimeren aktiven Rezeptor bildet. Hormonbindung führt zur gegenseitigen Phosphorylierung von BRIl und BAKl und zu weiteren Phosphorylierungen an einem hemmenden Protein BSK (analog wie in Abb. 19.1). Durch den Wegfall der Hemmung von BRIl kann über Phosphorylierungen weiterer Proteine (BIN2, BSU1) die Transkriptionsfaktoren BZRl und BZR2 phosphoryliert werden, die dann in den Kern wandern, um Brassinolid-abhängige Genexpression zu regulieren. Somit ist über eine Phosphorylierungskaskade der Weg vom Rezeptor zum Kern klar erkennbar. Da BIN2 mit ARF2 zusätzlich einen für Auxin- typischen Transkriptionsfaktor phosphoryliert, ergibt sich so eine Querverbindung zu den Auxinwirkungen, die als physiologische Reaktionen schon viel früher bekannt war (Abschn. 19.3) .

19.3 Peptide beeinflussen das Wachstum von Pflanzen
In Tieren werden interzelluläre Kommunikationen vor allem durch kleine biologisch aktive Substanzen, Steroidhormone und Peptide bewerkstelligt. Bekannte tierische Peptidhormone sind Insulin und Glucagon. Aber auch in Pflanzen mehren sich die Hinweise über das Vorkommen von sekretorischen und nicht-sekretorischen Peptiden, die in verschiedene Aspekte der Regulation des Pflanzenwachstums (Kallus-Wachstum, Meristem-Organisation, Wurzel-Wachstum, Regulation der Blattform, Knöllchenbildung, Selbst-Inkompatibilität und Abwehrmechanismen) involviert sind. Da noch ca. 500 Gene für Rezeptorkinasen mit unbekannten Signalsubstanzen als Liganden auf die Aufklärung ihrer Funktion warten, liegt der Verdacht nahe, dass viele Peptide unter diesen Liganden sein werden.

Systemin löst die Verteidigung gegen den Fraß von Herbivoren aus
Viele Pflanzen antworten auf den Angriff von Insekten als Fraßfeinde durch die Akkumulation von Proteinase-Inhibitoren, die den Verdau von Proteinen hemmen und dadurch toxisch für Insekten sind. In Tomatenpflanzen wurde gezeigt, dass das Polypeptid Systemin, bestehend aus 18 Aminosäuren, an diesen Abwehrreaktionen beteiligt ist. Als Antwort auf die Verletzung von Pflanzengewebe durch Insektenfraß wird ein 200 Aminosäure langes Systemin-Vorläufer-Protein im Phloem-Parenchym produziert, welches durch eine Endoprotease das aktive Peptid herstellt. Es ist unbekannt, wie es in das vaskuläre Gewebe gelangt, wird jedoch dort von einem Membranrezeptor mit sehr hoher Affinität erkannt, die Halbsättigung beträgt 10-10 M. Bei dem Rezeptor handelt es sich um die receptor-like kinase BAKl, die mit der receptorlike kinase BRIl als Heterodimer auch Brassenolid-Steroide bindet (Abb. 19.10). Die Bindung von Systemin löst eine Signalkette aus, die die Änderung der Ionenflüsse, eine Ca2+-und Calmodulin-Akkumulation, die Inaktivierung der H+-P-ATPase sowie die Aktivierung der MAPK und der Phospholipase A bewirkt (Abb. 19.4). Letztere katalysiert die Freisetzung der Linolensäure von Membranlipiden, als Ausgangsprodukt für die über mehrere Schritte erfolgende Synthese von Jasmonsäure (Abschn. 15.7. Jasmonsäure bewirkt die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren von Abwehr-Genen, darunter auch die für die Synthese von Proteinase-Inhibitoren, die den Insektendarm vergiften und so das Insektenwachstum stark eindämmen. Der Effekt von Systemin ist Spezies-spezifisch. Systemin aus Tomaten wirkt auch auf Paprika, hat aber keine Wirkung auf die eng verwandten Tabakpflanzen. Tabak produziert ein 18 Aminosäure langes Hydroxyprolinreiches Glycopeptid (aus einer Vorstufe von 165 Aminosäuren) mit analoger Wirkung.

Phytosulfokine regulieren die Zellproliferation
In den Medien von Zell-Suspensionskulturen wurde ein als Phytosulfokin (PSK) bezeichnetes Peptid isoliert, welches aus fünf Aminosäuren besteht und eine zellproliferierende Wirkung besitzen. Es enthält 2 Tyrosinreste, deren Hydroxylgruppen mit Sulfat verestert sind, die zur Namensgebung beitrugen.
PSKα: Tyr(S03H)-Ile-Tyr-(S03H)-Thr-Gln.
Das Arabidopsis-Genom enthält fünf Gene, die für ca. 80 Aminosäure lange Vorstufen-Proteine mit einem N-terminalen Sekretions-Signal kodieren. Phytosulfokine mit ähnlichen Strukturen kommen in sehr vielen Pflanzen und in vielen Pflanzenorganen und -geweben vor und modulieren u. a. die Adventiv-Knospenbildung, die Adventivwurzelbildung und Pollenreifung. Sie lösen wie Auxin und Cytokinin die Dedifferenzierung von Zellen aus. Da Pflanzenzellen die Fähigkeit zur Totipotenz bewahrt haben, können sie dadurch nach einer Phase als Kalluszellen zur Differenzierung zurückkehren, um alle Organe einer neuen Pflanze zu bilden. Als Rezeptor für die Phytosulfokine ist ebenso wie für die Brassinolid-Steroide und für Systemin eine receptor-like Proteinkinase (RLK) identifiziert worden .

Alkalisierung des Zellkulturmediums wird durch ein kleines Protein hervorgerufen
Während der Isolierung des Systemins stieß man auf ein Protein von 49 Aminosäuren (Vorstufen-Proteine 115 Aminosäuren), dass für eine starke Alkalsierung des Mediums sorgt (RALF, rapid alkalisation factor), aber dabei keine typischen Abwehrmechanismen auslöst. Applikation von RALF in nanomolaren Konzentrationen führt zu einer schnellen Aktivierung der MAPK, zu einem Stopp des Wurzelwachstums und einer geringen Vergrößerung der Meristemzellen. Man findet Homologe für RALF in vielen Pflanzenspezies. In Arabidopsis wurden neun verschiedene RALF-Gene identifiziert, die in unterschiedlichen Organen der Pflanzen exprimiert werden. Die weite Verbreitung der RALF-Peptide legt nahe, dass diese eine generelle Funktion in Pflanzen haben, die jedoch noch weitgehend unbekannt ist.

Kleine Cystein-reiche-Proteine regulieren die Selbstinkompatibilität
Selbstinkompatibilität ist ein Mechanismus, der sicherstellt, dass weder eigener Pollen noch der von nah verwandten Pflanzen die Pflanze erfolgreich befruchtet. Hierfür sind in unterschiedlichen Pflanzen unterschiedliche Mechanismen ausgeprägt. In Brassica-Spezies sind daran S-Locus-Proteine beteiligt, SL-Glykoproteine (SLG) und SL-Rezeptor-Kinasen (SRK) sowie kleine Proteine (SCR) von 74-81 Aminosäuren Länge. Charakteristisch für diese kleinen Proteine sind 4 Disulfidbrücken zwischen Cl und C8, C2 und C5, C3 und C6, und C4 und C7, die für die korrekte Strukturausbildung notwendig sind. Die Applikation von nur 50 x 10-12 mol des synthetischen oder rekombinanten SCR-Proteins pro Stigma führt zur Inhibition der Hydratation des Pollens. Es konnte auch gezeigt werden, dass SCR-Proteine mit der Rezeptorkinase SLK (einer typischen RLK) interagiert und dies zur Autophosphorilierung führt. Die nachfolgenden Elemente der Signalkaskade sind derzeit noch unbekannt.

19.4 Abwehrreaktionen werden durch das Zusammenspiel vieler Signalsubstanzen ausgelöst
Die hauptsächlichen Gruppen von Phytopathogenen sind Viren, Bakterien, Pilze und Fressfeinde wie beißende Insekten und andere Tiere und stechende Insekten und Nematoden. Das Wissen über die pflanzliche Pathogenabwehr ist in den vergangenen Jahren enorm angestiegen und viele Mechanismen wurden auf geklärt und sind ausgesprochen vielfältig. Jedoch verfügt jede Pflanzengruppe oder einzelne Pflanzenspezies jeweils (nur) über ein bestimmtes Repertoir von Abwehrmechanismen.
Man ordnet die Pathogene nicht nur nach deren Stellung im System der Lebewesen, sondern auch nach der Art ihrer Angriffs- und Lebensweise. Biotrophe Organismen benötigen lebendes Pflanzengewebe (z.B. Viren, viele Pilze, Nematoden). Nekrotrophe Pathogene befallen absterbendes Gewebe oder zerstören Zellen, um sich davon zu ernähren. Außerdem gibt es symbiontische Formen wie z.B. die in Wurzelzellen lebenden Mycorrhiza-Pilze, die den Wurzeln durch ihre Hyphen z.B. Phosphat verschaffen und ihrerseits Kohlenhydrate vom Wirt erhalten. Hier ist die Anpassung eine Symbiose zum Nutzen beider. Die Besiedlung der verschiedenen Organismen verläuft immer ähnlich: Rezeptoren dienen zur Erkennung, es erfolgt eine Modulation sekundärer Botenstoffe und Interaktion mit Pflanzenhormonen.
Die Grundstrategie der Pflanze ist es, ein Repertoire an Abwehrstoffen, den Phytoalexinen, die im Allgemeinen auch sekundäre Pflanzenstoffe sind, zu synthetisieren. Oft werden aber auch regelrechte Barrieren gebildet, z.B. Zellwandverstärkungen oder Nekrosen aus totem Gewebe, die aus dem programmierten Zelltod entstehen.
Am Anfang steht also die Erkennung der Eindringlinge an ihren typischen Merkmalen. Das Paradebeispiel ist das Flagellin, das ein Abbauprodukt des Proteins der Bakteriengeißel ist. Es dient der Pflanze als Erkennungssignal für Bakterien. Eine receptor-like Kinase (RLK) erkennt speziell das bakterielle Flagellin. Erkennung findet auch durch die ersten Abwehrreaktionen statt, die spezifische Moleküle produzieren wie z.B. Zellwandabbauprodukte der Pflanzenzellwand und der Bakterien- oder Pilz-Zellwand. Alle diese Moleküle, die zu Beginn des Befalls entstehen können, werden Elicitoren genannt und zumindest für viele gibt es Rezeptoren in der Pflanze. Die Rezeptoren können in der Plasmamembran lokalisiert sein oder kommen intrazellulär vor. Letztere sind wichtig, wenn von Pathogenen hergestellte Moleküle in die Zellen injiziert werden, wie es z.B. einige Nematoden oder Bakterien machen.
Nach Pathogenbefall (biotischem Stress), aber auch bei abiotischem Stress werden einige typische Stress-bezogene, sekundäre Botenstoffe hochreguliert, cytosolisches Calcium, reaktive Sauerstoff-Spezies (reactive oxygen species = ROS und das Stickstoffmonooxid NO. Durch eine Erhöhung der Ca2+-Konzentration im Cytosol der Zelle werden Ca2+-abhängige Proteinkinasen (Proteinkinasen-C) aktiviert, die ihrerseits eine Kaskade von Proteinkinasen aktivieren, durch die schließlich die Genexpression über die Modulation von Transkriptionsfaktoren beeinflusst wird. Weiterhin werden nach einem Pathogenbefall in einer sehr frühen Reaktion in der Plasmamembran lokalisierte NADPH-Oxidasen und verwandte Oxidasen (z.B. respiratory hurst Oxidasen, Rboh), was die Bildung von O2 (Superoxid-Radikal), HO• Radikal und H2O2 zur Folge hat. Die Bildung von ROS durch Lichtstress und deren Eliminierung wird in Abschnitt 3.8 ausführlich behandelt. Diese ROS sind zum einen chemische Waffe, um Pathogene direkt zu bekämpfen, zum anderen dienen sie als Botensubstanz, um Signalkaskaden zur Bildung von Abwehrsubstanzen auszulösen, vor allem H2O2 , das z.B. eine MAP-Kinase direkt aktiviert. Außerdem wird als frühe Reaktion auf einen Pathogenbefall Stickstoffmonooxid, NO gebildet. Die Bildung kann in der Pflanze durch mehrere Reaktionen erfolgen. Wichtig ist hier die Nitratreduktase (Abschn. 10.1), die aus ihrem Zwischenprodukt Nitrit in einer Nebenreaktion NO herstellt.
NO2- + NAD(P)H + H+ ➨ NO + H2O + NAD(P) + NO
Aus Nitrit kann NO in Mitochondrien und Plastiden durch die terminalen Enzyme der Elektronentransportketten dieser Organellen hergestellt werden. Zusätzlich gibt es einen oxidativen Weg der NO-Biosynthese, der noch nicht näher bekannt ist. Möglicherweise sind Polyamine die Vorstufe. Diese Synthesewege sind ganz anders als in Tieren, in denen die Synthese von NO durch Oxidation von Arginin durch O2, katalysiert durch die NO-Synthase erfolgt.
Arginin + O2 + NADPH + H+ ➨ Citrullin + NADP + NO
Diese Reaktion ähnelt der P450-Monooxigenase-Reaktion (Abschn. 18.2).
NO ist eine wichtige Botensubstanz für hormonale Antworten und an Abwehrreaktionen gegen biotischen und abiotischen Stress beteiligt. Es löst in Verbindung mit MAPK-Kaskaden Abwehrreaktionen, wie den programmierten Zelltod oder die Synthese von Phytoalexinen aus, und moduliert auch so verschiedene Entwicklungsprozesse wie z.B. den Eisen-Transport und induziert mit ABA die Stomaöffnung. NO ist eine wichtige Botensubstanz und steuert über cGMP und ADP-Ribose Ca2+-Kanäle zur Regulation der cytosolischen Ca2+- Konzentration.
Damit NO als Signalsubstanz wirken kann, muss seine Konzentration in der Zelle kontrolliert werden. Die Regulation der Synthese und des Abbaus ist noch in vielem unklar. An der Kontrolle der zellulären NO-Konzentration ist die Glutathionabhängige Formaldehyd-Dehydrogenase (FALDH) beteiligt, durch die NO reversibel an Glutathion gebunden wird. Die Eliminierung von NO kann durch Reaktion mit Wasser zu Nitrit und Oxidation zu Nitrat erfolgen.
Neben der Aktivierung von sekundären Botenstoffen nach Elicitorbindung an pflanzliche Rezeptoren, wird auch die Biosynthese von einigen Hormonen als Abwehrwaffe benützt, andere Hormone wirken der Abwehr entgegen. Jasmonsäure (JA) und Ethylen (ET) einerseits und Salizylsäure (SA) andererseits sind wichtige Signalmoleküle für die Abwehr von Pathogenen und Herbivoren. Die Biosynthese von Ethylen ist in Abschn. 19.7, die der Jasmonsäure in Abschnitt 15.7 und die der Salizylsäure inAbschn. 18.2 beschrieben.
Jasmonsäure und Salizylsäure und wahrscheinlich auch ihre methylierten Abkömmlinge (Methylsalizylat und Methyljasmonat) spielen eine wichtige Rolle in den Signalkaskaden bei Abwehrreaktionen der Pflanzen, z.B. bei der Bildung von [β-1,3-Glucanasen als Antwort auf Pilzinfektionen. Die Signaltransduktionswege, in denen Salizylsäure oder Jasmonsäure/Ethylen von der Pflanze eingesetzt werden, werden von unterschiedlichen Organismen ausgelöst, Salizylsäure tritt häufig nach Befall durch biotrophe Pathogene auf, während Jasmonsäure meist durch nekrotrophe Organismen induziert wird. Die Signalkaskaden an denen Salizylsäure und Jasmonsäure/Ethylen beteiligt sind, sind eng vernetzt und antagonistisch. Weiterhin wirkt Auxin Jasmonsäure unterstützend und Cytokinin und Gibberellin unterstützen die Salizylsäure in ihrer Wirkung.
Darüber hinaus regulieren all diese Hormone auch bereits genannte physiologische Prozesse andere Entwicklungsprozesse der Pflanze, wie Blütenund, Fruchtentwicklung, Photosynthese, Seneszenz, Wurzelwachstum und Pollenreifung. Arabidopsis-Mutanten, die unfähig zur Jasmonsäure-Synthese sind, können keine funktionellen Pollen bilden und sind deshalb männlichsteril.

19.5 Lichtsensoren steuern die Entwicklung von Pflanzen
Die Entwicklung der Pflanzen vom Keimling bis zur Blütenbildung wird vielfältig durch Licht gesteuert. So wird Keimung und Ergrünung durch Licht ausgelöst. Lichtsensor hierfür sind in erster Linie Phytochrome, welche rotes Licht absorbieren. Sie wurden 1959 entdeckt. Auch an der Anpassung des Photosyntheseapparates der Blätter an volles Sonnenlicht oder Schatten sind Phytochrome als Lichtsensoren beteiligt. In der besonders gut untersuchten Modellpflanze Arabidopsis thaliana (siehe Abschn. 20.1) wurden fünf verschiedene Phytochrome (A-E) nachgewiesen. Zur Anpassung an das gesamte Spektrum des Sonnenlichtes besitzen Pflanzen dazu Photorezeptoren für blaues und ultraviolettes Licht. Als Blaulicht-Sensoren wurden bislang drei Gruppen von Proteinen identifiziert: Cryptochrom l und 2, mit jeweils einem Flavin (Abb. 5.16) und einem Pterin (Abb. 10.3), Phototropin l und 2 mit zwei Flavinen als lichtabsorbierende Pigmente in der sogenannten LOV-Domäne und dem Blaulicht-Rezeptor ZTL (ZEITLUPE) mit einer LOV-Domäne. ZTL hat nur eine spezialisierte Funktion in der Blütenentwicklung. Der UVB- Rezeptor UVR8 ist erst vor kurzem gefunden worden und absorbiert die Photonen mit einem Tryptophanrest.

Phytochrome sind Rotlichtsensoren
Da Phytochrome und deren Wirkung in der Vergangenheit besonders intensiv untersucht wurden, bieten sie ein gutes Beispiel, um Probleme der Signaltransduktion ausführlicher zu besprechen. Phytochrome sind lösliche dimere Proteine, die wahrscheinlich zeitweise an eine Membran gebunden sind. Die Monomere bestehen aus einem Apoprotein (Molekularmasse 120-130 kD) mit 6 Domänen (Abb. 19.17A). Die ersten 3 Domänen machen den photosensorischen Teil des Proteins aus, die auch in bakteriellen und pilzlicben Phytocbromen vorkommen. Domäne 4, 5 und 6 machen den regulatoriscben Teil aus. Am N-Terminalen Ende des Apoproteins befindet sich in pflanzlichen Phytochromen noch ein Sequenzabschnitt, der die Pfr ➨ Pr Umwandlung beeinflusst. Die Domäne 6 beinhaltet eine Kinase, die ATP bindet und Phytochrom autophosphoryliert. Diese Phosphorylierung hat wahrscheinlich zwei Funktionen, sie ist bei der Umsetzung des Lichtsignals beteiligt und phosphoryliert einen Membran-Anker, der dann Phytochrom freisetzt, damit es in den Kern wandern kann. An die Domäne 2 ist an die Thioalkoholgruppe des Cysteinrestes ein offenkettiges Tetrapyrrol als Chromophor gebunden (Abb.19.17B).

Die autokatalytische Bindung des Tetrapyrrols an das Apoprotein führt zur Bildung eines Phytochroms Pr (r: rot), das ein Absorptionsmaximum bei circa 660 nm (hellrotes Licht) besitzt (Abb. 19.17). Die Absorption dieses Lichtes führt zu einer Veränderung des Chromophors: Eine Doppelbindung zwischen zwei Pyrrolringen klappt von der trans- in die cis-Konfiguration um (in Abbildung 19.17B rot markiert), und als Folge davon ändert sich auch die Konformation des Proteins. In dieser geänderten Konformation hat Phytochrom ein Absorptionsmaximum bei circa 730 nm (dunkelrotes Licht), man bezeichnet es daher in diesem Zustand mit Pfr (fr: far red). Pfr stellt die aktive Form des Phytochroms dar, es ist Signal für "Belichtung". Durch die Absorption des dunkelroten Lichtes wird Pfr wieder in Pr umgewandelt. Da sich die Lichtabsorption von Pr und Pfr überlappt (Abb. 19.17), stellt sich je nach Farbe des eingestrahlten Lichtes ein reversibles Gleichgewicht zwischen Pr und Pfr ein. So liegen bei einem Licht von 660 nm 88% des gesamten Phytochroms als Pfr vor und bei 720 nm nur 3 %. Da bei hellem Sonnenlicht die hellrote Komponente stärker ist als die dunkelrote, liegt Phytochrom dann vorwiegend als Pfr vor. Dies signalisiert der Pflanze "Belichtung". Während die inaktive Form des Phytocbrom (Pr) eine Lebensdauer von 100h hat, hat die aktive Form (Pfr) nur eine Halbwertzeit von 30-60 Min. Pfr kann reversibel zu Pr zurückgebildet werden (Abb. 19.18). Im Falle des Phytochrom A erfolgt jedoch in erster Linie ein Abbau des Pfr über eine irreversible Proteolyse, indem Ubiquitin, ein in allen eukaryontischen Zellen vorkommendes, hochkonserviertes kleines Protein (Molekularmasse 8,5 Da) unter Verbrauch von ATP an Phytochrom A gebunden wird und dieses dadurch zum proteolytischen Abbau markiert. Die Signalwirkung des Pfr A wird so beendet. Wie im Vorhergehenden besprochen, unterliegen die Phytochrome einer durch rotes und dunkelrotes Licht hervorgerufenen Photokonversion. Aktivierte Phytochrome werden vom Cytosol in den Kern transferiert. In der C-terminalen Domäne 5 (Abb. 19.17A) befindet sich ein Kernlokalisationssignal (NLS, nuclear localization signal), das für den Transport in den Kern verantwortlich ist. Die am C-terminalen Ende befindliche Proteinkinase (Domäne 6) bewirkt unter Lichteinfluss eine Autophosphorylierung an der endständigen Domäne des Phytochroms. Durch diese Phosphorylierung löst sich der Photorezeptor von einem cytosolischen Anker und die NLS-Domäne wird freigelegt. Dies ermöglicht, dass die Pfr-Form in den Kern wandern kann, um mit Transkriptionsfaktoren, wie den Phytochrom Interacting Faktoren (PIFs) und anderen Transkriptionsfaktoren, zu interagieren. Auf diese Weise steuern die aktivierten Phytochrome die Genexpression sehr direkt (Abb. 19.18).

Wie eingangs erwähnt, umfasst die Phytochrom-Genfamilie fünf Gene (A-E). Phytochrom A und Phytochrom B sind am besten untersucht und haben ein Absorptionsmaximum im roten Licht bei 650 nm. Phytochrom A ist Licht-labil, aber die Balance zwischen dem durch 650 nrn ausgelösten schnellen Abbau und der relativ höheren Stabilität in 720 nm bewirkt, dass im Dunkelrot bei 720 nm Phytochrom A per Saldo am stabilsten ist und somit auch die meisten aktiven Moleküle vorhanden sind. Auf diese Weise wirkt Phytochrom A physiologisch oft wie ein Rezeptor für dunkelrotes Licht, während Phytochrom B und die anderen Licht-stabilen Phytochrome (C-E) als Sensoren für Hellrot wirken. Phytochrom A bildet oft Homodimere, während die anderen zu Heterodimeren aggregieren.
Die Phytochrome steuern eine Fülle von Differenzierungen und das gesamte Wachstum der Pflanzen. Dies erfolgt in enger Verzahnung mit den Wirkungen der Phytohormone. Dieses Zusammenwirken von Licht und Hormonen (Auxin, Giberelline, Cytokinin, Ethylen) muss noch in vielen Einzelheiten erforscht werden. Grundsätzlich staucht Hellrot und Blau das Wachstum der Pflanzen, die dadurch aber stabiler sind. Dunkelrotes Licht ist ein wichtiges Signal für Pflanzen, da es durch die Beschattung mit grünen Blättern von Nachbarpflanzen entsteht, die das hellrote Licht mit dem Chlorophyll absorbieren . So bleibt dunkelrotes Licht "übrig" bzw. wird angereichert. Durch eine Vielfalt von Reaktionen reagiert die beschattete Pflanze z.B. mit Elongation, Ausbildung von dünnen Schattenblättern, frühem Blühen und mehr, was zusammen das Syndrom der Schatten-Vermeidung genannt wird. Die Schatten-Vermeidung wird durch aktives Phytochrom B gehemmt, das aber durch Dunkelrot inaktiviert wird und so im inaktiven Zustand die Schatten-Vermeidung fördert. Fehlt in Mutanten Phytochrom B ganz, entwickelt sich diese Pflanze mit einem Phänotyp, der an den von vergeilten Pflanzen erinnert. In Experimenten in Dunkelrot bewirkt Phytochrom A Stauchung des nur im Dunkeln gewachsenen Keimling-Hypokptyls, Anthocyan-Bildung, Stimulierung der Blüte im Langtag oder in Langtag-Pflanzen. Diese Reaktionen haben ihr Wirkungsspektrum in einem Dunkelrotgifel (720 nm).
Phytochrom B steuert Reaktionen, die sich mit denen von Phytochrom A überlappen. Sein Absorptionsspektrum hat einen Gipfel in Hellrot (660 nm). Es bewirkt ebenfalls Hypokotylstauchung und Anthocyanbildung, und hemmt die Blütenbildung, speziell bei Kurztagpflanzen, was experimentell als Nachtunterbrechung durch rotes Licht gezeigt werden kann. Weitere Funktionen von Phytochrom A und B sind: Deetiolierung d.h. die Reaktionen beim Übergang vom Wachstum im Dunkeln zum Licht (Hypokotyl-Stauchung, Haken-Öffnung, Wurzelwachstums-Hemmung), Photoperiodik (Wahrnehmung der Länge der Tage im Jahr), Keimungsförderung, Hemmung der Internodien-Spross-Streckung. Die Licht-Instabilität von Phytochrom A bewirkt die verstärkte Wirkung von Phytochrom A in dunkelrotem Licht. Die restlichen Phytochrome (Phytochrom C, D, E) sind funktionell weniger bedeutend, aber auch weniger erforscht, und in der Funktion Phytochrom B ähnlich.

Cryptochrome und Phototropin sind Blaulicht-Sensoren
Blaues Licht aktiviert nur Phytochrom A schwach, so dass Blaulicht-Rezeptoren für eine Pflanze, die Photonen als Engergiequelle interpretieren muss, als Indikator für „Belichtung" ebenso wichtig sind wie Rotlicht-Rezeptoren. Zur effizienten Nutzung der blauen Lichtanteile (320- 500 nm) sind Cryptochrome und Phototropin befähigt. Die Identifizierung des Cryptochroml-Gens gelang 1993 durch Untersuchung einer sogenannten Knockout-Pflanze, die im Blaulicht nicht in der Elongation gehemmt wurde. Da dies vor der Isolierung des Blaulichtrezeptors aus Wirbeltieren gelang, werden diese wie z.B. die tierischen Rezeptoren der Hypophyse auch Cryptochrome genannt. Die menschlichen Cryptochrome sind für die Wahrnehmung der Photoperiode zuständig, die bei Jetlag mit diesem Sensor erneut auf "Null" gesetzt werden müssen. Die Isolierung von Phototropin gelang erstmalig 1997 aus Blaulicht bestrahlten Erbsen-Kotyledonen. Phototropine sind ubiquitär in höheren Pflanzen zu finden. Blaulicht induziert durch Phototropine die Stoma-Öffnung, Hypokotyl-Verlängerung und Chloroplasten-Bewegung. Bei niedrigen Blaulicht-Intensitäten wandern Chloroplasten zur Zelloberseite, um die Lichtsammlung zu optimieren, bei höheren Lichtintensitäten wandern sie von der Lichtquelle weg, um Zerstörung durch Licht zu mindern, was zusammen großen Einfluss auf den Ertrag der Phytosynthese hat. Die Struktur der Phototropine hat eine gewisse Ähnlichkeit mit denen der Phytochrome, es gibt ein photosensorisches N-terminales Ende, das den Co-Faktor Flavinmononukleotid (FMN) trägt und für die Blaulichtrezeption verantwortlich ist, sowie eine Serin/Threoninkinase am C-Terminus, die die Autophosphorylierung katalysiert. In Dunkelheit ist FMN nicht kovalent gebunden (Abb. 19.19), nach Bestrahlung mit Licht wird FMN in kürzester Zeit (Microsekunden) über einen Cysteinrest an die Domänen des Proteins kovalent gebunden und verändert das Absorptionsmaximum auf 390 nm.

Gleichzeitig sorgt die C-terminale Kinase für die Autophosphorylierung von insgesamt 8 Serinresten im photosensorischen Teil und überführt damit das Phototropin in einen aktiven Zustand. In Dunkelheit wird der Co-Faktor FMN wieder freigegeben und Phototropin kehrt innerhalb von 10-100 Sekunden in den Grundzustand zurück. Bei der Umkehrung dieses Prozesses wirkt wahrscheinlich eine Phosphatase bei der Dephosphorylierung mit, die aber derzeit noch nicht isoliert wurde. Phototropin wandert nicht in den Kern, sondern wirkt über sekundäre Botenstoffe wie cytosolisches Calcium und auf das Cytoskelett.
Cryptochrome, die auch Blaulicht absorbieren, sind strukturell nicht mit den Phototropinen verwandt, sondern mit mikrobiellen DNA-Reparaturenzymen, sogenannten Photolyasen. Es sind Flavoproteine, die viele Prozesse in der Pflanze beeinflussen, z.B. Inhibition der Hypokotylverlängerung, Anthocyan-Akkumulation, Regulation des Blühzeitpunktes und Stängel-Elongation. Nach Belichtung phosphoryliert Cryptochrom sich über einen reduktiven Mechanismus mit einem als Cofaktor gebundenen ATP und dimerisiert. Cryptochrom wandert ähnlich wie Phytochrom in den Kern und bindet den Transkriptionsfaktor SPAl, was die Stabilität des zentralen Transkriptionsfaktors HY5 für lichtabhängige Genexpression gegen Proteolyse durch das 26S-Proteasom bewahrt. Cryptochrom wirkt also sehr direkt ohne sekundäre Botenstoffe auf zentrale Transkriptionsfaktoren. Die Frage, warum Pflanzen zwei Blaulichtrezeptoren besitzen, ist nicht in Gänze geklärt, es ist aber eine klare Aufgabenverteilung zu erkennen.

Phototropine sind für den Phototropismus zuständig, aber auch für die Regelung der Chloroplasten-Position in den Blattzellen. Das hat große Bedeutung für die Produktivität der Photo- synthese. Cryptochrom hemmt das Längenwachstum und fördert Farbpigment- Synthesen (Anthocyan, Chlorophyll, Carotinoide), was ein gesundes und stabiles Wachstum bedeutet. Cryptochrom wie Phytochrom tragen zur Messung der Photoperiodik bei.nach oben zum Kapitelanfang

20 Eine Pflanzenzelle besitzt drei verschiedene Genome
Pflanzenzellen enthalten drei Genome: je ein Genom im Zellkern, in den Mitochondrien und in den Plastiden. Die Größe der Genome wird in Basenpaaren (bp) angegeben. In Tabelle 20.1 sind die Größe der drei Genome in drei Pflanzenspezies und im Vergleich dazu die der zwei Genome des Menschen aufgeführt.

Aus den Plastiden der Landpflanzen und der meisten Algengruppen (Chlorophyta, Rhodophyta, Phaeophyta, Bacillariophyceae) lassen sich zirkuläre DNA-Moleküle, die das ganze Plastom umfassen, isolieren, während die DNA der Dinoflagellaten in der Regel subgenomische Zirkel (Minizirkel) sind. Für Pflanzen und Algen gilt aber auch, dass ein großer Teil der Plastiden-DNA als lineare Moleküle - mit mehr als einer Genomgröße - existieren kann, sodass eine Mischung aus zirkulären Molekülen mit einer Genomgröße und lineare Molekülen unterschiedlichen Komplexitätsgrades vorkommen. Für die Mitochondrien der Pflanzen scheinen dagegen zirkuläre Moleküle einer Genomgröße selten zu sein und lineare Moleküle unterschiedlichen Komplexitätsgrades eher zu überwiegen. Somit kommen in Plastiden und Mitochondrien häufig mehrere Kopien von Genen vor. Diese Kopien werden bei der Vermehrung der Organellen durch Teilung auf die Tochterorganellen statistisch verteilt. Die Plastiden und Mitochondrien, die in einer Zelle in jeweils größerer Anzahl vertreten sind, werden bei der Zellteilung wiederum statistisch auf die beiden Tochterzellen verteilt. Auf diese Weise wird in einem zumeist mütterlichen Erbgang die genetische Information der Mitochondrien und Plastiden durch die Weitergabe einer sehr großen Anzahl von Genkopien von Generation zu Generation vererbt. Die große Anzahl der vererbten Genkopien bietet auch bei dem asexuellen Erbgang einen Schutz vor Mutationen. Der Aufbau der Plastiden- und Mitochondriengenome wird in den Abschnitten 20.6 und 20.7 näher behandelt.

20.1 Im Kern sind die Gene auf mehrere Chromosomen verteilt
Im Kern ist die genetische Information auf mehrere DNA-Doppelstränge, den Chromosomen, verteilt. In der Regel enthalten Zellen während des größten Teils ihres Entwicklungscyclus zwei Chromosomensätze, sie sind diploid. Ein Satz stammt von der Mutter und einer vom Vater. Nur die generativen Zellen (Ei, Pollen) besitzen lediglich einen Chromosomensatz, sie sind haploid. Während der Interphase der Mitose wird die DNA des Genoms repliziert. Der dadurch erzeugte vierfache Chromosomensatz wird während der Anaphase durch den Spindelapparat auf zwei entgegengesetzte Pole der Zelle verteilt. Dadurch erhalten die aus der Abschnürung der Mutterzelle resultierenden beiden Tochterzellen jeweils einen doppelten Chromosomensatz, sie sind damit wieder diploid. Durch Colchizin, ein Alkaloid der Herbstzeitlosen, wird über die Hemmung des Spindelapparats die Aufteilung der Chromosomen während der Anaphase gestört. Es können so alle Chromosomen der Mutterzelle in nur eine Tochterzelle gelangen; diese besitzt dann vier Chromosomensätze, sie ist tetraploid. Diese Tetraploidie kann in seltenen Fällen auch spontan durch einen Fehler der Mitose auftreten. Tetraploidie ist oft stabil und wird dann über somatische Zellen auf nachfolgende Generationen vererbt. Durch Kreuzungen von tetraploiden mit diploiden Pflanzen können in seltenen Fällen auch hexaploide Pflanzen erzeugt werden. Tetraploide und hexaploide (polyploide) Pflanzen zeigen oft ein besseres Wachstum; viele Kulturpflanzen sind aus diesem Grund polyploid. Polyploide Pflanzen können auch durch Protoplastenfusion erzeugt werden. Mit dieser Methode lassen sich Hybride zwischen zwei verschiedenen Züchtungslinien herstellen. Bei Kreuzungen sehr verschiedener Spezies sind durch die Unterschiede der Chromosomen diploide Hybride oft steril.
Dagegen sind polyploide Hybride in der Regel fertil. Die Chromosomenausstattung verschiedener Pflanzen ist in Tabelle 20.2 aufgelistet. Der Kreuzblütler Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) (Abb.20.1), ein an Straßenrändern wachsendes, unscheinbares Unkraut, hat lediglich 2-5 Chromosomen mit insgesamt nur 12,5•107 Basenpaaren (Tab. 20.1 ). Diese Pflanze entspricht in allen ihren Eigenschaften und in ihrer Ausstattung einer typischen dikotylen Pflanze und hat bei einer Anzucht in der Klimakammer einen Lebenscyclus von nur 6 Wochen. Arabidopsis thaliana wurde durch den Frankfurter Botaniker Friedrich Laibach 1943 in Reinkultur gezüchtet und ist seitdem weltweit die bestuntersuchte Modellpflanze, mit der verschiedenste pflanzliche Funktionen aufgeklärt wurden. Das Genom von Arabidopsis thaliana ist vollständig sequenziert.

Die größeren Chromosomenzahlen anderer Pflanzen lassen sich teilweise auf eine Genomkombination zurückführen. So ist Raps (Brassica napus) mit 2•9 Chromosomen eine Kreuzung von Brassica rapa (Rübsen) (2•10 Chromosomen) und Brassica oleracea (Gemüsekohl) mit 2•9 Chromosomen (Tabelle 20.2). In diesem Fall entspricht das Ergebnis der Kreuzung einem diploiden Genom. Hingegen hat beim Weizen eine aufeinanderfolgende Kreuzung dreier Wildformen zur Hexaploidie geführt: Aus dem wilden Einkorn und dem Spelzweizen jeweils 2•7 Chromosomen entstand der wilde Emmer (4•7 Chromosomen) und durch Kreuzung mit einem weiteren Wildweizen der heute angebaute Weizen (Triticum aestivum ) mit 6•7 Chromosomen. Auch der Tabak (Nicotiana tabacum) ist eine Kreuzung zweier Spezies (Nicotiana tomentosiformis und N. sylvestris) mit jeweils 2•12 Chromosomen.
Das Kerngenom der Ackerbohne enthält 14,5•109 Basenpaare und hat damit gegenüber Arabidopsis einen 200fach höheren DNA-Gehalt. Dies bedeutet aber keineswegs, dass im Ackerbohnengenom die Anzahl der proteincodierenden Gene (Strukturgene) 200fach höher ist als in Arabidopsis. Man kann davon ausgehen, dass die Zahl der Strukturgene in beiden Pflanzen sich um nicht mehr als einen Faktor von zwei bis drei unterscheidet. Die Differenz in der Genomgröße beruht vielmehr auf einer unterschiedlichen Anzahl aneinandergereihter gleicher DNA-Sequenzen von sehr variierender Größe, so genannter repetitiver DNA, die codierende oder nichtcodierende Funktion besitzen. Ein großer Teil der repetitiven Sequenzen bestehen aus Transposons, insbesondere Retrotransposons. Beispielsweise sind im Genom der Ackerbohne 85% der DNA repetitive Sequenzen. Dazu gehören auch die tandem repeats. Es handelt sich dabei um eine sehr große Zahl (manchmal Tausende) identischer, sich wiederholender DNA-Sequenzen (von einer Länge von 170-180 bp, mitunter auch von etwa 350 bp) die über das ganze Chromosom verstreut angeordnet sind - insbesondere am Anfang und am Ende, aber auch als Blöcke innerhalb der Chromosomen. Man bezeichnet diese hochrepetitive DNA auch als Satelliten-DNA. Dazu zählt auch die in Abschnitt 20.3 besprochene Mikrosatelliten-DNA. Ihre Sequenz ist gattungs oder sogar artspezifisch. In manchen Pflanzen bestehen mehr als 15% des gesamten Kerngenoms aus Satelliten-DNA. Möglicherweise spielt sie eine Rolle bei der Abgrenzung der Arten. Dje Sequenz der Satelliten-DNA wird als artspezifischen Marker genutzt, um bei der Erzeugung von Hybriden durch Protoplastenfusion den Erfolg schon in der Zellkultur zu kontrollieren.
Als repetitive Sequenzen treten auch die Gene für ribosomale RNAs auf. Diese und auch die Gene für einige Transfer-RNAs sind in mehreren tausend Kopien vorhanden.
Hingegen kommen Strukturgene in wesentlich weniger oder sogar oft nur in einer einzigen Kopie (single copy gene) vor. Strukturgene mit hoher Nukleotid- oder Aminosäure-Identität, die für strukturell und funktionell sehr ähnliche Proteine codieren, werden häufig zu einer Genfamilie zusammengefasst. Eine Genfamilie bildet zum Beispiel die im Tomaten-Genom fünfmal vorkommenden Gene für die kleine Untereinheit der Ribulosebisphosphat-Carboxylase und die 14 Mitglieder der Genfamilie des Lichtsammelkomplexes LHC (Abschn. 2.4). Das in Maiskörnern vorhandene Zein (Kap. 14) wird durch eine etwa hundert Gene umfassende Genfamilie codiert. In Arabidopsis gehören fast 40% der aus den Genomsequenzen vorausgesagten Proteine Genfamilien mit mehr als 5 Mitgliedern an.

Von einer dikotylen und einer monokotylen Pflanze ist die DNA-Sequenz des Kerngenoms bekannt
Im Jahre 2000 ist es gelungen, das Genom von Arabidopsis thaliana vollständig zu sequenzieren. Aus den Sequenzdaten wurde ermittelt, dass das Kerngenom etwa 25.000 Strukturgene enthält. Damit verfügt Arabidopsis über fast doppelt soviel Gene wie die Fruchtfliege Drosophila.
Ein Vergleich mit bekannten DNA Sequenzen aus tierischen Organismen zeigt, dass etwa ein Drittel der Arabidopsis-Gene pflanzenspezifisch sind. Von einem sehr großen Teil der Gene ist die Funktion bislang unbekannt. Auch ist inzwischen das Reis-Genom sequenziert worden. Jedoch sind auch beim Reis sehr viele der schätzungsweise 50.000 Strukturgene noch nicht bekannt
. Die große Herausforderung liegt jetzt darin, die Funktionen der genomischen DNA-Sequenz-Gene in Arabidopsis thaliana und Reis zu ermitteln. Die geschieht zum einen durch bioinformatische Untersuchungen, indem Ähnlichkeiten der Sequenzdaten einzelner Gene mit in Datenbanken vorhandenen Sequenzen bekannter Proteine aller Organismen gesucht werden. Ein anderer Ansatz besteht darin, die Folgen der Ausschaltung bestimmter Gene für Wachstum, Stressanfälligkeit oder Stoffwechsel zu untersuchen. Die Ausschaltung der Gene kann durch Zufallsmutationen, z.B. durch Ti-Plasmide (Abschn. 22.5) erfolgen (T-DNA-Insertionsmutanten), wobei dann zunächst das mutierte Gen ermittelt werden muss. Gezieltes Ausschalten eines definierten Gens durch RNAi-Technik ist eine häufig angewendete Methode (Abschn. 22.5). Alle diese Untersuchungen erfordern eine automatisierte Auswertung und sind daher technisch sehr aufwendig.

20.2 Die DNA des Kerngenoms wird durch drei spezialisierte RNA-Polymerasen transkribiert
Bei der Transkription der DNA erfolgt die Synthese von RNA nur an einem der beiden DNA-Doppelstränge, dem Matrizenstrang (Abb. 20.2).

Der dem Matrizenstrang komplementäre DNA-Strang wird als codierender Strang bezeichnet. Er hat die gleiche Sequenz wie die neu synthetisierte RNA, mit der Ausnahme, dass er Thymin anstatt Uracil enthält. Die DNA des Kerngenoms wird durch drei spezialisierte RNA-Polymerasen (I, II, III) transkribiert (Tab. 20.3).

Pflanzen besitzen zusätzlich noch die RNA-Polymerasen IV und V, die evolutionär gesehen sich aus der RNA-Polymerase II ableiten. Diese RNA-Polymerasen sind an der Transkription nicht-codierender RNA beteiligt und insbesondere an der RNAi-vermittelten Gen-Silencing (Methylierung von DNA). Die Aufgabenverteilung zwischen den drei RNA-Polymerasen, wie auch viele Details der Genstruktur und Prinzipien der Genregulation gelten für alle eukaryontischen Zellen. Die RNA-Polymerase II, welche die Transkription der Strukturgene bewirkt, wird durch α-Amanitin in einer Konzentration von nur 10-8 mol/L stark gehemmt. α-Amanitin ist ein tödliches Gift des Knollenblätterpilzes, an dem immer noch jedes Jahr Pilzsammler sterben.

Die Transkription von Strukturgenen ist reguliert
In einer Pflanze sind von der sehr großen Anzahl der vorhandenen Strukturgene die meisten dieser Gene abgeschaltet und werden nur in ganz bestimmten Organen und dort oft auch nur in bestimmten Zellen aktiviert. Außerdem werden viele Gene nur zu einem bestimmten Zeitpunkt eingeschaltet, wie zum Beispiel die Gene für die Bildung von Phytoalexinen nach Pathogenbefall (Kapitel 16). Daher unterliegt die Transkription der meisten Strukturgene einer sehr komplexen und spezifischen Regulation. Die Gene für die Enzyme von Stoffwechselreaktionen, die in allen Zellen ablaufen, wie der Energiestoffwechsel oder die Proteinbiosynthese, werden häufiger transkribiert. Man bezeichnet Gene für Grundfunktionen, die alle Zellen unabhängig von ihrer Spezialisierung brauchen, auch als Haushaltsgene (housekeeping genes).

Einem Gen sind Nukleotidsequenzen mit Promotor- und Regulatorfunktion vorgeschaltet
Der Aufbau eines typischen Strukturgens ist in Abbildung 20.3 schematisch gezeigt. Die DNA auf der linken Seite vom Transkriptionsstartpunkt wird als 5'-stromaufwärts und nach rechts 3'-stromabwärts bezeichnet. Der codierende Bereich des Gens ist zumeist auf mehrere Exons verteilt, die durch Introns unterbrochen werden.

DNA-Sequenzen, die die Transkription beeinflussen, werden in drei wesentliche Bereiche unterteilt. Der Kernpromotor befindet sich stromaufwärts und stromabwärts um den Transkriptionsstartpunkt und beinhaltet verschiedene konservierte Sequenzen wie das "Downstream Promoter Element", das "Motif Ten Element", das Initiatorelement und die Transktiptionsfaktor-Bindestellen (BRE und TATA-Box). Als regulatorisch wirksame DNA-Sequenzen (auch cis-Elemente) fungieren der regulatorische Promotorteil, der 200-300 Nukleotide vor dem Transkriptionsstartpunkt lokalisiert ist, und die Enhancer Regionen, die mehrere tausend Nukleotide stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt liegen können.

Transkriptionsfaktoren regulieren die Ablesung eines Gens
Die Regulationselemente sind Bindungsort von Transkriptionsfaktoren (trans-Regulationselemente). Dies sind Proteine, die die Transkription beeinflussen. Bei sehr unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren finden sich häufig wiederkehrende Strukturen. So enthalten viele Transkriptionsfaktoren Peptidketten, die zwei Cysteinreste, und davon weitere 12 Aminosäuren entfernt, zwei Histidinreste enthalten (Abb. 20.4). Durch die kovalente Bindung der beiden Cysteinreste mit einem Zinkatom und dessen koordinativer Bindung an die beiden Imidazolringe des Histidins entsteht ein Zinkfinger. Ein solcher Finger bindet drei Basen einer DNA-Sequenz. Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren enthalten in der Regel mehrere (bis zu neun) Finger und können sich so an bestimmten DNA-Sequenzen "festkrallen".

Eine andere Sorte von Transkriptionsfaktoren besteht aus einem Dimer aus DNA-Bindeproteinen, die jeweils eine DNA-Bindungsdomäne und eine α-Helix mit drei bis neun Leucinresten besitzen (Abb. 20.5). Die Leucinreste der beiden α-Helices sind so im Dimer angeordnet, dass sie sich genau gegenüberstehen und die stark hydrophoben Leucinreste miteinander wechselwirken. Wie ein Reißverschluss (engl. zipper) halten so die Leucinreste die beiden Monomere zusammen. Man bezeichnet daher diese Struktur als Leucin-Zipper.


Kleine (sm) RNAs hemmen die Genexpression durch Inaktivierung von mRNAs
smRNAs, bestehend aus 21-24 Nukleotiden, regulieren die Genexpression verschiedener Proteine, die bei Entwicklungsprozessen abiotischer Stressbewältigung und Nahrungsmangel beteiligt sind. Sie werden mit Hilfe eines RNAse III-ähnlichen Enzyms (DICER) aus doppelsträngigen RNA-Vorläufermolekülen (dsRNA) herausgeschnitten und dann mit so genannten ARGONAUTE-Proteinen zu dem RISC-Komplex zusammengebaut. Die verschiedenen sm-RNA-Typen (miRNA, siRNA) binden an komplementäre Sequenzen der Ziel-mRNAs und spalten entweder die mRNAs oder hemmen deren Translation. Die dsRNA ist das Schlüsselintermediat dieses Prozesses und wird bei der RNAi-(RNA-Interferenz)-Technik eingesetzt, um Genfunktionen zu drosseln bzw. ausschalten zu können. Für grundlegende Arbeiten zur RNAi-Technik wurden Andy Fire und Craig Mello 2006 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet.

Die Transkription von Strukturgenen erfordert einen komplexen Transkriptionsapparat
Die RNA-Polymerase II besteht aus 8 bis 14 Untereinheiten. Sie ist allein nicht in der Lage, die Transkription zu beginnen. Es sind Transkriptionsfaktoren erforderlich, um das Enzym an die Startposition des Gens zu dirigieren. Eine zentrale Rolle spielt dabei das TATA-bindende Protein, das die TATA-Box erkennt und dort bindet (Abb. 20.6). Für die Interaktion des TATA-bindenden Proteins mit der RNA-Polymerase sind eine Anzahl weiterer Transkriptionsfaktoren (in der Abbildung als A, B, F, E, H bezeichnet) erforderlich. Diese bilden zusammen die Voraussetzung für den Ablauf der Transkription, man bezeichnet sie daher als Basalfaktoren.

Der Transkriptionsapparat kann als Komplex aus sehr vielen Proteinkomponenten aufgefasst werden, um den sich die DNA in Schleifen herumwickelt. Auf diese Weise können weit stromaufwärts (und auch stromabwärts) gelegene cis-Regulationselemente des Gens eine Wirkung auf die RNA-Polymerase haben. Die Rate der Transkription wird durch Transkriptionsfaktoren, Aktivatoren oder Repressoren bestimmt, die an die stromaufwärts vorhandenen cis-Regulationselemente (Enhancer, Silencer; Abb. 20.3) binden. Diese Bindung kann beispielsweise über die besprochenen Zinkfinger oder Leucin-Zipper erfolgen. Die Aktivatoren interagieren über eine Reihe von Coaktivatoren mit dem TATA-bindenden Protein und modulieren dessen Wirkung auf die RNA-Polymerase. Verschiedene Kombinationen von Aktivatoren und Repressoren bewirken so ein Ein- und Ausschalten der Transkription einzelner Gene. Das in Abbildung 20.6 gezeigte Bild des Transkriptionsapparats stammt aus Untersuchungen am tierischen Organismus. Bisherige Untersuchungen sprechen dafür, dass in Pflanzen die Regulation der Transkription in prinzipiell gleicher Weise erfolgt.
Wie in Kapitel 22 besprochen wird, ist für die pflanzliche Gentechnik die Kenntnis von Promotorsequenzen von großer Bedeutung. Dabei muss man nicht unbedingt die besprochenen Boxen und Regulationselemente im Detail kennen. Für den praktischen Gebrauch kann es ausreichen, wenn man empirisch die stromaufwärts vor dem Strukturgen liegende DNA-Sequenz bestimmt, die die Transkription eines Gens in spezifischer Weise beeinflusst. Bei eukaryontischen Zellen wird oft der gesamte regulatorische Sequenzabschnitt vereinfachend als Promotor bezeichnet. So gibt es zum Beispiel Promotoren, die bewirken, dass ein Gen nur im Blatt und dort speziell in den Mesophyllzellen oder nur in den Schließzellen oder nur in Kartoffelknollen und dort nur in den Speicherzellen transkribiert wird. Die Spezifität der Genexpression erklärt sich dabei jeweils durch die Wirkung zellspezifischer Transkriptionsfaktoren auf die entsprechenden Promotoren.

Für die Bildung der reifen Messenger-RNA ist eine Prozessierung erforderlich
Die Transkription der DNA im Kern durch die RNA-Polymerase II liefert ein Primärtranskript (Prä-mRNA, Abbildung 20.7), das im Kern zur reifen mRNA prozessiert wird.

Noch während der Transkription wird ein GDP-Molekül an die 5'-Phosphat-Gruppe des RNA-Anfangs geknüpft, so dass eine Brücke aus drei Phosphatgruppen gebildet wird (Abb. 20.8).

Außerdem wird das Guanosin und die zweite Ribose (manchmal auch die dritte, im Bild nicht gezeigt) durch S-Adenosylmethionin-abhängige Methyltransferasen methyliert. Dieses modifizierte GTP am Anfang der RNA wird als 5'-Cap (Kappe) bezeichnet. Diese Kappe, mit der nur mRNA, nicht aber rRNA oder tRNA versehen wird, dient als Bindungsstelle bei der Bildung des Initiationskomplexes beim Start der Proteinbiosynthese an den Ribosomen (Abschn. 21.1) und bietet wahrscheinlich auch Schutz gegen den Abbau durch Ribonukleasen.
Zur weiteren Prozessierung der Prä-mRNA müssen die Introns entfernt werden (Spleißen). Die Länge dieser Introns kann sehr unterschiedlich sein. Es wurden Intronsequenzen von 50 bis 10.000 Nukleotiden beschrieben. 4 Intron-Typen werden unterschieden. Bei Introns der Gruppe 1 sind die Exon/Intron Grenzsequenzen hoch konserviert. Die letzten beiden Nukleotide auf dem Exon sind meist AG und die ersten Nukleotide des Introns GU (Abb. 20.9).

Das Intron endet mit AG. Etwa 20 bis 50 Nukleotide stromaufwärts vor dem 3'-Ende des Introns liegt ein sog. Verzweigungsnukleotid mit Adenin als Base, das beim Spleißprozess eine wesentliche Rolle spielt. Bei den anderen Intron-Typen sind die Grenzsequenzen weniger konserviert.
Das Herausschneiden der Introns (Spleißen) erfolgt durch Riboproteinkomplexe, die aus RNA und Proteinen zusammengesetzt sind. Am Spleißvorgang sind fünf verschiedene RNAs mit Kettenlängen zwischen 100 und 190 Basen beteiligt, die als snRNAs (sn = small nuclear) bezeichnet werden. Diese snRNAs bilden zusammen mit Proteinen und der zu spleißenden mRNA, das so genannte Spleißosom. Abbildung 20.10 zeigt den Ablauf des Spleißvorganges. Zunächst bildet die 2'-0H-Gruppe der Ribose des Verzweigungsnukleotids mit dem Phosphatrest des Exon-Intron-Überganges, einen Phosphatester. Dabei wird die Esterbindung zu Exon 1 gelöst. Es folgt nun eine zweite Umesterung: Zwischen der 3'-0H-Gruppe des Exons I und dem 5'Phosphatrest des Exons 2 wird ein Ester gebildet und dabei der Phosphatester zwischen Intron und Exon 2 aufgespalten. Damit sind beide Exons verknüpft und der Spleißvorgang abgeschlossen. Es bleibt das Intron in Form eines Lassos übrig, das später durch Ribonukleasen abgebaut wird.

Als weiterer Schritt der RNA-Prozessierung wird hinter einem Poly(A)-Additionssignal (Abb. 20.11) durch eine Endonuklease das 3'-Ende der Prä-mRNA abgespalten, und an der Spaltstelle wird durch eine Poly(A)-Polymerase eine Poly(A)-Sequenz von bis zu 250 Basen angefügt. Die so fertiggestellte, reife mRNA verlässt gebunden an spezielle Proteine den Zellkern.


rRNA wird durch RNA-Polymerase I und III synthetisiert
Eukaryontische Ribosomen von Pflanzen enthalten vier verschiedene rRNA-Moleküle, die nach ihren Sedimentationskonstanten als 5S-, 5,8S-, 18S- und 25S-rRNAs bezeichnet werden. Die in sehr vielen Kopien vorhandenen Gene für die SS-rRNA sind tandemartig auf bestimmten Abschnitten der Chromosomen angeordnet. Die Ablesung dieser Gene erfolgt durch die RNA-Polymerase III. Die drei restlichen ribosomalen RNAs sind auf einem zusammenhängenden Genomabschnitt codiert, wiederum tandemartig in sehr vielen Kopien. Auf die Ablesung dieser Genomabschnitte ist die RNA-Polymerase 1 spezialisiert. Die Transkription führt zu einem Primärtranskript, das dann nach Methylierung insbesondere an den OH-Gruppen der Ribosereste in die reifen 18S-, 5,8S- und 25S-rRNA prozessiert wird (Abb. 20.12). Die herausgeschnittenen RNA-Abschnitte zwischen den genannten rRNAs werden als intergenetische Spacer bezeichnet. Vergleichende Sequenzanalysen dieser Spacer-Regionen werden für die Ermittlung der phylogenetischen Zuordnung verschiedener Pflanzenarten innerhalb einer Gattung benutzt.


20.3 Der DNA-Polymorphismus liefert genetische Marker für die Pflanzenzüchtung
Ein Organismus ist durch die DNA-Nukleotidsequenz seines Genoms charakterisiert. Unterschiede in den DNA-Sequenzen (DNA-Polymorphismus) bestehen nicht nur zwischen verschiedenen Arten, sondern in einzelnen Bereichen auch zwischen Individuen der gleichen Art. So sind zwischen zwei Sorten einer Kulturpflanze in einem Strukturgen häufig 0,1- 1% der Nukleotide ausgetauscht, wobei dieser Austausch vorwiegend in den Introns zu finden ist.
Die Selektion von Pflanzen für eine Züchtung erfolgt üblicherweise nach äußeren Merkmalen, wie beispielsweise der Ertragsleistung oder der Resistenz gegen bestimmte Schädlinge. Diese Merkmale sind letztlich alle durch Unterschiede der Nukleotidsequenzen in den Strukturgenen bedingt. Es wäre daher bei Züchtungen viel einfacher, wenn für eine Selektion der zu vermehrenden Pflanzen nicht eine Generation abgewartet werden müsste, bis die genannten äußeren Merkmale erkennbar sind, sondern statt dessen die entsprechenden DNA-Sequenzen analysiert würden. Nun ist eine direkte vergleichende Analyse der Gene nicht praktikabel, da zum einen die an der Ausbildung der Merkmale beteiligten Gene nicht alle bekannt sind und zum anderen die geringe Änderung von 0,1 - 1% der Nukleotidsequenzen dieser Gene nur mit sehr großem Aufwand nachweisbar wäre.

Durch Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus lassen sich Individuen der gleichen Art unterscheiden
Aber auch ohne einen detaillierten Sequenzvergleich ist es möglich, Unterschiede in den Genen verschiedener Individuen einer Art sichtbar zu machen und diese empirisch bestimmten äußeren Merkmalen zuzuordnen. Eine Methode hierfür ist die Analyse des Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP). Dabei werden bakterielle Restriktionsendonukleasen eingesetzt, die eine DNA an einer als Restriktionsschnittstelle bezeichneten, oft palindromischen Erkennungssequenz spalten (Abb. 20.11).

Die verschiedenen Restriktionsendonukleasen erkennen jeweils eine spezifische Nukleotidsequenz von 4-8 bp. Da auf jeder DNA diese Restriktionsschnittstellen zufällig vorhanden sind - die mit nur 4 bp sehr viel häufiger als die mit 8 bp -, kann man durch eine bestimmte Restriktionsendonuklease (zumeist verwendet man Enzyme mit Restriktionsstellen von 6 bp) genomische DNA einer Pflanze in definierte DNA-Fragmente spalten. Durch Austausch von nur einem Nukleotid in der DNA, wenn sie in der Erkennungssequenz liegt, können Restriktionsschnittstellen aufgehoben oder neu gebildet werden. Dadurch führt eine geringfügige Änderung der Nukleotidsequenz der DNA zu einem Polymorphismus der Restriktionsfragmentlängen.
Der Restriktionsverdau genomischer DNA führt zu einer unüberschaubar großen Zahl von Spaltfragmenten. Zur Hervorhebung der Fragmente eines bestimmten Genomabschnitts werden markierte DNA-Sonden benötigt. Zur Herstellung einer Sonde wird ein bestimmter DNA-Abschnitt eines Chromosoms von etwa 10- 20kbp, der das Gen des gesuchten Merkmals trägt, durch Plasmide oder Bakteriophagen als Vektor in Bakterien (meist Escherichia coli) eingebaut und dort vermehrt. Aus den Bakterien werden die Plasmide oder Bakteriophagen isoliert und die vermehrten DNA-Stücke wjeder herausgeschnitten, isoliert und anschließend radioaktiv markiert oder auch mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen. Für den RFLP benutzte Sonden werden als RFLP-Marker bezeichnet.
Die Analyse der durch die genannten Sonden markierten DNA-Restriktionsfragmente erfolgt durch den von E. M. Southern 1975 entwickelten Southern Blot (blot, englisch für „Fleck"). Dazu werden die Restriktionsfragmente zunächst durch Elektrophorese in einem Agarose-Gel nach ihrer Länge aufgetrennt (die kürzesten Fragmente wandern am weitesten). Die aufgetrennten DNA-Fragmente aus dem Gel werden dann auf eine Membran aus Nitrocellulose oder Nylon übertragen. Dazu legt man die Membran auf das Gel und saugt durch das Auflegen von Papiertüchern eine Pufferlösung durch das Gel und die Membran, wobei die diffundierenden DNA-Fragmente an der Membran gebunden werden (Abb. 20.14).

Der Puffer bewirkt zudem eine Auftrennung in Einzelstränge (Denaturierung). Nach Zugabe der markierten Sonde wird diese durch Hybridisierung überall dort auf der Membran gebunden, wo sich ein DNA-Fragment befindet, dessen Nukleotidsequenz völlig oder teilweise zu der Nukleotidsequenz der Sonde komplementär ist. Dadurch werden nur die der Sonde zumindest teilweise komplementären DNA-Fragmente markiert, und durch Messung der Radioaktivität (z.B. Auflage auf einen Röntgenfilm), beziehungsweise durch Fluoreszenzmessung nachgewiesen.
Abbildung 20.15 erklärt das Prinzip der Entstehung des RFLP.

Abbildung 20.l5A zeigt in (a) einen Genabschnitt mit drei Restriktionsschnittstellen (R1 R2, R3). Da die Sonde nur an den DNA-Bereich zwischen R1 und R3 bindet, entstehen durch Behandlung mit der Restriktionsendonuklease maximal zwei nachweisbare Restriktionsfragmente, die aufgrund ihrer unterschiedlichen Länge in der Gelelektrophorese auf getrennt werden (Abb. 20.15B, Spur a). Bei dem Austausch eines Nukleotids, einer Punktmutation, wird die Restriktionsschnittstelle R2 aufgehohen, es ist daher nur noch ein markiertes Restriktionsfragment nachweisbar (Spur b), das wegen seiner Größe in der Gelelektropborese weniger weit wandert als die Fragmente von (a). Bei der Insertion eines DNA-Abschnittes zwischen die Restriktionsstellen R2 und R3 (c) hat das entsprechende Fragment eine größere Länge. Die RFLP bilden genetische Marker, die nach den Mendelschen Gesetzen vererbt werden und zur Charakterisierung einer Sorte herangezogen werden können, wobei man in der Regel parallel mit mehreren verschiedenen Sonden arbeitet. Man nutzt die RFLP auch in der pflanzlichen Systematik für die Aufstellung phylogenetischer Stammbäume.
Definierte Restriktionsfragmente lassen sich außerdem als markierte Sonden benutzen, um die Lokalisierung von Genen auf den Chromosomen zu bestimmen. Man hat auf diese Weise Chromosomenkarten von verschiedenen Pflanzen (z.B. Arabidopsis, Kartoffel, Tomate und Mais) erstellt.

Die RAPD-Technik ist eine besonders einfache Methode zur Untersuchung des DNA-Polymorphismus
Eine alternative Methode zur Analyse von Unterschieden der DNA-Sequenzen zwischen verschiedenen Individuen oder Sorten einer Art besteht in der Amplifikation (Vervielfältigung) zufällig erhaltener DNA-Fragmente (random amplified polymorphic DNA, RAPD). Diese Methode, die seit 1990 angewandt wird, ist im Vergleich zur besprochenen RFLP-Technik wesentlich einfacher durchzuführen und hat daher in kurzer Zeit eine große Bedeutung erlangt.
Grundlage für die RAPD-Technik ist die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR), die hier zunächst besprochen werden soll. Diese Methode ermöglicht es, ausgewählte DNA-Fragmente von einer Länge bis zu 2-3 kbp mithilfe einer speziellen DNA-Polymerase sehr wirksam zu amplifizieren. Hierfür sind Oligonukletid-Primer erforderlich, die an eine komplementäre Sequenz der zu vervielfältigenden DNA binden und so den Startpunkt für die Synthese eines DNA-Tochterstranges an der Matrize des DNA-Mutterstranges bilden. Bei der Polymerase-Kettenreaktion sind zwei Primer (A, B) erforderlich, um das zu vermehrende DNA-Stück nach beiden Seiten zu begrenzen. Durch die Auswahl der Primer lassen sich Anfang und Ende des amplifizierten DNA-Stranges definieren. Abbildung 20.16 zeigt das Prinzip der Reaktion.

Als erster Schritt werden durch Erhitzen auf 95°C die DNA-Doppelstränge in Einzelstränge getrennt. Bei einem anschließenden Abkühlen hybridisieren die im Überschuss vorhandenen Primer mit den DNA-Einzelsträngen und ermöglichen so bei einem dritten Schritt bei mittlerer Temperatur eine durch DNA-Polymerase katalysierte Synthese von DNA aus Desoxynukleosidtriphosphaten. Man verwendet hierfür unter anderem eine DNA-Polymerase aus dem in heißen Quellen lebenden, thermophilen Bakterium Thermus aquaticus (Taq-Polymerase), die durch die vorangehende Hitzebehandlung nicht beeinträchtigt wird. Anschließend werden durch erneutes Erhitzen auf 95°C die gebildeten DNA-Doppelstränge aufgetrennt, bei einem anschließenden Abkühlen erfolgt wiederum eine Bindung der Primer und eine erneute DNA-Synthese durch die Taq-Polymerase. Durch fortgesetztes abwechselndes Erhitzen und Abkühlen kann diese Reaktion 30 bis 40 Cyclen lang fortgesetzt werden, wobei sich bei jedem Cyclus die DNA-Menge verdoppelt. Beim ersten Cyclus ist die Länge der neugebildeten DNA nach der einen Seite noch nicht begrenzt. Durch die Bindung des Primers an die komplementäre Basensequenz des neu gebildeten DNA-Stranges entsteht bei erneuter DNA-Synthese ein Produkt, das in seiner Länge durch beide Primer begrenzt ist. Mit zunehmender Zahl der Cyclen werden so DNA-Fragmente von einheitlicher Länge amplifiziert. Da bei der Polymerase-Kettenreaktion die Zahl der gebildeten DNA-Moleküle sich mit der Anzahl der Cyclen exponenziell vermehrt (z.B. nach 25 Cyclen um den Faktor 34 • 106), lassen sich so kleinste DNA-Mengen (im Extremfall ein einziges Molekül) beliebig vermehren.
Bei der oben genannten RAPD-Technik werden für die Polymerase-Kettenreaktion genomische DNA und nur ein Oligonukleotid-Primer, der meistens aus zehn Nukleotiden besteht eingesetzt. Da die Wahrscheinlichkeit, dass eine identische Zehner-Nukleotidsequenz auf der genomischen DNA mehrfach auftritt, gering ist, bindet der Primer nur an wenigen Stellen der genomischen DNA. Eine weitere Beschränkung besteht darin, dass wegen der Eigenschaften der eingesetzten DNA-Polymerasen bei der Amplifikation der Abstand zwischen zwei gebundenen Primern nicht größer als 2-3kbp sein darf. Dadurch werden nur sehr wenige Abschnitte des Genoms durch die Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Eine weitere Auswahl der Fragmente durch eine Sonde ist daher nicht erforderlich. Durch die Amplifikation werden die einzelnen DNA-Fragmente in so großen Mengen produziert, dass sie nach der Auftrennung durch Gelelektrophorese und einer daran anschließenden Anfärbung mit Ethidiumbromid durch Bestrahlung mit UV-Licht als fluoreszierende Banden sichtbar gemacht werden können. Punktmutationen, die die Primer-Bindungsstellen aufheben oder neu erzeugen oder Deletionen beziehungsweise Insertionen, welche die Größe und Menge der PCR-Produkte beeinflussen, verändern das Muster der DNA-Fragmente in analoger Weise wie bei der RFLP-Technik (Abb. 20.15). Durch Änderung der Primer-Sequenzen können sehr leicht unterschiedliche DNA-Fragmente erzeugt werden. Definierte Primer mit zehn Basen sind in tausendfacher Variation im Handel erhältlich. Bei der RAPD-Technik werden Primer so lange variiert, bis zufällig Banden von DNA-Fragmenten erhalten werden, die mit einem bestimmten Merkmal korrelieren. Da die RAPD-Technik weder die Herstellung von Sonden noch einen Southern-Blot erfordert, ist sie mit einem viel geringeren Arbeitsaufwand als die RFLP-Technik verbunden und hat zudem den Vorteil, dass sehr geringe DNA-Mengen, wie man sie zum Beispiel aus dem Embryo einer Pflanze isoliert, für eine Untersuchung bereits ausreichen. Auch wenn die Gene auf den auftretenden Fragmenten in der Regel nicht bekannt sind, lassen sich durch die RAPD-Technik Unterschiede zwischen einzelnen Sorten einer Art reproduzierbar nachweisen. Damit ist auch die RAPD-Technik zu einem wichtigen Hilfsmittel der Züchtungsforschung geworden.

Der Polymorphismus der Mikrosatelliten-DNA wird als genetischer Marker verwendet
In jüngster Zeit haben Mikrosatelliten-DNA (Abschnitt. 20.1) Bedeutung als molekulare Marker zur Identifizierung bestimmter Pflanzenlinien gewonnen. Die Mikrosatelliten-DNAs enthalten eine Sequenz von 1-2, seltener auch 3-6 Basenpaare, die in 10-50 facher Wiederholung an bestimmten Stellen des Genoms - im Intronbereich oder direkt vor oder hinter einem Gen - vorkommen; wobei die Zahl der Wiederholung hochpolymorph ist. Der experimentelle Nachweis erfolgt wiederum durch PCR-Analyse. Der Mikrosatelliten-Polymorphismus wird nicht nur zur Identifizierung menschlicher Individuen, beispielsweise bei Kriminalfällen, sondern auch als genetischer Marker für die Pflanzenzucht herangezogen.

20.4 Springende Gene vagabundieren durch das Genom
Bei Maiskolben treten in manchen Linien häufig einzelne anders gefärbte Körner auf, was darauf hindeutet, dass dort die Pigmentbildung durch Mutationen gestört ist. Auch unter der Nachkommenschaft eines Löwenmäulchens, das normalerweise rote Blüten trägt, findet man gelegentlich mutierte Pflanzen, bei denen in Teilen der Blüte die rote Farbe nicht mehr gebildet wird und die dadurch weiß gestreift sind. Nachkommen dieser "defekten" Zellen können manchmal das rote Pigment wieder synthetisieren, es entstehen so Blüten, in denen neben den weißen Streifen rote Flecken auftreten.
Barbara McClintock (USA) hat dieses Phänomen Ende der vierziger Jahre am Mais mit Methoden der klassischen Genetik untersucht. Sie fand, dass es im Maisgenom bewegliche DNA-Elemente gibt, die in ein Strukturgen springen und dieses dadurch ausschalten können. Das bewegliche Element bleibt dort aber meist nicht auf Dauer, sondern springt früher oder später weiter in ein anderes Gen, wodurch die Funktion des ersten Strukturgens meist wiederhergestellt wird. Für diese wichtigen Erkenntnisse wurde Barbara McClintock 1983 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet. Es zeigte sich, dass diese springenden (transponierbaren) Elemente - die später als Transposons bezeichnet wurden - nicht eine Besonderheit von Pflanzen sind, sondern auch in Bakterien, Pilzen und Tieren auftreten.
Als Beispiel zeigt Abbildung 20.17 die Struktur des Transposons AC (activator) aus Mais.

Es handelt sich um eine doppelsträngige DNA mit 4600 Basenpaaren. Die beiden Enden enthalten jeweils eine 15 bp lange, umgekehrte Sequenzwiederholung (inverted repeat, IRA, IRB). Zwischen diesen flankierenden Sequenzen liegt unter anderem ein Strukturgen, das die Transposase - ein Enzym, welches das Springen des Gens bewirkt - codiert. Dieses Enzym bindet an die flankierenden umgekehrten Sequenzwiederholungen und katalysiert die Übertragung des Transposons an einen anderen Ort und dort die Integration und später auch die Eliminierung. Das Ausschneiden erfolgt jedoch oft ungenau, sodass beim Verlassen des Transposons aus einem Gen eine veränderte Sequenz zurückbleiben kann, dies führt dann zu einer dauerhaften Mutation.
Neben dem Transposon AC hat man im Mais ein defektes Transposon gefunden, das als DS bezeichnet wird. In diesem ist das Strukturgen für die Transposase durch eine Mutation ausgeschaltet. Daher ist das Transposon DS nur dann beweglich, wenn gleichzeitig das Transposon AC vorhanden ist, um die für das Springen des DS erforderliche Transposase zu codieren.
Ein Transposon ist so